Abstract
Den konstruktiva biologi och syntetisk biologi tillvägagångssätt för att skapa artificiellt liv involverar bottom-up montering av biologiska eller icke-biologiska material. Sådana metoder har fått stor uppmärksamhet i forskning på gränsen mellan levande och icke-levande materia och har använts för att konstruera konstgjorda celler under de senaste två decennierna. I synnerhet, har Giant Blåsor (GVS) ofta använts som artificiella cellmembran. I detta dokument beskriver vi framställningen av GVS inkapslande mycket packade mikrosfärer som en modell av celler som innehåller mycket kondense biomolekyler. De GVS framställdes med hjälp av en enkel vatten-i-olja-emulsion centrifugeringsmetoden. Specifikt framställdes en homogenisator användes för att emulgera en vattenlösning innehållande de material som skall inkapslas och en olja innehållande upplösta fosfolipider, och den resulterande emulsionen skiktades försiktigt på ytan av en annan vattenlösning. Den skiktade systemet centrifugerades därefter to generera GVS. Denna kraftfulla metod användes för att inkapsla material, från små molekyler till mikrosfärer.
Introduction
Den konstruktiva, eller syntetisk, biologi tillvägagångssätt är en fascinerande väg för att utforska gränsen mellan levande och icke-levande materia. Eftersom cellen är den minsta enhet som krävs för livet som vi förstår nu det, olika forskare har försökt att konstruera konstgjorda celler från enkla och väl förstått kemikalier så att fenomen som förekommer inom dessa konstgjorda celler kan studeras, med det yttersta målet att belysa livets uppkomst och studera de grundläggande funktionerna av levande celler 1, 2, 3. I synnerhet vesiklar 4, som är sfäriska microcompartments gjorda av amfifila molekyler och kan inkapsla biologiska molekyler såsom proteiner 5, 6 och DNA 7, 8, 9,lass = "xref"> 10, har ofta använts som modeller av biologiska membran.
Vesiklar kan klassificeras som små (definierad som har en diameter av <100 nm), stor (diameter <1 mm), eller jätte (diameter> 1 mm). Jätte vesiklar (GVS) har studerats ingående, eftersom de liknar levande celler i storlek, form och struktur. På grund av storleken av GVS, kan lätt observeras morfologiska förändringar i GV-membran i realtid under ett optiskt mikroskop.
Flera metoder för framställning av GVS har rapporterats 11, inklusive hydrering metoden 12, 13, den frysnings-upptiningsmetoden 14, den electroformation metoden 15, 16, och fluidic metod anordningen 17, 18. Emellertid inkapslande protein och annan MACROMolecules i GVS vid höga koncentrationer med hjälp av dessa metoder är svårt. I synnerhet, är det extremt svårt att inkapsla biologiska material i tillräcklig mängd (20-30 vol%) för att efterlikna det trånga miljön inuti cellerna 19, 20. Att bilda GVS direkt, Weitz och medarbetare etablerat en vatten-i-olja (w / o) -emulsion centrifugeringsmetoden 21, 22. Denna metod har fem viktiga funktioner. Först, eftersom GSV framställda enligt denna metod har låg lamellarity 23, 24, deras membran är så tunna att de kan deformeras lätt. GV-membran deformation inducerad av FtsZ (ett bakteriellt celldelning protein), tubulin och andra makromolekyler har studerats 25, 26, 27, 28, och vi observerade polyhe Dron liknande deformering av GV membran inducerade genom inkapsling av mikrosfärer 29, 30. För det andra, kan membranproteiner införas i vesikulär membran genom denna metod, om än med svårighet 31. Till exempel använde Yomo gruppen denna metod för att studera syntes in vitro och porbildande aktiviteten hos membranproteinet α-hemolysin 32. För det tredje är det möjligt att generera asymmetriska GVS där lipidkomponenterna hos de inre och yttre broschyrer är olika 22. Exempelvis Whittenton et al. genererade asymmetriska GVS med katjoniska lipider i inner broschyr att kapsla in negativt laddade polynukleotider, och med neutrala lipider på den yttre broschyr för att minska toxicitet och icke-specifik cellulärt upptag 33. För det fjärde kan koncentrationen och volymfraktionen av ämnen inne i GVS vara relativt högs = "xref"> 28, 34. För det femte kan flera olika typer av material inkapslas 35. Exempelvis Nishimura et al. inkapslade en in vitro transkription-translationssystem in i GVS och används systemet för att uttrycka grönfluorescerande protein (GFP) inom GVS 36. Dessa fem funktioner gör w / o-emulsion centrifuger en oumbärlig metod för att generera cellliknande GVS.
I tidigare arbete, var GSV genereras genom centrifugering uppsamlas med hjälp av en spruta försedd med en lång 16 G nål av rostfritt stål som innehåller en del av den slutliga vattenlösningen 22. I händerna på oerfarna tekniker, kan detta insamlingsmetod lätt leda till kontaminering av GV med en del av oljan. I denna studie använde vi w / o-emulsionen centrifuge protokoll som utvecklats av Yomo gruppen 23, 37,där utfällda GVS uppsamlas genom ett hål öppnat vid botten av centrifugröret i vilken de är beredda. Vi förberedde GVS inkapslande 1,0 | im mikrosfärer, som är ungefär lika stor som intracellulära organeller. Användningen av mikrosfärer tillät oss att uppskatta deras koncentration genom att beräkna sin volymandel. Fastställande av en metod för framställning av GVS i vilka material är tätt packade är ett viktigt steg för att skapa konstgjorda celler. För att bekräfta nyttan av våra protokoll för olika typer av inre material, visade vi också att GFP och en liten vattenlösligt fluorescerande molekyl (uranine) kan inkapslas i GVS.
Protocol
1. Beredning av GVS av W / O emulsion centrifugeringsmetoden
- Bered en förrådslösning av 1,2-dioleoyl- sn-glycero-3-fosfokolin (DOPC, 25 mM) och en stamlösning av Texas Red 1,2-dihexadecanoyl- sn-glycero-3-fosfoetanolamin, trietylammoniumsalt (Texas Red DHPE, 0,20 mM) i kloroform och lagra förrådslösningar vid -20 ° C.
- Bereda en oljelösning.
- Bilda en lipidfilm på den inre ytan av en 5 ml glasampull genom förångning av en blandning av DOPC stamlösning (51,0 | il, och Texas Red DHPE stamlösning (19,2 | il) under strömmande kvävgas.
- Inkubera filmen under reducerat tryck över natt och sedan lägga till 1,0 ml flytande paraffin (0,86-0,89 g / cm 3) till ampullen. Linda flaskan i aluminiumfolie och inkubera det vid 80 ° CO / N i vila. De slutliga koncentrationerna av DOPC och Texas Red DHPE är 1,3 och 3,8 x 10-3 mM, Respektive, och DOPC: Texas Red DHPE molförhållande 100: 0,3.
- Förbereda den inre vattenhaltiga dispersionen.
- I en 1,5 ml lockförsedda mikrorör, blanda 237,5 | il av en dispersion av 1,0 ^ m icke-fluorescerande mikrosfärer (2,5 vol%) och 12,5 | il av en dispersion av 1,0 | j, m fluorescerande mikrosfärer (2,5 vol%); Detta motsvarar en 95: 5 (volym / volym) förhållande av icke-fluorescerande till fluorescerande mikrosfärer.
- Lägga 64 mg sackaros följt av 125 | il Tris-buffrad lösning (TBS, 1 M) och 875 | il avjoniserat vatten. Den slutliga volymfraktionen av mikrosfärer är 0,5 volym-%, och de slutliga koncentrationerna av Tris-HCl (pH 7,5) och sackaros är 0,1 och 0,15 M, respektive.
- Vortexblanda mikrorör under 30 sekunder och sedan Sonikera den för 10 min.
- Förbereda den yttre vattenlösning.
- Efter framställning av 10 ml av en Tris-buffrad lösning (0,1 M Tris-HCl [pH 7,5], 0,15 M glukose) i samma procedur som inre vattenbaserade medier, placera en ml av lösningen i en 1,5 ml med lock mikrorör. Vortexblanda mikrorör under 30 sekunder och sedan Sonikera den för 10 min.
- Förbereda aw / o-emulsion som innehåller mikrosfärer.
- Blanda 1 ml av oljelösningen (flytande paraffin innehållande DOPC och Texas Red DHPE) med 300 ul av den inre vattenlösning i en 1,5 ml mikrorör.
- Emulgera de två komponenterna i mikroröret genom användning av en mekanisk homogenisator (en omrörare med blad som roterar med hög hastighet) arbetade vid 10000 rpm under 2 min vid rumstemperatur.
- Fälla ut GVS.
- skikt försiktigt 300 ul av w / o-emulsion på den övre ytan av en ml av den yttre vattenlösning vid 4 ° C i en 1,5 ml lockförsedda mikrorör. Chill mikrorörs under 10 min vid 4 ° C.
- Samla GVS.
- Omedelbart efter kylning av mikrorör,centrifugera det vid 18000 x g under 30 minuter. Erhålla de utfällda GVS genom att sticka hål i botten av mikroröret med en tryckstift och uppsamling en liten droppe i en steriliserad 1,5 ml mikrorör.
- Späd den utfällda GV droppen 10-100 gånger genom volym med den yttre vattenlösning om de erhållna GVS erhålls i mängder som är tillräckligt stora för att göra observation svårt.
2. Mikroskopi Observation av GVS
- Förbereda mikroskopi prov.
- Placera en adhesiv inkubationskammare för in situ-polymeraskedjereaktion och hybridisering (kammarstorlek 9 mm x 9 mm x 0,3 mm tjocka) på toppen av ett mikroskop täckglas.
- Med hjälp av en mikropipett för att anbringa 25 pl av den utspädda utfällda GVS på provområdet och omedelbart placera en annan täckglaset (ca 0,15 mm tjock) ovanpå inkubationskammaren.
- Spela differential interferens contrast mikroskopi bilder av GSV.
- Rekord mikroskopiska bilder av de vesiklar med ett mikroskop (10X, 20X och 40X mål) utrustad med en 12V100WHAL-L halogenlampa.
- Genomföra fluorescensmikroskopi observationer.
- Sätt U-FBNA och U-FMCHE fluorescens spegelheter i mikroskopet. Montera enheterna med 470-495 nm och 565-585 nm excitationsfilter, respektive, och med emissionsfilter som överför 510-550 nm och 600-690 nm ljus, respektive.
Representative Results
W / o-emulsion centrifuger metod illustreras fotografiskt och schematiskt i fig 1. Den schematiska bilden i figur 1 tyder på att den viktigaste faktorn för framgången med denna metod är att den specifika vikten hos den inre vattenhaltiga lösningen måste vara större än den för den yttre vattenlösning, så att GVS kommer att falla ut under centrifugering. Dessutom, bildandet av en lipid monoskikt vid w / o-gränssnitt kräver att systemet kylas under 10 minuter efter det att emulsionen skiktas på den yttre vattenlösning. Eftersom GVS form genom överföring av emulsionsdroppar över w / o-gränssnitt, måste de osmotiska trycken i de inre och yttre vattenskikten vara samma. Som ett kontrollexperiment, vi också framställda GVS innehåller några mikrosfärer med hjälp av det förfarande som visas i figur 1 och steg 1,3, med undantag av att den inre vattenlösningen varsom framställts utan mikrosfärer.
Samling av de utfällda GVS efter centrifugering visas i figur 2. Förutom den semitransparent fasen vid själva botten av mikroröret, observerade vi också en vit, grumlig intermediära fasen i den yttre vattenlösningen (figur 2a). Denna mellanliggande fasen var rik på sammansättningar av mikrosfärer och olja, medan bottenfasen innehöll GVS. Därför, efter piercing botten av mikroröret med en tryckstift (figur 2b), samlade vi endast den första droppen (Figur 2c), som innehöll stora mängder GVS. Det är viktigt att se till att inte mer än två droppar samlas; ytterligare droppar kan innehålla sammansättningar av mikrosfärer och lipider, vilket kommer att resultera i en lägre täthet av GVS. Den erhållna vesikulär dispersion innehöll ofta inkapslade material utanför GVS eftersom GSV often bristning under centrifugering. För att erhålla endast GVS, en sorteringsmetod såsom dialys, gelfiltrering, eller fluorescensaktiverad cellsortering bör väljas, beroende på storleken på de inkapslingsmaterial. Om det är nödvändigt för de ändamål för vilka de utfällda GVS ska användas, kan de spädas med den yttre vattenlösning. I vissa fall, den mellanliggande fasen utvidgas till botten av röret, vilket tyder på att eventuella blåsor som bildats hölls samman av oljan.
Vi erhöll differentialinterferensmikroskopiska och fluorescensmikroskopiska bilder på de GVS utan mikrosfärer (figur 3a, 3b) och med mikrosfärer (figur 3c -3 f). I överensstämmelse med tidigare rapporter 23, 37, GSV med låg lamellarity bildades av våra protokoll. Lipider konjugerade med Texas Red DHPE, som avger röda fluoresscens, användes så att vesikelbildning kunde bekräftas direkt genom visualisering av den tunna membranet. Av de 160 GVS som vi erhållna, 55 inkapslade mikrosfärer och 105 var tomma, vilket ger ett förhållande av inkapsling av 34%.
Vi bestämde volymfraktionen (φ, vol%) av mikrosfärer i de GVS medelst följande metod. Eftersom varje GV innehåller dussintals till flera hundra mikrosfärer, räkna alla mikrosfärerna under ett optiskt mikroskop är en utmaning. Därför blandade vi de icke-fluorescerande 1,0 | j, m mikrosfärer med en liten mängd av fluorescerande mikrosfärer, som var manuellt räknades under fluorescensmikroskop. Det totala antalet (N) av inkapslade mikrosfärer beräknades genom att multiplicera antalet (n) manuellt räknade fluorescerande mikrosfärer med 20 (baserat på den ursprungliga 95: 5 [v / v] förhållandet mellan icke-fluorescerande till fluorescerande mikrosfärer). Värdet av66; uppskattades sedan som Nv 100 / V, där V är volymen av mikrosfärerna och V är volymen av den individuella GV. Notera att uppskattningen av N från n ger upphov till räkna fel, och dessa fel måste beaktas vid beräkningen av φ. Värdet på φ uppskattades från N, som direkt beräknats som 20 n, och detta i sin tur resulterade i att sannolikheten för att cp exakt representerar det sanna värdet är <50%. I själva verket, N varierar i viss utsträckning omkring 20 n, så vi måste betrakta det som 20 (n ± i), där i är felet i n. Vi uppskattade jag så att en sannolikhet för n ± jag kunde vara mer än 50% erhållits på grundval av en Poisson-fördelning. Vi uppskattade jag, som i sin tur tillät oss att beräkna 20 (n ± i) och värderingar66; som inkluderade räkna fel för GVS med diametrar på 10 och 15 pm (tabell 1). Enligt detta förfarande, det volymfraktionen av mikrosfärer i GV som visas i figur 3c uppskattas vara 11 ± 3 vol%. Precisionen i den beräknade volymen fraktionen var 10-30%.
Våra resultat visar att vi framgångsrikt inkapslat 1 pm mikrosfärer i GVS på en hög volymandel. Vi kunde också att kapsla in andra material i 100 mol% DOPC GVS använder samma yttre vattenlösning och samma protokoll (Figur 4). Specifikt framställdes GVS innehållande 0,1 | j, m mikrosfärer framställs från en Tris-buffrad lösning innehållande 0,1 M Tris-HCl (pH 7,5), 0,15 M sackaros, och 0,5 vol% fluorescerande mikrosfärer med hjälp av det protokoll som beskrivs av GSV innehållande 1,0-xm mikrosfärer ( Figur 4a). Efter det protokoll som beskrivits Above, DOPC GVS innehållande GFP (0,1 M Tris-HCl [pH 7,5], 0,15 M sackaros, och 100 mikrogram / ml GFP; 4b Figur) och GVS innehållande uranine (0,1 M Tris-HCl [pH 7,5], 0,15 M sackaros, och 30 | iM uranine; Figur 4c) framställdes också.
| n | N | φ (10 um diameter) | φ (15 um diameter) |
| 3 | 60 ± 20 | 6,0 ± 2,0 | 1,8 ± 0,6 |
| 4 | 80 ± 20 | 8,0 ± 2,0 | 2,4 ± 0,6 |
| 5 | 100 ± 20 | 10 ± 2 | 3,0 ± 0,6 |
| 6 | 120 ± 30 | 12 ± 4 | 3,6 ± 1,2 |
| 10 | 200 ± 32 | 20 ± 3 | 5.9 ± 0,9 |
| 20 | 400 ± 45 | 40 ± 5 | 12 ± 2 |
| 30 | 600 ± 55 | - | 18 ± 2 |
| en fel bestämdes som beskrivs i texten; n = antal manuellt räknade mikrosfärer; N = totalt antal inkapslade mikrosfärer. | |||
Tabell 1: Siffror och volymfraktioner (φ, vol%) av mikrosfärer en. en fel bestämdes som beskrivs i texten; n = antal manuellt räknade mikrosfärer; N = totalt antal inkapslade mikrosfärer.
Figur 1: Flödes Ch konst och schematisk avbildning av W / O-emulsion centrifugeringsmetoden. (A) Olje lösning bestående av DOPC och Texas Red DHPE (100: 0,3 molförhållande) i flytande paraffin. (B) Inre vattenhaltig dispersion bestående av sackaros och mikrosfärer i Tris-HCl-buffert. (C) Yttre vattenlösning bestående av glukos i Tris-HCl-buffert. (D) Blandning av 1 ml av oljelösningen och 300 ul av inre vattenhaltig dispersion. (E) Emulgering med en homogenisator (10000 rpm, 2 min). (F) w / o-emulsion. (G) Skiktning av 300 | j, l av emulsionen på 1 ml av den yttre vattenlösning. (H) Utfälld GVS strax efter centrifugering. (I) Schematisk återgivning av principen för w / o-emulsion centrifugeringsmetoden. Den svarta pilen anger riktningen för centrifugalkraften..jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Piercing av mikrorör. (A) Utfälld GVS precis efter centrifugering (även visade i figur 1 tim). Den röda ellipsen anger droppe av utfällda GV dispersion. (B) Piercing av mikrorör med en kartnål. Pelleten innehållande GVS erhölls genom att sticka hål på mikrorör nära botten med en tryckstift och uppsamling droppar från hålet. (C) droppe av utfällda GSV (indikeras av den gula pilen) dispersion utspädd med den yttre vattenlösning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Microscopy bilder GVS. (A) Differential interferenskontrast mikroskopbild av en GV utan mikrosfärer. Diametern på GV var ca 10 | im. Skalstreck = 10 | im. (B) Fluorescensmikroskopi bild av en GV utan mikrosfärer. Den röda fluorescensen som utsänds av Texas Red DHPE. (C) differential interferens kontrast mikroskopi bild av en GV mikrosfärer. (D) fluorescens mikroskopbild av 1,0 um mikrosfärer (YG karboxylat mikrosfärer) inuti en GV. Antalet räknade fluorescerande mikrosfärer (n) var 6. Vi uppskattade felen (i = 2) baserat på Poisson-fördelning. Då uppskattade vi totala antalet inre mikrosfärer (N = 20 (n ± i)) var 120 ± 40. Det beräknades attGV innehöll 1,0 | j, m mikrosfärer vid en volymfraktion (φ = Nv 100 / V) av ungefär 11 ± 3 volym-%, där v är volymen av mikrosfärerna och V är volymen av de GVS. (E) fluorescens mikroskopbild av en GV membran. Den röda fluorescensen som utsänds av Texas Red DHPE. (F) sammanslagna bilden av bilderna i panelerna d och e. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Differential interferenskontrast och fluorescensmikroskopi Bilder GVS med olika inkapslade materialen. Differentialinterferenskontrastmikroskop (överst) och fluorescensmikroskopi (botten) bilder avGVS innehållande (a) 0,1 | j, m mikrosfärer, (b) GFP, och (c) uranine. Skalstrecken = 10 | im. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
De specifika vikterna för den inre vatten dispersionsmediet och den yttre vattenlösningen måste väljas noggrant. För v / o-emulsionen för att fälla in i den yttre vattenlösningen under centrifugeringen, måste den specifika vikten för den inre vatten dispersionsmediet vara större än den för den yttre vattenlösning. Vi försökte förbereda GVS använder inre och yttre lösningar utan socker, men vi fick inga GVS under dessa förhållanden, eftersom den inre vattenlösning inte har tillräckligt med massa för att korsa interferens mellan de två faserna. Om det finns en stor osmotisk tryckskillnad mellan de två lösningarna, GVS som faller ut i den yttre vattenlösningen kan krympa eller bristning. Därför måste det osmotiska trycket inuti och utanför de GVS vara lika. För att åstadkomma detta använde vi sackaros som ett löst ämne i den inre vattenhaltiga dispersionen och glukos som ett löst ämne i den yttre vattenlösning; både socker var vid samma koncentration. både saltss = "xref"> 22 och socker 23, 35, 38 har använts för sådana ändamål, men socker används vanligen eftersom det är mindre giftiga och mer lösligt än salt. Men om för mycket socker tillsättes, kan de GVS komma i kontakt med botten på täckglaset och kollaps. Det finns flera strategier för att undvika detta. En strategi är att reducera den specifika vikten skillnaden mellan de inre och yttre vattenlösningar så att de GVS faller ut under milda betingelser; specifikt kan supernatanten av det utfällda GV dispersionen utbytas med en lösning som är identisk med den inre vattenlösning för att minska risken för vesikulär bristning genom vidhäftning till täckglaset på grund av flytkraft. En annan strategi är att förbelägga båda av täckglas med en tunn lipidfilm 29.
Korrekt beredning och inkubation av emulsionenViktigt. Vi använde flytande paraffin för att framställa oljelösningen. Mineralolja 26, 31, dodekan 21, 33, och skvalan 33, är 39 också ofta används som lösningsoljor. Eftersom dessa material varierar i specifik vikt, viskositet och ytspänning, olika antal vesiklar bildas även när samma centrifugeringsbetingelser används 33. För erhållande av de vesiklar med målgrupp egenskaper, är det viktigt att optimera de specifika vikter och viskositeter hos de inre och yttre vattenlösningar samt centrifugal acceleration.For framställning av oljefasen, måste inkubering ske vid hög temperatur och i en torr miljö såsom en kuvös eller en dehydrator. I denna studie, upphettades vi den flytande paraffin till 80 ° C för att fullständigt upplösa fett molecules.In Dessutom emulsionen börendast framställas efter behov och bör omedelbart utsattes för centrifugering, därför att den är instabil precis efter att det framställs och w / o-dropparna lätt smälta till varandra. Emulsionen kan framställas i stora mängder genom ultraljudsbehandling, virvel eller avlyssning. Dock, med användning av en homogenisator tillåter snabb framställning av stora mängder av emulsionen och lättare emulgering i olja med en hög viskositet. Det är också viktigt att emulsionen vara skiktade på den yttre vattenlösningen försiktigt och snabbt och kyldes därefter vid 4 ° C. Att förkorta tiden mellan emulgering och centrifugering, kan den olje yttre vattenlösning systemet förkyld innan emulsionen skiktas på den, och hela systemet kan därefter centrifugeras immediately.If den vita grumlas snabbare eller långsammare än vanligt, den mekaniska homogenisator måste sköljas noggrant för att ta bort rengöringsmedel. Dessutom, före emulgering, måste oljelösningen, inre vattenlösning, och emulgeringsmedel vara returned till rumstemperatur.
Korrekt centrifugalkraften är också viktigt. Genom centrifugering vid 18.000 x g, kunde vi förbereda GVS med en enda inre material inkapslat i en hög koncentration. När det krävs inkapsling av flera material, är det bättre att reducera centrifugalkraften. Till exempel framställdes en aktinsammansättning systemet inkapslande sju föreningar uppnås med centrifugering vid mindre än 350 x g 35. I sådana fall där centrifugering inte är önskvärt, kan GSV erhållas genom justering av koncentrationen av socker eller genom utfällning av emulsionen under inverkan av sin egen massa 38, 40, 41.
Den metod som rapporteras häri har två stora begränsningar. Den ena är att oljemolekyler (paraffin, i det här fallet) kan löses i GV membran, som har påpekats av Weitz grupp 21. När införingen av ett membranprotein in i GV membranet önskas, måste effekterna av samexisterande olja molekyler på proteinet övervägas. Den andra begränsningen är den variation av volymfraktionen. I denna studie uppskattade vi att halterna av mikrosfärer i GVS varierade från 4 till 30 vol%; halterna inte var identisk med den volymandel av den inre vattenlösning som används för GV beredning. Även om vi skulle kunna inkapsla mikrosfärer i de GVS vid en volymfraktion tillräckligt hög för mikroskopi observation, är denna metod inte lämplig för framställning av GVS med en likformig volymfraktion fördelning. Det har rapporterats att fördelningen av mikrosfärvolymfraktioner förändras under centrifugering 34.
W / o-emulsion centrifugeringsmetoden används ofta för bildandet av GVS innehåller inkapslade material. Dock har några rapporter beskrivit preparation av GVS inkapslande mikroskala material 34, 42. På senare tid har molekylära robotar som innehåller en inkapslad DNA-enhet eller en molekylär enhet byggts 43, 44. GVS med facken är det första valet för dessa typer av applikationer; därför kan tekniker, såsom vårt, som skulle kunna användas för inkapsling av magnetiska mikrosfärer och mikrosfärer med olika ytfunktionalisering förväntas vara användbar 44.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi tackar Tomoko Yamaguchi för att rita den schematiska bilden i figur 1. Denna studie stöddes av Okazaki ORION Project i Okazaki institutet för integrativ Bioscience av theNational institut för naturvetenskap (NINS); av Astrobiology Center Project (inget AB281010.) av NINS; genom en Grant-i-Stöd för vetenskaplig forskning om innovativa områden (Dynamisk beställning av biomolekylära system för att skapa integrerade funktioner) från Japan Society för främjande av Science (JSPS) (ingen 25.102.008.); genom en Grant-i-Stöd för unga forskare (B) (till KK, ingen 15K17850.) från JSPS; andby en Grant-i-Stöd för forskningsverksamheten Start-Up (till YN, nej. 15H06653) från JSPS. Ytterligare stöd kom från ett bidrag från Noguchi Institute, ett bidrag från Kao Stiftelsen för Arts and Sciences, och ett bidrag från Kurita Water and Environment Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS: | |||
| 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375C | Vesicular membrane molecule |
| Texas Red 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, triethylammonium salt (Texas Red DHPE) | Thermo Fisher Scientific | T1395MP | |
| 1 M Tris-HCl (pH 7.5) | Nippon Gene Co. | 318-90225 | Buffer solution |
| D(+)-Glucose | Wako Pure Chemical Industries | 049-31165 | For outer water solution |
| Sucrose | Wako Pure Chemical Industries | 196-00015 | For inner water solution |
| Polybead carboxylate microspheres 1.0 µm | Polysciences | 08226-15 | Nonfluorescent, 2R = 1.0 µm |
| Fluoresbrite YG carboxylate microspheres 1.0 µm | Polysciences | 15702-10 | Fluorescent, 2R = 1.0 µm |
| Fluoresbrite YG carboxylate microspheres 0.10 µm | Polysciences | 16662-10 | Fluorescent, 2R = 0.10 µm |
| Fluorescein sodium salt (uranine) | Sigma Aldrich Japan | F6377-100G | |
| GFP standard (recombinant) | Vector Laboratories | MB-0752 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EQUIPMENT: | |||
| Centrifuge 5427R | Eppendorf | 5409000233 | Centrifuge rotor: FA-45-48-11 |
| Physcotron | Microtec Co. | NS-310EIII | Handy microhomogenizer |
| Generator shaft | Microtec Co. | NS-4 | Homogenizer attachment |
| Frame-Seal incubation chambers for in situ PCR and hybridization | Bio-Rad Laboratories | SLF0201 | Hybridization chamber volume: 25 µL Chamber size: 9 × 9 × 0.3 mm |
| Frame-Seal incubation chambers for in situ PCR and hybridization | Bio-Rad Laboratories | SLF0601 | Hybridization chamber volume: 65 µL Chamber size: 15 × 15 × 0.3 mm |
| Microman E | Gilson | FD10006 | Pipette for viscous liquid. We measured liquid paraffin by using this. |
| Inverted microscope | Olympus Co. | IX73 | |
| Mirror unit | Olympus Co. | U-FBNA | Excitation filter: 470 - 495 nm Emission filter: 510 - 550 nm |
| Mirror unit | Olympus Co. | U-FMCHE | Excitation filter: 565 - 585 nm Emission filter: 600 - 690 nm |
References
- Luisi, P. L. The emergence of life: from chemical origins to synthetic biology. , Cambridge University Press. (2006).
- Luisi, P. L., Stano, P. The minimal cell: the biophysics of cell compartment and the origin of cell. , Springer. (2011).
- Rasmussen, S., et al. Protocells: Bridging nonliving and living matter. , The MIT Press. (2008).
- Luisi, P. L., Walde, P. Giant vesicles: perspectives in supramolecular chemistry. , Wiley-Interscience. (2000).
- Kita, H., et al. Replication of genetic information with self-encoded replicase in liposomes. Chem Bio Chem. 9 (15), 2403-2410 (2008).
- Nomura, S. M., et al. Gene expression within cell-sized lipid vesicles. Chem Bio Chem. 4 (11), 1172-1175 (2003).
- Oberholzer, T., Albrizio, M., Luisi, P. L.
- Shohda, K., et al. Compartment size dependence of performance of polymerase chain reaction inside giant vesicle. Soft Matter. 7 (8), 3750-3753 (2011).
- Kurihara, K., et al. Self-reproduction of supramolecular giant vesicles combined with the amplification of encapsulated DNA. Nat Chem. 3 (10), 775-781 (2011).
- Kurihara, K., et al. A recursive vesicle-based model protocell with a primitive model cell cycle. Nat Comm. 6, 8352 (2015).
- Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant vesicles: preparations and applications. Chem Bio Chem. 11 (7), 848-865 (2010).
- Reeves, J. P., Dowben, R. M. Formation and properties of thin-walled phospholipid Vesicles. J Cell Physiol. 73 (1), 49-60 (1969).
- Needham, D., Evans, E. Structure and mechanical properties of giant lipid (DMPC) vesicle bilayers from 20 °C below to 10 °C above the liquid crystal-crystalline phase transition at 24 °C. Biochemistry. 27 (21), 8261-8269 (1988).
- Oku, N., MacDonald, R. C. Differential effects of alkali metal chlorides on formation of giant liposomes by freezing and thawing and by dialysis. Biochemistry. 22 (4), 855-863 (1983).
- Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Far Disc Chem Soc. 81, 303-311 (1986).
- Dimitrov, D. S., Angelova, M. I. Lipid swelling and liposome formation on solid surfaces in external electric fields. New Trends Coll Sci. 73, 48-56 (1987).
- Funakoshi, K., Suzuki, H., Takeuchi, S. Formation of giant lipid vesicle like compartments from a planar lipid membrane by a pulsed jet flow. J Am Chem Soc. 129 (42), 12608-12609 (2007).
- Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (12), 4697-4702 (2008).
- Ellis, R. J. Macromolecular crowding: obvious but underappreciated. Trends Biochem Sci. 26 (10), 597-604 (2001).
- Ellis, R. J., Minton, A. P. Cell biology: join the crowd. Nature. 425 (6953), 27-28 (2003).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of unilamellar vesicles using an inverted emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
- Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Engineering asymmetric vesicles. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (19), 10718-10721 (2003).
- Nishimura, K., et al. Population analysis of structural properties of giant liposomes by flow cytometry. Langmuir. 25 (18), 10439-10443 (2009).
- Chiba, M., Miyazaki, M., Ishiwata, S. Quantitative analysis of the lamellarity of giant liposomes prepared by the inverted emulsion method. Biophys J. 107 (2), 346-354 (2014).
- Cabré, E. J., et al. Bacterial division proteins FtsZ and ZipA induce vesicle shrinkage and cell membrane invagination. J Biol Chem. 288, 26625-26634 (2013).
- Osawa, M., Erickson, H. P. Liposome division by a simple bacterial division machinery. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (27), 11000-11004 (2013).
- Hayashi, M., et al. Reversible morphological control of tubulin-encapsulating giant liposomes by hydrostatic pressure. Langmuir. 32 (15), 3794-3802 (2016).
- Terasawa, H., Nishimura, K., Suzuki, H., Matsuura, T., Yomo, T. Coupling of the fusion and budding of giant phospholipid vesicles containing macromolecules. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (16), 5942-5947 (2012).
- Natsume, Y., Toyota, T. Asymmetrical polyhedral configuration of giant vesicles induced by orderly array of encapsulated colloidal particles. PLOS ONE. 11 (1), e0146683 (2016).
- Natsume, Y., Toyota, T. Appearance of crystalline pattern for colloidal particles encapsulated in giant vesicles: direct cross-sectional observation of ordered and disordered phases. Trans Mater Res Soc Jpn. 41 (2), 147-149 (2016).
- Noireaux, V., Libchaber, A. A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (51), 17669-17674 (2004).
- Fujii, S., Matsuura, T., Sunami, T., Kazuta, Y., Yomo, T. In vitro evolution of α-hemolysin using a liposome display. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (42), 16796-16801 (2013).
- Whittenton, J., et al. Evaluation of asymmetric liposomal nanoparticles for encapsulation of polynucleotides. Langmuir. 24 (16), 8533-8540 (2008).
- Natsume, Y., Toyota, T. Giant vesicles containing microspheres with high volume fraction prepared by water-in-oil emulsion centrifugation. Chem Lett. 42 (3), 295-297 (2013).
- Pontani, L. L., et al. Reconstitution of an actin cortex inside a liposome. Biophys J. 96 (1), 192-198 (2009).
- Nishimura, K., et al. Cell-free protein synthesis inside giant unilamellar vesicles analyzed by flow cytometry. Langmuir. 28 (22), 8426-8432 (2012).
- Fujii, S., Matsuura, T., Sunami, T., Nishikawa, T., Kazuta, Y., Yomo, T. Liposome display for in vitro selection and evolution of membrane proteins. Nat Protoco. 9 (7), 1578-1591 (2014).
- Hamada, T., et al. Construction of asymmetric cell-sized lipid vesicles from lipid-coated water-in-oil microdroplets. J Phys Chem B. 112 (47), 14678-14681 (2008).
- Levine, R. M., Pearce, T. R., Adil, M., Kokkoli, E. Preparation and characterization of liposome-encapsulated plasmid DNA for gene delivery. Langmuir. 29 (29), 9208-9215 (2013).
- Saito, H., et al. Time-resolved tracking of a minimum gene expression system reconstituted in giant liposomes. ChemBioChem. 10 (10), 1640-1643 (2009).
- Yanagisawa, M., Iwamoto, M., Kato, A., Yoshikawa, K., Oiki, S. Oriented reconstitution of a membrane protein in a giant unilamellar vesicle: experimental verification with the potassium channel KcsA. J Am Chem Soc. 133 (30), 11774-11779 (2011).
- Saito, A. C., Ogura, T., Fujiwara, K., Murata, S., Nomura, S. M. Introducing micrometer-sized artificial objects into live cells: a method for cell-giant unilamellar vesicle electrofusion. PLOS ONE. 9 (9), e106853 (2014).
- Murata, S., Konagaya, A., Kobayashi, S., Saito, H., Hagiya, M. Molecular robotics: a new paradigm for artifacts. New Gener Comput. 31 (1), 27-45 (2013).
- Hagiya, M., Konagaya, A., Kobayashi, S., Saito, H., Murata, S. Molecular robots with sensors and intelligence. Acc Chem Res. 47 (6), 1681-1690 (2014).
