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Biology

Un Protocolo Automatizado Rápido de Fibra Análisis Población en músculo de rata Secciones representativas Uso de la cadena pesada de miosina inmunohistoquímica

Published: March 28, 2017 doi: 10.3791/55441
Automatic Translation
1,3, 2, 1, 1, 1, 1, 1
1CD Laboratory for the Restoration of Extremity Function, Division of Plastic and Reconstructive Surgery, Department of Surgery, Medical University of Vienna, 2Core Facility Imaging, Core Facilities, Medical University Vienna, 3Department of Hand, Plastic and Reconstructive Surgery, Burn Center, BG Trauma Center Ludwigshafen, Plastic and Hand Surgery, University of Heidelberg

Summary

Aquí, se presenta un protocolo para análisis rápido de la fibra muscular, lo que permite mejorar la calidad de la tinción, y la adquisición de ese modo automático y la cuantificación de las poblaciones de fibra utilizando el ImageJ software disponible libremente.

Abstract

La cuantificación de las poblaciones de fibras musculares proporciona una visión más profunda de los efectos de la enfermedad, trauma, y ​​varias otras influencias sobre la composición de músculo esquelético. Varios métodos que requieren mucho tiempo se han utilizado tradicionalmente para estudiar las poblaciones de fibra en muchos campos de la investigación. Sin embargo, recientemente desarrollado métodos inmunohistoquímicos sobre la base de la miosina expresión de la proteína de cadena pesada de proporcionar una alternativa rápida para identificar múltiples tipos de fibra en una sola sección. A continuación, se presenta un protocolo rápido, fiable y reproducible para mejorar la calidad de la tinción, lo que permite la adquisición automática de las secciones transversales integrales y cuantificación automática de las poblaciones de fibra con ImageJ. Para este propósito, los músculos esqueléticos incrustadas se cortan en secciones transversales, teñidas utilizando miosina anticuerpos cadenas pesadas con anticuerpos fluorescentes secundarias y DAPI para la tinción de núcleos de células. secciones transversales enteras se escaneados automáticamente usando un escáner de diapositivas para obtener de alta resolución compuestoimágenes de la muestra completa. análisis de población de fibra se llevan a cabo posteriormente para cuantificar fibras lentas, intermedias y rápidas utilizando una macro automatizado para ImageJ. Hemos demostrado anteriormente que este método puede identificar poblaciones de fibra de forma fiable a un grado de ± 4%. Además, este método reduce la variabilidad inter-usuario y la hora por los análisis significativamente utilizando la plataforma ImageJ de código abierto.

Introduction

Composición del músculo esquelético sufre cambios profundos durante los procesos fisiológicos tales como el envejecimiento 1, 2, ejercicio 3, 4, 5, 6, 7, o procesos fisiopatológicos tales como la enfermedad 8, 9, 10 o trauma 11. Por lo tanto, varios campos de investigación se concentran en los efectos estructurales de estos procesos para entender los cambios funcionales. Uno de los aspectos clave que determinan la función muscular es la composición de las fibras musculares. Las fibras musculares expresan la cadena pesada de proteínas diferentes de miosina (MHC) y de ese modo se clasifican en fibras lentas, intermedio o rápido 7, 12, 13 >, 14, 15, 16, 17. Fisiológicamente, los músculos tienen diferentes composiciones de fibra muscular dependiendo de su función en el cuerpo. Usando la tipificación de la fibra muscular, las poblaciones de fibra se pueden cuantificar para identificar adaptación a procesos fisiológicos o fisiopatológicos 7, 17. Históricamente, una serie de métodos que requieren mucho tiempo se han aplicado a diferenciar entre tipos de fibras musculares. Para este propósito, las fibras musculares se clasifican ya sea por la reactividad de la ATPasa de la miosina a diversos niveles de pH o actividad de la enzima muscular. Como diferentes calidades de fibra no pudieron evaluarse en una sola sección, se requieren múltiples secciones transversales para identificar todas las fibras musculares y permitir la cuantificación 14, 16, 17 manual,= "xref"> 18, 19, 20, 21, 22. En contraste, las publicaciones recientes utilizan inmunohistoquímica (IHC) contra la proteína de la cadena pesada de la miosina para teñir rápidamente múltiples tipos de fibras en un solo secciones transversales. Sobre la base de las ventajas de este procedimiento, ahora se considera el estándar de oro en el análisis de población de las fibras musculares 19, 23, 24. El uso de protocolos de tinción IHC mejoradas, estábamos recientemente capaces de demostrar que la adquisición completamente automática de las secciones transversales de músculo entero y la posterior cuantificación de la fibra muscular automática es factible el uso de la plataforma ImageJ de código abierto. En comparación con la cuantificación manual, nuestro procedimiento proporcionado una disminución significativa en el tiempo (aproximadamente 10% de manual de análisis) requerida por diapositiva mientras que ser una precisión de ± 4% 25

El objetivo general de este método es el de describir una guía rápida, fiable, independiente del usuario a la cuantificación de la fibra muscular automática en músculos de rata enteros usando una plataforma de código abierto. Además, se describen las posibles modificaciones que permitan su uso para otros especímenes tales como ratones o los músculos humanos.

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Protocol

Todos los procedimientos, incluidos los sujetos con animales se realizaron de acuerdo con los principios del cuidado de los animales de laboratorio según lo recomendado por FELASA 26. La aprobación se obtuvo antes del estudio realizado por la junta de revisión institucional de la Universidad de Medicina de Viena y el Ministerio Austriaco de Investigación y Ciencia (BMWF: Bundesministerium fuer Wissenschaft und Forschung, número de referencia: BMWF-66.009 / 0222-WF / II / 3b / 2014).

1. Muscle Harvest

NOTA: una publicación anterior por Meng et al. 27 es disponible que describe la congelación correcta de las muestras musculares en gran detalle.

  1. Obtener músculos enteros o tejido suficiente para adquirir las secciones transversales enteras inmediatamente después de la eutanasia de los animales.
    1. Eliminar todo el músculo de una rata anestesiada o sacrificados. Eliminar todo el tejido conectivo y los tendones que rodean el músculo con pinzas y tijeras. Paranesthesia o la eutanasia, siguen las directrices internacionales de FELASA 28.
  2. Pesar muscular usando una balanza de precisión calibrada. Este paso rápido permite análisis comparativos entre las muestras musculares, especialmente después de los procedimientos de intervención.
  3. Ponga muscular en un recipiente, lleno completamente con compuesto OCT, de acuerdo con el tamaño del músculo con un margen de seguridad de aproximadamente 1 mm a todas las partes (por ejemplo, hecha de papel de aluminio).
  4. Congelar en aproximadamente 2 min enfriada previamente isopentano utilizando nitrógeno líquido. El isopentano debe comenzar a mostrar cristales de color blanco en la parte inferior del recipiente.
    NOTA: Este paso es esencial para la preservación de la arquitectura correcta del músculo y de este modo permite que la tinción correcta y analiza fibra 27.
  5. Guardar las muestras conservadas en OCT durante al menos 24 h a -80 ° C. Las muestras pueden, sin embargo, ser almacenadas a -80 ° C durante varios meses o incluso años, si corre enfría ctly.
  6. Cortar 10 m secciones transversales de la porción media del músculo a -20 ° C usando un cryotome. Si el corte a 10 micras no es factible, aumentar el espesor en pasos de 2 m hasta un máximo de 20 m. Suficientemente afiladas cuchillas de corte son esenciales para este paso.
  7. Aplicar las secciones adhesivas a las diapositivas mediante la aproximación de las diapositivas de las secciones transversales. Las secciones transversales se pegarán de forma automática a los portaobjetos adhesivas. Almacenar los portaobjetos a -20 ° C durante la noche antes de la tinción.

2. La tinción

Nota: Un gran número de anticuerpos contra proteínas de la cadena pesada de miosina están disponibles; sin embargo, los anticuerpos de alta calidad son esenciales para la adquisición y análisis automatizado. Para diluciones y la referencia a anticuerpos, véase la Tabla 1. Para un archivo de hoja de cálculo para calcular las diluciones correctas y ver el número de cantidades de soluciones requeridas, véasesource.jove.com/files/ftp_upload/55441/Calculator_for_muscle_fiber_typing.xlsx">Supplemental archivo 1.

  1. Descongelar y aire secar las secciones de músculo congelado durante 10 min antes de que el procedimiento de tinción.
  2. Lavar los portaobjetos cuidadosamente con solución salina tamponada con fosfato (PBS) + 0,05% Triton X durante 10 minutos y después durante 5 min. Tritón se ha demostrado que mejora significativamente la calidad de tinción. Véase la discusión para más detalles.
  3. Deje secciones aire seco durante 2 min y delinear secciones transversales individuales sobre cada portaobjetos con un bolígrafo hidrófobo (para minimizar la cantidad requerida de anticuerpo) y permitir el secado adicional durante 15 min.
  4. Bloquear todas las diapositivas con PBS + 0,05% de Triton X (PBST) que contenía 10% de suero de cabra durante 1 h a temperatura ambiente.
  5. Diluir todos los anticuerpos primarios (Tabla 1) en un cóctel de PBS + Triton X (PBST) que contenía 10% de suero de cabra al 0,05%. Mezclar suficientemente antes de la aplicación. Triton X es esencial para la igualdad de la tinción de las secciones transversales enteras. Calcularaproximadamente 30 l de cóctel de anticuerpo primario por sección transversal.
  6. Para ver los pasos 2.7-2.13 garantizar una protección suficiente de la luz. luces de la sala se apagaron y bandejas cubiertas de tinción proporcionan una protección adecuada. Además, llenar la bandeja de tinción con el fluido en la parte inferior para proporcionar un ambiente húmedo durante la tinción y evitar el secado.
  7. Aplicar anticuerpo primario (Tabla 1) cócteles a los portaobjetos durante 1 h en una bandeja de tinción húmedo en la temperatura ambiente.
  8. Lavar los portaobjetos con PBS + 0,05% de Triton X durante 10 min y luego con nuevo PBST durante 5 min.
  9. Diluir los anticuerpos secundarios en un cóctel de PBS + 0,05% de Triton X (PBST) + 10% de suero de cabra. Calcula 30 l de cóctel de anticuerpo primario por sección transversal.
  10. Aplicar cóctel de anticuerpos secundarios a los portaobjetos durante 1 h.
  11. Lavar los portaobjetos con PBS + 0,05% de Triton X (PBST) durante 10 min y con el nuevo PBST durante otros 5 min.
  12. Aplicar un kit de tinción nuclear DAPI (preferiblemente lectura de usar soluciones) for 15 min o de acuerdo con las instrucciones del fabricante para teñir los núcleos celulares.
  13. Lavar los portaobjetos brevemente con PBS + 0,05% de Triton X (PBST) durante 1 min. Después, dejar que se desliza brevemente al aire seco.
  14. Aplicar medio de montaje fluorescente y cubreobjetos. Almacenar a 4 ° C protegido de la luz y realizar formación de imágenes de manera óptima dentro de 24-48 h.

3. Microscopía

  1. La carga se desliza dentro de escáner de diapositivas. Un máximo de 12 diapositivas es factible en función del escáner de diapositivas.
  2. Iniciar un nuevo proyecto. Para la vista previa ajustar el canal de DAPI y la lente de 2.5X. Para el análisis detallado utilizar los canales DAPI, GFP, FITC y Cy5 y el objetivo 20X. El enfoque automático se adquiere a lo largo del proyecto en el canal de DAPI.
  3. Utilice los siguientes colores para cada canal: -blue DAPI, FITC: verde, rojo de Texas: rojo, Cy5: amarillo.
  4. Crear vistas previas de cada diapositiva utilizando el canal de DAPI. Para este fin, aplicar el enfoque manual en el primer espécimen y los usen durante la vista previaanálisis para adquirir imágenes de vista previa de cada espécimen.
  5. Esquema de cada sección transversal que debe ser incluido en el proceso de adquisición detallada. No dibujar contornos cerca de los bordes de la muestra, para asegurar el subtítulo de toda el área de interés.
  6. Establecer los tiempos de exposición para cada canal. En la mayoría de los casos, los parámetros de exposición de los diferentes canales son idénticos para todas las secciones transversales.
  7. Ejecutar la adquisición automática de la imagen. Compruebe la adquisición correcta para el primer campo de puntos de vista, para evitar la adquisición incorrecta al principio del proceso automatizado.
  8. Si es necesario, establecer un control remoto a través de reflejo de software de escritorio. Esto permite que el monitoreo remoto del proceso de adquisición de imágenes mediante la duplicación de la pantalla del ordenador del escáner de diapositivas a otro ordenador a través de cualquier red o conexión a Internet. Aunque, no se pueden hacer cambios a la configuración física con respecto a las diapositivas utilizadas, el entorno virtual del software de adquisición de imágenes permite el seguimiento de la tiempos de enfoque o la exposición correcta de las imágenes. Además, el tiempo estimado para la finalización se puede comprobar con regularidad.
  9. Después de la finalización de la adquisición de la imagen, controlar el enfoque automático correcto de todas las imágenes controlando manualmente si la arquitectura de las fibras, las fibras individuales y los diferentes tipos de fibras son distinguibles.
  10. Volver a adquirir centrado incorrectamente áreas de imagen de campos individuales de vista o zonas enteras de interés. Para la readquisición de las áreas individuales, marcar áreas o imágenes a lo largo de todo el proyecto y readquirir las zonas con el enfoque manual. En la mayoría de los casos, un detalle adicional de la imagen en un nivel diferente enfoque conduce a las imágenes enfocadas de forma incorrecta
  11. Para cada sección transversal que debe ser incluido en el análisis final, exportar cada canal (excluyendo DAPI) por separado como archivos JPEG. Nombrar y clasificar los archivos de acuerdo con los canales expuestos en carpetas con el nombre Texas Red, FITC y Cy5.

4. Análisis de fibra automatizada

tienda "> NOTA: La macro se puede obtener de la siguiente página web: https://www.meduniwien.ac.at/hp/bionicreconstruction/macro/

  1. Vista previa de cada imagen usando un software de edición de imágenes convencional antes de los análisis y comprobar si hay suficiente contraste entre las fibras de colores y fondo. Si es necesario, ajustar el contraste y el brillo para aumentar la diferencia, mediante comandos de ajuste de brillo y contraste.
  2. ImageJ abierto o Fiji. Abra la macro utilizando el comando "Plugins - Macros - Editar." Esto muestra el código fuente de las macros y permite la adaptación rápida de los parámetros. Si es necesario, cambie de directorio de carpetas para cada canal en el código fuente de la macro.
    NOTA: Los valores para los análisis de fibras musculares se basan en bíceps de rata y los músculos lumbricales, otras especies o los músculos pueden requerir valores diferentes.
  3. Utilice el comando "Ejecutar" para iniciar la macro. Todas las imágenes de la carpeta ahora se cargan en la macro y cuantificados en un orden consecutivo. Los resultados son shown en una nueva ventana. Este paso puede tomar de segundos a varias horas, dependiendo de la cantidad de ser analizados los datos.
  4. Exportar la ventana de resultados como un archivo de hoja de cálculo. Identificar valores para Cy5 contado positivamente (lento), FITC (intermedio) y fibras de Rojo Texas (FAST) y resumir para el número de fibras total.

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Representative Results

músculo de rata entero secciones transversales se tiñeron rápidamente usando inmunohistoquímica para identificar MHC I, IIA y IIB fibras musculares. El uso de un escáner de portaobjetos de microscopio fluorescente, las secciones transversales enteras fueron entonces adquieren automáticamente para fibra muscular automatizado análisis con ImageJ. El concepto del procedimiento se basa en proporcionar un flujo de trabajo sencillo, fiable y eficiente en el tiempo para la cuantificación de las fibras musculares.

Flujo de trabajo del procedimiento (Figura 1) comienza con la eliminación correcta y la congelación de muestras de músculo, como se describe previamente en un tutorial anterior por Meng et al. 27. Esto es esencial para la calidad de la tinción adecuada. En el siguiente paso, las muestras de músculo se cortan y se tiñeron usando anticuerpos primarios contra la miosina pesada clase proteínas de la cadena I, IIA y IIB y anticuerpos fluorescentes secundarias apropiadas. Para una óptima staining calidad, las concentraciones recomendadas por el fabricante para los anticuerpos secundarios se duplicaron y Triton X utilizados para los cócteles de anticuerpos para proporcionar aún la calidad de la tinción. La tinción de inmunofluorescencia de las fibras musculares es rápido con menor reactividad cruzada y se puede lograr en aproximadamente 5 h para lotes de hasta 26 diapositivas en nuestra configuración. Imágenes resultantes mostraron un alto contraste entre las fibras positivas y tejido circundante y una fuerte distinción entre los diferentes tipos de fibras (figura 2). A continuación, la adquisición de imágenes se realiza utilizando un escáner de diapositivas que permite la exploración automática de las secciones transversales de músculo entero. Aquí, hasta 12 diapositivas se escanean de forma automática, por ejemplo, durante la noche. Por la presente, imágenes visión general de las secciones transversales se crean en gran detalle con una resolución que permite la inspección de la morfología de fibra única (Figura 2).

En el paso final, los canales individuales of cada sección transversal se exportan para la cuantificación de las poblaciones de fibra muscular usando una macro diseñado específicamente para ImageJ. El análisis automático tarda aproximadamente 5-10 min para una sección transversal bíceps de rata que contiene entre 3.000-6.000 fibras, mientras que los análisis manuales tomó aproximadamente 60 min 25. Los análisis automáticos dependen en gran medida de potencia de la estación de trabajo y el tamaño de archivo de computación. Como se indica anteriormente, la macro es capaz de detectar poblaciones de fibras musculares relativas con una precisión de ± 4% en comparación con el análisis manual (Figura 3). recuentos absolutos general son más altos en comparación con manual de análisis, sin embargo, los recuentos relativos permanecieron similares dentro de un rango de ± 4%, como se muestra anteriormente.

Figura 1
Figura 1: Flujo de trabajo del músculo de fibra Protocolo de cuantificación. En primer lugar, las muestras de músculo se obtienen de laanimales y congelado correctamente (ver video JoVE por Meng et al. 27). A continuación, corte musculares secciones transversales y realizar tinción inmune. Adquirir imágenes de secciones transversales teñidas utilizando un escáner de diapositivas de imágenes detalladas enteros secciones transversales. Ejecutar la macro de cuantificación para ImageJ para los análisis de población de la fibra muscular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2: Sección transversal del bíceps rata músculo. Visión general de un bíceps rata sección transversal del músculo manchado: La sección transversal muestra las fibras lentas MHC I en fibras amarillas, intermedios MHC IIA en fibras verdes y rápidas MHC IIB en rojo. Haga clic aquí para conocer el Versi más grandesen esta figura.

figura 3
Figura 3: Muscle fibra analiza los resultados de la rata sección transversal en la Figura 2. Análisis de músculo MHC I, fibras MHC IIA y IIB MHC. Arriba: los recuentos absolutos de las fibras musculares por recuento manual o automática. Medio: partes relativas de las poblaciones de fibras musculares después de la cuantificación manual. Inferior: partes relativas de las poblaciones de fibras musculares después de la cuantificación absoluta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

tabla 1
Tabla 1: La tinción inmunohistoquímica de las Fibras MHC. Descripción de anticuerpos primarios y secundarios incluidos diluciones utilizadas para los sTaiNing procedimiento. (Modificado de Bergmeister et al. 25)

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Discussion

Aquí, demostramos una metodología ampliamente accesible para estudiar y cuantificar las poblaciones de fibras musculares de las secciones transversales de rata mediante inmunohistoquímica de una manera eficiente el tiempo de forma automática. Para la reproducibilidad, se presenta un detallado paso a paso la descripción y modificaciones potenciales para las aplicaciones en otras especies no descritas en este estudio. Además, se discuten las ventajas del procedimiento, los requisitos previos para un funcionamiento óptimo y sus limitaciones.

Actualmente, existe una serie de métodos de tinción para identificar las poblaciones de fibras musculares y un número de métodos han sido descritos para la cuantificación manual o semi-automático de las fibras musculares 17. Sin embargo, no existen protocolos que combinan ambos y describen un método estandarizado para teñir de manera fiable poblaciones de fibras musculares y automáticamente adquirir y cuantificar las fibras musculares, usando libremente disponibles los análisis de software. Sobre la base de las publicaciones anteriores"> 24, 29, que optimizado procedimientos de tinción inmunohistoquímica de la cadena pesada de miosina existente para los análisis automatizados de las poblaciones de fibras en el músculo murino secciones transversales. De este modo, recientemente hemos demostrado que el análisis automatizado de secciones transversales enteras es factible, fiable en comparación con los análisis manual, y más eficiente en el tiempo 27. Además, el método es que reduce el error humano y proporcionando de este modo una comparación objetiva como por ejemplo, entre diferentes grupos de tratamiento independiente del usuario.

Todo el protocolo se basa en proporcionar imágenes detalladas y de alta calidad de las secciones transversales enteras para el proceso de cuantificación automatizada. ImageJ como un software de fuente abierta proporciona una serie de comandos simples pero potentes, que dispuestos en una macro permite la identificación de la fibra muscular. Sin embargo, las diferencias de calidad dentro o entre la sección transversal necesidad de reducir al mínimo para obtener resultados fiables. Tenemos identified algunos pasos críticos que son esenciales para la consecución de la calidad requerida. Esto incluye el uso de anticuerpos primarios óptimos. Del mismo modo, el uso de anticuerpos secundarios apropiados que proporcionan señales fluorescentes distintas era esencial, y se duplicó concentraciones para mejorar la calidad de la señal. Además, se observó una mayor calidad y más aun tinción con el uso de Triton X en los cócteles de anticuerpos. Es importante destacar que esto no se observó con el uso de Tween en su lugar. Las imágenes con calidad de la tinción subóptima fueron ajustadas manualmente para un mejor contraste para permitir la adquisición automática de la imagen. Lo más importante para el proceso de adquisición fue el correcto funcionamiento del sistema de enfoque automático. Para este fin, se utilizó un DAPI-kit para teñir los núcleos celulares de las células satélite, que proporcionan un punto de referencia fiable para el sistema de enfoque automático.

Para el proceso de ImageJ cuantificación, los valores óptimos se determinaron comparando manual para resultados automatizados y consecutivo fino-tuNing de los parámetros 25: Umbral y analizar partículas. Los valores resultantes fueron suficientes para el bíceps y los músculos lumbricales y por lo tanto potencialmente otros músculos de rata. Además, Bloemberg et al. 24 han demostrado que la tinción es aplicable para otras especies tales como los seres humanos o ratones. Por lo tanto, todo el protocolo, teóricamente, puede ser adaptado para el uso en otras especies, pero que, sin embargo, requieren la identificación de los parámetros necesarios. Los comandos relevantes se destacan en el código fuente.

Otras posibles modificaciones del procedimiento incluyen la configuración del escáner de diapositivas. En nuestra configuración, se utilizó un sistema de escáner de diapositivas, con una lente de 2,5 veces para la vista previa y la lente de 20X para la adquisición real. Mientras que cambiar la lente para el proceso de vista preliminar proporcionará ningún beneficio significativo en términos de calidad o velocidad, la adquisición también puede llevarse a cabo usando una lente de 10 veces para aumentar la velocidad (y en contrasequently disminuir la resolución) o en su lugar una lente de 40X para aumentar la resolución y en consecuencia el tiempo de adquisición. Como se muestra en la Figura 2, el aumento de la resolución es más probable no necesario para los músculos de rata pero puede ser considerado para otras especies. Otras modificaciones que son adecuados en esta configuración se tinción para fibras MHC-IIX o laminina para visualizar la matriz extracelular del músculo. Estas modificaciones, sin embargo, requieren el cambio de la configuración de adquisición para dos reflectores adicionales (por ejemplo Cy7) y la modificación de la macro ImageJ para incluir análisis adicionales con los parámetros correctos en el código de script.

Una limitación de esta técnica es que los recuentos de fibras absolutos fueron significativamente mayores en comparación con los recuentos manuales en un análisis previo, aunque recuentos relativos permanecieron similares 25. Esto es muy probablemente el resultado de una separación inadecuada y la cuantificación de este modo repetido de fibras. Este efectoestá más presente en fibras que son inadecuadamente manchada o muestran otros tipos de artefactos. Sin embargo, el número de recuentos de fibras relativas y las poblaciones tanto de fibra permaneció altamente precisa. En comparación con la práctica común de la cuantificación de una sub-parte definida de una sección transversal, por ejemplo 40%, creemos que el análisis de toda la sección transversal por el ImageJ son más precisos, como resultado de la arquitectura de la fibra muscular heterogénea (Figura 2) . Una limitación potencial del procedimiento es el requisito de utilizar escáneres de diapositivas caros para la adquisición automática de toda la sección transversal, que no son generalmente disponibles. Un enfoque alternativo es adquirir solo campo de puntos de vista y cuantificar cada uno individualmente por la macro.

En conclusión, creemos que este protocolo es ampliamente accesible y permite la cuantificación rápida y fiable de músculo entero utilizando secciones transversales de libre disposición software analiza. Por lo tanto, el procedimiento introducidoproporciona una contribución útil a los análisis de la morfología de la fibra muscular.

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Acknowledgments

Este estudio fue apoyado por la Fundación de Investigación Christian Doppler. Nos gustaría dar las gracias a Sabine Rauscher de la Imaging Core Facility de la Universidad de Medicina de Viena, Austria, por el apoyo durante todo el proyecto. Los anticuerpos primarios fueron desarrollados por Schiaffino, S., obtenido a partir del hibridoma Estudios del Desarrollo del Banco, creado por el NICHD del NIH y se mantuvo a la Universidad de Iowa, Departamento de Biología, Iowa City, IA.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
O.C.T compound Tissue-Tek, Sakura, Netherlands For embedding of muscle tissue
Isopentane for adequate freezing of muscle tissue
Superfrost Ultra Plus slides Thermo Scientific, Germany 1014356190 adhesive slides
phosphate buffered saline 
Triton X-100 Thermo Scientific, Germany 85112 Detergent Soluation
Goat serum Thermo Scientific, Germany 50197Z Goat Serum
DAKO Fluorescent Mounting Medium Dako Denmark S3023
Dako pen Dako Denmark S200230-2
TissueFAXSi plus TissueGnostics, Vienna, Austria
Primary antibodies
MHC-I (Cat# BA-F8, RRID: AB_10572253) Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) Supernatant
MHC-IIa (Cat# SC-71, RRID: AB_2147165) Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) Supernatant
MHC-IIb (Cat# BF-F3, RRID: AB_2266724) Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) Supernatant
Secondary antibodies
Alexa Fluor 633 Goat Anti-Mouse IgG2b  Thermo Scientific, Germany A-21146
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG1 (γ1) Thermo Scientific, Germany A-21121
Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse IgM (µ chain) Thermo Scientific, Germany A-21426
NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent Thermo Scientific, Germany R37606

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Biología Celular No. 121 tipo de fibra muscular el análisis automatizado cadena pesada de miosina ImageJ la población de fibra rata
Un Protocolo Automatizado Rápido de Fibra Análisis Población en músculo de rata Secciones representativas Uso de la cadena pesada de miosina inmunohistoquímica
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Bergmeister, K. D., Gröger, M., … More

Bergmeister, K. D., Gröger, M., Aman, M., Willensdorfer, A., Manzano-Szalai, K., Salminger, S., Aszmann, O. C. A Rapid Automated Protocol for Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Cross Sections Using Myosin Heavy Chain Immunohistochemistry. J. Vis. Exp. (121), e55441, doi:10.3791/55441 (2017).

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