Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

En Rapid Automatiserad Protokoll för Muscle Fiber Population Analysis i råttmuskel Cross sektioner med hjälp tunga kedjan från myosin Immunohistokemi

Published: March 28, 2017 doi: 10.3791/55441
Automatic Translation
1,3, 2, 1, 1, 1, 1, 1
1CD Laboratory for the Restoration of Extremity Function, Division of Plastic and Reconstructive Surgery, Department of Surgery, Medical University of Vienna, 2Core Facility Imaging, Core Facilities, Medical University Vienna, 3Department of Hand, Plastic and Reconstructive Surgery, Burn Center, BG Trauma Center Ludwigshafen, Plastic and Hand Surgery, University of Heidelberg

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för snabb muskelfiberanalyser, vilket möjliggör förbättrad färgningskvalitet, och därmed automatisk förvärv och kvantifiering av fiber populationer med hjälp av fritt tillgänglig programvara ImageJ.

Abstract

Kvantifiering av muskelfiber populationer ger en djupare insikt i effekterna av sjukdom, trauma, och olika andra influenser på skelettmuskelsammansättning. Olika tidskrävande metoder har traditionellt använts för att studera fiber populationer i många forskningsområden. Emellertid nyligen utvecklat immunohistokemiska metoder baserade på tunga kedjan från myosin proteinuttryck tillhandahålla ett snabbt alternativ för att identifiera multipla fibertyper i en enda sektion. Här presenterar vi ett snabbt, tillförlitligt och reproducerbart protokoll för förbättrad färgningskvalitet, vilket möjliggör automatisk inhämtning av hela tvärsnitt och automatisk kvantifiering av fiber populationer med ImageJ. För detta ändamål, är inbäddade skelettmuskler skurna i tvärsektioner, färgades med användning av myosin tunga kedjor antikroppar med sekundära fluorescerande antikroppar och DAPI för cellkärnor färgning. Hela tvärsnitt sedan scannas automatiskt med hjälp av en bild scanner för att erhålla hög upplösning sammansattbilder av hela provet. Fiberpopulationsanalyser därefter utföras för att kvantifiera långsamma, mellan- och snabba fibrer med användning av en automatiserad makro för ImageJ. Vi har tidigare visat att denna metod kan identifiera fiberpopulationer tillförlitligt till en grad av ± 4%. Dessutom reducerar denna metod interanvändar variabilitet och tid per analyser signifikant med hjälp av öppen källkod plattform ImageJ.

Introduction

Skelettmuskelkompositionen undergår stora förändringar under fysiologiska processer såsom åldrande 1, 2, motion 3, 4, 5, 6, 7, eller patofysiologiska processer såsom sjukdom 8, 9, 10 eller trauma 11. Därför flera forskningsområden koncentrera sig på de strukturella effekterna av dessa processer förstå funktionella förändringar. En av de viktigaste aspekterna som bestämmer muskelfunktion är sammansättningen av muskelfibrer. Muskelfibrer uttrycka olika myosin tung kedja (MHC) -proteiner och därmed klassificeras i långsamma, mellanliggande, eller snabba fibrerna 7, 12, 13 >, 14, 15, 16, 17. Fysiologiskt, muskler har olika muskelfiberkompositioner beroende på deras funktion i kroppen. Med användning av muskelfibermaskinskrivning, kan fiberpopulationer kvantifieras för att identifiera anpassning till fysiologiska eller patofysiologiska processer 7, 17. Historiskt har ett antal tidskrävande metoder använts för att skilja mellan muskelfibertyper. För detta ändamål, var muskelfibrer klassificeras antingen genom reaktivitet av myosin ATPas vid olika pH-nivåer eller muskelenzymaktivitet. Som olika fiberkvaliteter inte kunnat utvärderas i en enda sektion, har flera tvärsektioner som krävs för att identifiera alla muskelfibrer och medge manuell kvantifiering 14, 16, 17,= "xref"> 18, 19, 20, 21, 22. I kontrast, färska publikationer används immunohistokemi (IHC) mot tunga kedjan från myosin protein till snabbt färga flera fibertyper i en enda tvärsektioner. Baserat på fördelarna med detta förfarande är det nu anses vara den gyllene standarden i muskelfibrer populationsanalys 19, 23, 24. Med användning av förbättrade IHC färgningsprotokollen var vi nyligen kunnat visa att det helautomatiska förvärvet av hela muskel tvärsnitt och efterföljande automatisk muskelfiber kvantifiering är möjlig med användning av öppen källkod plattform ImageJ. Jämfört med manuell kvantifiering, vårt förfarande gav en signifikant minskning av tiden (ungefär 10% av manuell analyser) som krävs per bild samtidigt som den är en noggrannhet på ± 4% 25

Det övergripande målet med denna metod är att beskriva en snabb, tillförlitlig, användaroberoende guide till automatisk muskelfiber kvantifiering i hel råttmuskler med användning av en öppen källkod plattform. Dessutom beskriver vi potentiella modifieringar som skulle tillåta dess användning för andra prover såsom möss eller humana muskler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla förfaranden, inklusive djurförsök genomfördes i enlighet med principerna för försöksdjurs vård som rekommenderas av FELASA 26. Godkännande erhölls före studien av Institutional Review Board av den medicinska universitetet i Wien och det österrikiska ministeriet för forskning och vetenskap (BMWF: Bundesministerium für Wissenschaft und Forschung, referensnummer: BMWF-66,009 / 0222-WF / II / 3b / 2014).

1. Muskel Harvest

OBS: En tidigare publikation av Meng et al. 27 är tillgänglig som beskriver korrekt frysning av muskelprover i detalj.

  1. Erhålla hela muskler eller tillräcklig vävnad för att förvärva hela tvärsnitt omedelbart efter eutanasi av djuren.
    1. Ta hela muskler från en sövd eller avlivas råtta. Ta bort all bindväv och senor som omger muskeln med pincett och sax. För ennesthesia eller dödshjälp, följer internationella riktlinjer FELASA 28.
  2. Väg muskler med hjälp av en kalibrerad precision skala. Denna snabba steg möjliggör jämförande analyser mellan muskelprover, särskilt efter interventionella procedurer.
  3. Sätta muskel i ett kärl, helt fyllda med OCT-förening, i enlighet med storleken av muskeln med en säkerhetsmarginal på ungefär 1 mm till alla sidor (t.ex. gjord av aluminiumfolie).
  4. Frysa den hos cirka 2 minuter i förväg kyld isopentan med hjälp av flytande kväve. Den isopentan måste börja visa vita kristaller i botten av behållaren.
    OBS: Detta steg är väsentligt för att bevara den korrekta arkitekturen i muskler och därigenom medger korrekt färgning och fiberanalyser 27.
  5. Förvara proverna bevaras i OCT under minst 24 h vid -80 ° C. Prover kan emellertid lagras vid -80 ° C under flera månader eller år, om corre ctly kyls.
  6. Skär 10 um tvärgående sektioner från mittdelen av muskeln vid -20 ° C med användning av en cryotome. Om skärning vid 10 | j, m inte är möjlig, öka tjockleken i steg av 2 ^ m upp till maximalt 20 um. Tillräckligt skarpa skärblad är avgörande för detta steg.
  7. Tillämpa avsnitt till klister diabilder genom att approximera bilderna till tvärsnitt. De tvärsnitt automatiskt hålla sig till de självhäftande bilder. Lagra bilderna vid -20 ° C över natten innan färgning.

2. Färgning

OBS: Ett stort antal antikroppar mot myosin tung kedja proteiner är tillgängliga; Men högkvalitativa antikroppar är avgörande för automatiserad förvärv och analyser. För spädningar och hänvisning till antikroppar, se tabell 1. För ett kalkylblad för att beräkna korrekta utspädningar och se hur många som behövs lösningar mängder sesource.jove.com/files/ftp_upload/55441/Calculator_for_muscle_fiber_typing.xlsx">Supplemental Fil 1.

  1. Tina och luft-torka frysta muskel avsnitt för 10 min innan färgningsproceduren.
  2. Tvätta objektglasen försiktigt med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) + 0,05% Triton X för 10 min och därefter under 5 min. Triton har visat sig förbättra färgningskvaliteten avsevärt. Se diskussionen för ytterligare information.
  3. Låta sektionerna lufttorka i 2 min och beskriva enskilda tvärsektioner på varje objektglas med användning av en hydrofob penna (för att minimera erforderlig mängd antikropp) och låt ytterligare torkning för 15 min.
  4. Blockera alla objektglasen med PBS + 0,05% Triton X (PBST) innehållande 10% getserum under 1 h vid rumstemperatur.
  5. Späd alla primära antikroppar (tabell 1) i en cocktail av PBS + 0,05% Triton X (PBST) innehållande 10% getserum. Blanda tillräckligt före applicering. Triton X är viktigt för lika färgning av hela tvärsektioner. Beräknaca 30 mikroliter av primär antikropp cocktail per tvärsnitt.
  6. För steg 2.7-2.13 säkerställa tillräckligt skydd mot ljus. Nedtonade rum ljus och täckta färgnings brickor ge tillräckligt skydd. Dessutom fylla färgning facket med vätska i botten för att ge en fuktig miljö under färgning och förhindra torkning.
  7. Tillämpa primära antikroppen (tabell 1) drinkar att sliderna under 1 h i en fuktig färgning bricka på rumstemperatur.
  8. Tvätta objektglasen med PBS + 0,05% Triton X för 10 min och sedan med ny PBST under 5 min.
  9. Späd sekundära antikroppar i en cocktail av PBS + 0,05% Triton X (PBST) + 10% getserum. Beräkna 30 mikroliter av primär antikropp cocktail per tvärsnitt.
  10. Applicera sekundär antikropp cocktail till bilderna under 1 timme.
  11. Tvätta objektglasen med PBS + 0,05% Triton X (PBST) under 10 min och med ny PBST under ytterligare 5 min.
  12. Tillämpa en DAPI nukleär färgning kit (företrädesvis läsa använda lösningar) for 15 min eller enligt tillverkarens instruktioner för att fläcka cellkärnor.
  13. Tvätta objektglasen hastigt med PBS + 0,05% Triton X (PBST) under 1 min. Efteråt lät diabilder lufttorka en kort stund.
  14. Applicera fluorescerande monteringsmedium och täckglas. Lagra vid 4 ° C i skydd mot ljus och utför avbildning optimalt inom 24-48 timmar.

3. Mikroskopi

  1. Load glider in slide scanner. Maximalt 12 glider är möjligt beroende på bilden scanner.
  2. Starta ett nytt projekt. For preview ställa in DAPI kanalen och 2.5x linsen. För detaljerad analys använder DAPI, GFP, FITC och Cy5 kanaler och 20X mål. Autofokus förvärvas genom hela projektet i DAPI kanalen.
  3. Använd följande färger för varje kanal: DAPI -blå, FITC: grön, Texas Red: rött, Cy5: gul.
  4. Skapa förhandsvisningar av varje objektglas med användning av DAPI-kanalen. För detta ändamål gäller manuell fokusering på det första provet och använder den under hela förhandsvisninganalys för att förvärva förhandsgranska bilder av varje prov.
  5. Disposition varje tvärsnitt som bör ingå för detaljerad förvärvsprocessen. Inte dra skisserar nära kanterna på provet för att säkerställa bildtext av hela området av intresse.
  6. Ställ exponeringstider för varje kanal. I de flesta fall, exponeringsparametrarna för de olika kanalerna är identiska för alla tvärsektioner.
  7. Kör automatisk bildtagning. Kontrollera rätt förvärv för det första fältet av åsikter, för att förhindra felaktiga förvärv tidigt i automatiserad process.
  8. Vid behov etablera fjärrkontroll med hjälp av desktop spegling programvara. Detta gör det möjligt för fjärrövervakning av bildförvärvsprocessen genom att spegla datorskärmen av bilden scanner till en annan dator via någon nätverksanslutning eller internet. Även inga ändringar kan göras i den fysiska installationen om de använda bilderna, den virtuella miljön i bilden förvärvet programvara kan övervaka korrigera fokus eller exponeringstider av bilderna. Dessutom kan den beräknade tiden för färdigställande kontrolleras regelbundet.
  9. Efter slutförandet av bilden förvärvet, styra den korrekta autofokus av alla bilder genom att manuellt styra om fiberarkitektur, individuella fibrer och de olika fibertyper kan särskiljas.
  10. Åter förvärva felaktigt fokuserat bildområden för enstaka synfält eller hela intresseområden. För återförvärv av enskilda områden, markera områden eller bilder genom hela projektet och återförvärva områden med manuell fokusering. I de flesta fall, en extra bild detalj i en annan inriktning nivå leder till felaktigt fokuserade bilderna
  11. För varje tvärsnitt som bör ingå i de slutliga analyserna, exporterar varje kanal (exklusive DAPI) separat som JPEG-filer. Namn och sortera filer enligt de exponerade kanaler i mappar med namnet Texas Red, FITC och Cy5.

4. Automatiserad Fiberanalys

tält "> OBS! makrot kan erhållas från följande webbsida: https://www.meduniwien.ac.at/hp/bionicreconstruction/macro/

  1. Preview varje bild med användning av en konventionell bildbehandlingsprogram innan analyser och kontrollera om tillräcklig kontrast mellan färgade fibrer och bakgrund. Om det behövs, justera kontrast och ljusstyrka för att öka skillnaden, med hjälp av ljusstyrka och kontrast justering kommandon.
  2. Öppna ImageJ eller Fiji. Öppna makrot med kommandot "Plugins - Makron -. Edit" Detta visar makron källkod och ger snabb anpassning av parametrar. Om det behövs, byta mapp katalog för varje kanal i källkoden för makrot.
    OBS: Värden för muskelfiber analyser bygger på råtta biceps och lumbrical muskler, andra arter eller muskler kan kräva olika värden.
  3. Använd "run" kommando för att starta makrot. Alla bilder i mappen är nu laddas in makrot och kvantifieras på ordningsföljd. Resultaten är shown i ett nytt fönster. Detta steg kan ta från några sekunder till flera timmar, beroende på mängden data som analyseras.
  4. Exportera resultatfönstret som ett kalkylark. Identifiera värden för positivt räknades Cy5 (långsam), FITC (intermediär) och Texas Red (snabba) fibrer och sammanfatta för total fibernummer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hel råttmuskel tvärsnitt färgades snabbt med användning av immunhistokemi för att identifiera MHC I, IIA och IIB muskelfibrer. Med användning av ett fluorescensmikroskop bild scanner, var hela tvärsnitt sedan automatiskt förvärvats för automatiserad muskelfiber analyser med ImageJ. Begreppet proceduren är baserad på att ge en enkel, tillförlitlig och tidseffektivt arbetsflöde för kvantifiering av muskelfibrer.

Förfarandet arbetsflöde (figur 1) börjar med korrekt avlägsnande och frysning av muskelprover, såsom tidigare beskrivits i en tidigare läraren av Meng et al. 27. Detta är nödvändigt för adekvat färgning kvalitet. I nästa steg, är muskelprover skars och färgades med användning av primära antikroppar mot myosin tung kedja proteiner klass I, IIA och IIB och lämpliga sekundära fluorescerande antikroppar. För optimal staining kvalitet var tillverkarens rekommenderade koncentrationer för de sekundära antikropparna fördubblats och Triton X används för antikropps cocktails att ge ännu färgning kvalitet. Den immunofluorescerande färgning av muskelfibrer är snabb med mindre korsreaktivitet och kan åstadkommas på cirka 5 timmar för partier av upp till 26 bilder i vår setup. Resulterande bilderna uppvisade hög kontrast mellan positiva fibrer och omgivande vävnad och en stark åtskillnad mellan olika fibertyper (Figur 2). Därefter bildtagning utförs med hjälp av en bild scanner som möjliggör automatisk scanning av hela muskeltvärsnitt. Här är upp till 12 objektglas scannas automatiskt, till exempel, över natten. Härmed, är översiktsbilder av tvärsnitten skapas i hög detalj med en upplösning som medger inspektion av enkelfiber morfologi (Figur 2).

I det slutliga steget, enskilda kanalerna of varje tvärsnitt exporteras för kvantifiering av muskelfiberpopulationer med användning av en speciellt utformad makro för ImageJ. Den automatiska analys tar ungefär 5-10 minuter för ett tvärsnitt råtta biceps innehållande mellan 3,000-6,000 fibrer, medan de manuella analyser tog ca 60 min 25. Automatiska analyser är starkt beroende av datorkraft storlek arbetsstationen och fil. Såsom tidigare visats, är makrot kan upptäcka relativa muskelfiberpopulationer med en noggrannhet av ± 4% jämfört med manuell analys (Figur 3). Totala absoluta antal är högre jämfört med manuell analyser förblev dock liknande inom en ± 4% räckvidd relativa räknas, såsom tidigare visats.

Figur 1
Figur 1: Workflow muskelfiber kvantifiering protokoll. Först, är muskelprover erhålls fråndjur och fryst rätt sätt (se JUPITER video genom Meng et al. 27). sedan klippa muskel tvärsnitt och genomföra immunfärgning. Förvärva bilder av färgade tvärsnitt med hjälp av en bild scanner för detaljerade hela tvärsnitt bilder. Kör kvantifiering makrot för ImageJ för muskelfibrer befolkningen analyser. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2: Rat Biceps Muscle tvärsnitt. Översikt av en målat råtta biceps muskel tvärsnitt: Tvärsnittet visar långsamma MHC I-fibrer i gult, mellanliggande MHC IIA fibrer i gröna och snabba MHC IIB fibrer i rött. Klicka här för att se en större versiom av denna figur.

Figur 3
Figur 3: Muscle Fiber Analyser Resultat av Rat tvärsnitt i Figur 2. Analyser av muskel MHC I, MHC IIA och MHC IIB fibrer. Överst: Absoluta räkningar av muskelfibrer genom manuell eller automatisk räkning. Mitten: Relativa delar av muskelfibrer populationer efter manuell kvantifiering. Botten: Relativa portioner av muskelfibrer populationer efter absolut kvantifiering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

bord 1
Tabell 1: Immunohistokemisk Färgning av MHC Fibers. Beskrivning av primära och sekundära antikroppar inklusive utspädningar som används för slande förfarande. (Modifierad från Bergmeister et al. 25)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Här visar vi en allmänt tillgänglig metod för att studera och automatiskt kvantifiera muskelfiber populationer av råtta tvärsnitt genom immunhistokemi på ett tidseffektivt sätt. För reproducerbarhet, presenterar vi en detaljerad steg för steg beskrivning och potentiella modifieringar för applikationer i andra arter som inte beskrivs i denna studie. Vidare diskuterar vi fördelarna med förfarandet, förutsättningar för optimal funktion och dess begränsningar.

Närvarande, existerar ett antal färgningsmetoder för att identifiera muskelfiberpopulationer och ett antal metoder har beskrivits för manuell eller halvautomatisk kvantifiering av muskelfibrer 17. Det finns emellertid inga protokoll som kombinera både och beskriva ett standardiserat tillvägagångssätt för att tillförlitligt färga muskelfiberpopulationer och automatiskt förvärva och kvantifiera muskelfibrer, med användning av fritt tillgängliga analyser programvara. Baserat på tidigare publikationer"> 24, 29, vi optimerat befintliga tunga kedjan från myosin immunohistokemi färgningsförfaranden för automatiserade analyser av fiberpopulationer i murin muskel tvärsnitt. Därigenom nyligen visade vi att den automatiserade analysen av hela tvärsnitt är genomförbart, pålitlig jämfört med manuell analyser, och mer tidseffektivt 27. Dessutom är metoden användaroberoende vilket minskar mänskliga fel och därigenom tillhandahålla en objektiv jämförelse som till exempel mellan olika behandlingsgrupper.

Hela Protokollet är baserat på att tillhandahålla detaljerade och högkvalitativa bilder av hela tvärsnitt för automatiserad kvantifiering processen. ImageJ som en öppen källkod tillhandahåller ett antal kraftfulla men ändå enkla kommandon, vilka är anordnade i ett makro möjliggör identifiering muskelfiber. Men för att kvalitetsskillnaderna inom eller mellan tvärsnitt behöver minimeras för att uppnå tillförlitliga resultat. Vi har identified några viktiga steg som är nödvändig för att uppnå den kvalitet som krävs. Detta innefattar användning av optimala primära antikroppar. På liknande sätt, var användningen av lämpliga sekundära antikroppar som tillhandahåller distinkta fluorescerande signaler väsentliga, och vi fördubblade koncentrationer för förbättrad signalkvalitet. Dessutom observerade vi en högre och jämnare färgning kvalitet med användning av Triton X i antikropps cocktails. Viktigt Detta observerades inte med användning av Tween i stället. Bilder med suboptimal färgning kvalitet var justeras manuellt för bättre kontrast för att möjliggöra automatisk bildtagning. Viktigast för förvärvsprocessen var rätt funktion av autofokussystemet. För detta ändamål använde vi en DAPI-kit för att färga cellkärnorna av satellitceller, som gav en tillförlitlig landmärke för autofokussystemet.

För ImageJ kvantifiering processen var optimala värden bestäms genom att jämföra manuell till automatiserade resultat och rad fina tuning av parametrarna 25: Tröskel och analysera partiklar. De resulterande värdena var tillräckliga för biceps och lumbrical muskler och därför potentiellt andra råttmuskler. Dessutom Bloemberg et al. 24 har visat att färgningen är tillämplig för andra arter såsom människor eller möss. Därför kan hela protokollet teoretiskt anpassas för användning i andra arter, men skulle dock kräva att identifiera de nödvändiga parametrarna. De relevanta kommandon markeras i källkoden.

Ytterligare möjliga modifieringar av förfarandet inkluderar installationen av glid skannern. I vår inställning, använde vi en bild scanner system med en 2,5 X lins för förhandsgranskningen och 20X objektiv för själva förvärvet. Medan ändra linsen för förhandsgranskning processen kommer att ge någon signifikant fördel när det gäller kvalitet eller hastighet, kan förvärvet också utföras med hjälp av en 10X objektiv för att öka hastigheten (och konaktligen minska upplösning) eller i stället ett 40X objektiv för att öka upplösning och följaktligen uppsamlingstiden. Såsom visas i fig 2, vilket ökar upplösningen är mest sannolikt inte nödvändigt för råttmuskler men kan övervägas för andra arter. Andra modifieringar som är lämpliga i denna installation är färgning för MHC-IIx fibrer eller laminin att visualisera muskelns extracellulära matrisen. Dessa modifieringar, kräver emellertid ändra förvärvet setup för ytterligare två reflektorer (exempelvis Cy7) och modifiering av ImageJ makro att inkludera ytterligare analyser med de korrekta parametrarna till skriptkoden.

En begränsning med denna teknik är att de absoluta fiberantal var signifikant högre jämfört med manuella räknas i en tidigare analys, även om relativa räkningar förblev liknande 25. Detta är mest sannolikt ett resultat av otillräcklig separation och således upprepad kvantifiering av fibrer. denna effektär mer närvarande i fibrer som är otillräckligt färgade eller visar andra typer av artefakter. Förblev dock antalet relativa fiberantal och därmed fiber populationer mycket exakt. I jämförelse med den gängse praxis att kvantifiera en definierad under parti av en tvärsektion, t ex 40%, tror vi att analyser av hela tvärsnittet av ImageJ är mer exakt som ett resultat av fiberarkitektur heterogen muskel (figur 2) . En potentiell begränsning av förfarandet är kravet att använda dyra glida skannrar för automatiserad förvärv av hela tvärsnittet, som inte är allmänt tillgängliga. Ett alternativt tillvägagångssätt är att förvärva enda fält av åsikter och kvantifiera varje individuellt av makrot.

Sammanfattningsvis tror vi detta protokoll är allmänt tillgänglig och gör det möjligt att snabbt och tillförlitligt kvantifiering av hela muskeltvärsnitt med hjälp av fritt tillgängliga analyser programvara. Därför, den införda förfarandeterbjuder ett värdefullt bidrag till de analyser av muskelfiber morfologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Denna studie stöddes av Christian Doppler Research Foundation. Vi vill tacka Sabine Rauscher från Core Facility Imaging vid medicinska universitetet i Wien, Österrike stöd under hela projektet. Primära antikroppar har utvecklats av Schiaffino, S., som erhållits från utvecklingsstudier Hybridoma Bank, skapad av NICHD av NIH och hölls vid University of Iowa, Institutionen för biologi, Iowa City, IA.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
O.C.T compound Tissue-Tek, Sakura, Netherlands For embedding of muscle tissue
Isopentane for adequate freezing of muscle tissue
Superfrost Ultra Plus slides Thermo Scientific, Germany 1014356190 adhesive slides
phosphate buffered saline 
Triton X-100 Thermo Scientific, Germany 85112 Detergent Soluation
Goat serum Thermo Scientific, Germany 50197Z Goat Serum
DAKO Fluorescent Mounting Medium Dako Denmark S3023
Dako pen Dako Denmark S200230-2
TissueFAXSi plus TissueGnostics, Vienna, Austria
Primary antibodies
MHC-I (Cat# BA-F8, RRID: AB_10572253) Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) Supernatant
MHC-IIa (Cat# SC-71, RRID: AB_2147165) Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) Supernatant
MHC-IIb (Cat# BF-F3, RRID: AB_2266724) Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB, Iowa, USA) Supernatant
Secondary antibodies
Alexa Fluor 633 Goat Anti-Mouse IgG2b  Thermo Scientific, Germany A-21146
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG1 (γ1) Thermo Scientific, Germany A-21121
Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse IgM (µ chain) Thermo Scientific, Germany A-21426
NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent Thermo Scientific, Germany R37606

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kung, T. A., et al. Motor Unit Changes Seen With Skeletal Muscle Sarcopenia in Oldest Old Rats. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 69 (6), 657-665 (2014).
  2. Greising, S. M., Medina, J. S., Vasdev, A. K., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Analysis of muscle fiber clustering in the diaphragm muscle of sarcopenic mice. Muscle Nerve. 52 (1), 76-82 (2015).
  3. Claflin, D. R., et al. Effects of high- and low-velocity resistance training on the contractile properties of skeletal muscle fibers from young and older humans. J Appl Physiol. 111 (4), 1021-1030 (2011).
  4. Miller, A. I., Heath, E. M., Dickinson, J. M., Bressel, E. Relationship Between Muscle Fiber Type and Reactive Balance: A Preliminary Study. J Mot Behav. 47 (6), 497-502 (2015).
  5. Song, Y., Forsgren, S., Liu, J. -X., Yu, J. -G., Stål, P. Unilateral Muscle Overuse Causes Bilateral Changes in Muscle Fiber Composition and Vascular Supply. PLoS ONE. 9 (12), 116455 (2014).
  6. Hopker, J. G., et al. The influence of training status, age, and muscle fiber type on cycling efficiency and endurance performance. J Appl Physiol (1985). 115 (5), 723-729 (2013).
  7. Pette, D., Staron, R. S. Myosin isoforms, muscle fiber types, and transitions. Microsc Res Tech. 50 (6), 500-509 (2000).
  8. Suga, T., et al. Muscle fiber type-predominant promoter activity in lentiviral-mediated transgenic mouse. PLoS One. 6 (3), 16908 (2011).
  9. Wang, J. F., Forst, J., Schroder, S., Schroder, J. M. Correlation of muscle fiber type measurements with clinical and molecular genetic data in Duchenne muscular dystrophy. Neuromuscul Disord. 9 (3), 150-158 (1999).
  10. Rader, E. P., et al. Effect of cleft palate repair on the susceptibility to contraction-induced injury of single permeabilized muscle fibers from congenitally-clefted goat palates. Cleft Palate Craniofac J. 45 (2), 113-120 (2008).
  11. Macaluso, F., Isaacs, A. W., Myburgh, K. H. Preferential type II muscle fiber damage from plyometric exercise. J Athl Train. 47 (4), 414-420 (2012).
  12. Lieber, R. L., Fridén, J. Clinical significance of skeletal muscle architecture. Clin. Orthop. Relat. Res. 383, 140-151 (2001).
  13. Schiaffino, S. Fibre types in skeletal muscle: a personal account. Acta Physiol (Oxf). 199 (4), 451-463 (2010).
  14. Bottinelli, R., Betto, R., Schiaffino, S., Reggiani, C. Unloaded shortening velocity and myosin heavy chain and alkali light chain isoform composition in rat skeletal muscle fibres. J Physiol. 478, Pt 2 341-349 (1994).
  15. Schiaffino, S., Reggiani, C. Myosin isoforms in mammalian skeletal muscle. J Appl Physiol (1985). 77 (2), 493-501 (1994).
  16. Larsson, L., Moss, R. L. Maximum velocity of shortening in relation to myosin isoform composition in single fibres from human skeletal muscles. J Physiol. 472, 595-614 (1993).
  17. Kostrominova, T. Y., Reiner, D. S., Haas, R. H., Ingermanson, R., McDonough, P. M. Automated methods for the analysis of skeletal muscle fiber size and metabolic type. Int Rev Cell Mol Biol. 306, 275-332 (2013).
  18. Schiaffino, S., et al. Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres. J Muscle Res Cell Motil. 10 (3), 197-205 (1989).
  19. Lieber, R. L. Skeletal muscle structure, function, and plasticity. , Lippincott Williams & Wilkins. Baltimore, MD. (2009).
  20. Hintz, C. S., Coyle, E. F., Kaiser, K. K., Chi, M. M., Lowry, O. H. Comparison of muscle fiber typing by quantitative enzyme assays and by myosin ATPase staining. J Histochem Cytochem. 32 (6), 655-660 (1984).
  21. Havenith, M. G., Visser, R., van Schendel, J. M. S. chrijvers-, Bosman, F. T. Muscle fiber typing in routinely processed skeletal muscle with monoclonal antibodies. Histochemistry. 93 (5), 497-499 (1990).
  22. Likar, B., Pernuš, F. Registration of serial transverse sections of muscle fibers. Cytometry. 37 (2), 93-106 (1999).
  23. Liu, F., et al. Automated fiber-type-specific cross-sectional area assessment and myonuclei counting in skeletal muscle. J Appl Physiol (1985). 115 (11), 1714-1724 (2013).
  24. Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PLoS One. 7 (4), 35273 (2012).
  25. Bergmeister, K. D., et al. Automated muscle fiber type population analysis with ImageJ of whole rat muscles using rapid myosin heavy chain immunohistochemistry. Muscle Nerve. 54 (2), 292-299 (2016).
  26. Guillen, J. FELASA guidelines and recommendations. J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (3), 311-321 (2012).
  27. Meng, H., et al. Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease. J Vis Exp. (89), e51586 (2014).
  28. Guillen, J. FELASA Guidelines and Recommendations. J Am Assoc Lab Animal Sci. 51 (3), 311-321 (2012).
  29. Ribarič, S., ČebaŠek, V. Simultaneous Visualization of Myosin Heavy Chain Isoforms in Single Muscle Sections. Cells Tissues Organs. 197 (4), 312-321 (2013).

Tags

Cellulär Biology muskelfibertypen automatiserad analys myosin tung kedja ImageJ fiberpopulationen råtta
En Rapid Automatiserad Protokoll för Muscle Fiber Population Analysis i råttmuskel Cross sektioner med hjälp tunga kedjan från myosin Immunohistokemi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bergmeister, K. D., Gröger, M., … More

Bergmeister, K. D., Gröger, M., Aman, M., Willensdorfer, A., Manzano-Szalai, K., Salminger, S., Aszmann, O. C. A Rapid Automated Protocol for Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Cross Sections Using Myosin Heavy Chain Immunohistochemistry. J. Vis. Exp. (121), e55441, doi:10.3791/55441 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter