Tecniche di laboratorio utilizzate per mantenere e differenziare i biotipi di<em> Vibrio cholerae</em> Isolati clinici ed ambientali
Summary
Questo manoscritto descrive le appropriate tecniche di manutenzione Vibrio cholerae oltre ad una serie di dosaggi biochimici, utilizzati collettivamente per una differenziazione rapida e affidabile tra la clinica e l'ambiente V. Biotipi di colera in un ambiente di laboratorio.
Abstract
Il batterio Gram-negativo acquatico Vibrio cholerae è l'agente etiologico del colera della malattia gastrointestinale infettiva. A causa della prevalenza e gravità globali di questa malattia, V. Il colera è stato ampiamente studiato sia in ambito ambientale che in laboratorio, che richiede una corretta manutenzione e tecniche di coltura. Classici e El Tor sono due biotipi principali che compongono il V. Colerae O1, ognuno dei quali presenta caratteristiche uniche genotipiche e fenotipiche che forniscono meccanismi affidabili per la caratterizzazione del biotipo e richiedono condizioni distintive di coltura che inducono la virulenza. Indipendentemente dal biotipo del ceppo causale per qualsiasi infezione o focolaio, il trattamento standard per la malattia comprende terapia di reidratazione integrata con un regime di antibiotici. Tuttavia, la classificazione di biotipo può essere necessaria per studi di laboratorio e può avere impatti più ampi nel campo biomedico.Nei primi anni 2000 sono stati identificati isolati clinici che presentano tratti genotipici e fenotipici sia dai biotipi classici che da El Tor. Gli ibridi di nuova identificazione, chiamati El Tor, hanno causato l'identificazione clinica e ambientale del biotipo di isolamento a diventare più complessi rispetto ai precedenti protocolli tradizionali di identificazione singola. Oltre a descrivere V. Le tecniche di mantenimento e tecniche di coltura del colerae, questo manoscritto descrive una serie di schermati genetici basati su PCR basati su gene ( ctxB e tcpA ) e saggi fenotipici (resistenza alla polimicina B, metabolismo citrato, attività proteolitica, attività emolitica, motilità e metabolismo del glucosio tramite Voges- Proskauer) utilizzati collettivamente per caratterizzare e / o distinguere tra biotipi classici e El Tor. Insieme, questi dosaggi forniscono un approccio sistematico efficiente da utilizzare come alternativa o, in aggiunta, a costosi esercizi di intensità lavorativa nella caratterizzazioneDi V. Cholerae isolati clinici (e ambientali).
Introduction
Il colera è una malattia dell'intestino tenue distale causata dal consumo di alimenti contaminati o di acqua contenente il batterio Gram-negativo acquatico Vibrio cholerae . I sintomi del colera includono vomito e diarrea acquosa incontrollabile, portando ad una grave disidratazione che, se non trattata correttamente, provocherà la morte. V. Il colerae può essere diviso in oltre 200 serogruppi basati sulla struttura del lipopolysaccharide O-antigene della superficie cellulare. Tuttavia, solo 2 serogruppi, O1 e O139, hanno mostrato potenziale epidemico o pandemico 1 , 2 . Inoltre, il serogroup O139 è stato principalmente isolato per l'Asia sud-orientale 3 , 4 , mentre il sierogruppo O1 è distribuito in tutto il mondo. Inoltre, il serogroupo O1 può essere diviso in 2 biotipi principali: classici e El Tor. Il biotipo classico era responsabile delle prime 6 pandemie del coleraTra il 1817 e il 1923. La peggiorata settima pandemia è il risultato del biotipo El Tor, che ha spostato globalmente il biotipo classico nell'ambiente 5 , 6 , 7 . Sono stati recentemente presentati ceppi che contengono caratteristiche distintive di biotipi classici e El Tor 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 e da allora sono stati denominati varianti El Tor 13 , 17 . Alcune varianti di El Tor hanno dimostrato elevate capacità di virulenza con una progressione più rapida e grave della malattia rispetto a quanto precedentemente osservato, sottolineandoLa necessità di un approccio più completo all'identificazione degli agenti e alla prevenzione e trattamento delle malattie 8 , 9 , 18 . Mentre l'identificazione del biotipo non impone immediatamente il trattamento, ulteriori progressi nello sviluppo del vaccino e nei futuri agenti terapeutici possono beneficiare della distinzione tra biotipo.
La prima serie di protocolli elencati qui consentirà agli investigatori di mantenere correttamente V. Ceppi di colera in un ambiente di laboratorio. La coerenza e l'analisi successiva richiedono la preparazione e la crescita degli stock di isolati, che non dipendono dal biotipo. Tuttavia, per indurre in modo ottimale l'espressione genica di virulenza, sono necessarie tecniche indipendenti di coltura biotipo 19 . Inoltre, la preparazione per diversi dosaggi genetici e biochimici è descritta in questo manoscritto.
Tossina del colera (CT) e la tossina co-re(TCP) sono due principali fattori di virulenza controllati dal regolatore master ToxT in entrambi i biotipi del V. Il colerae O1 sierogruppo 20 . CT è una tossina bipartita composta da cinque CtxB Subunità che circondano una singola subunità CtxA ed è responsabile della rapida perdita di elettroliti associata al colera. Il TCP è un pilone di tipo IV codificato dal tcp operon ( tcpABQCRDSTEF ) ed è coinvolto nell'attaccamento e nella colonizzazione dell'intestino tenue distale. TcpA è il primo gene dell'operone tcp che codifica le singole subunità piline essenziali per la costruzione del pilus 8 . La sequenza genica per ctxA è completamente conservata tra biotipi classici e El Tor, mentre ctxB e tcpA si differenziano tra i due biotipi ma sono conservati all'interno di ciascun biotipo 8 . CtxB è completamente conservato tra i biotipi ad eccezione di due posi base(115 e 203). Nel biotipo El Tor, la timina risiede nelle posizioni base 115 e 203, mentre il biotipo classico contiene citosina a queste basi. TcpA è completamente conservato all'interno di ogni biotipo, ma differisce da molteplici basi tra biotipi. Queste distinzioni genetiche servono come marcatori di identificazione biotipo primari, e dopo la sequenza del prodotto di amplificazione della reazione di polimerasi (PCR), inclusi questi siti, le sequenze di isolamento possono essere confrontate con il classico O395 o WT El Tor N16961 di tipo wild (WT) per determinare lo sfondo del biotipo Di CT e TCP rispettivamente, in un dato isolamento di V. cholerae .
Numerosi protocolli sono stati sviluppati per caratterizzare le distinzioni fenotipiche tra i biotipi classici e El Tor 21 , 22 , 23 . Polimicina B è un antibiotico peptidico che compromette l'integrità della membrana cellulare esterna in bacTeria e la resistenza alla polimicina B possono essere visualizzati attraverso il saggio di resistenza della polimigina B 21 . Il citrato è un substrato primario del ciclo di Kreb, e la capacità di metabolizzare il citrato come fonte di carbonio unica può essere determinata usando il saggio del metabolismo citrato 22 . HapR codifica un regolatore globale e il regolatore di sensori quorum master in V. cholerae, HapR, che si lega a varie regioni del promotore e regola l'espressione del gene e dell'operone 24 . Alcuni ceppi patogeni di V. cholerae hanno una mutazione in movimento naturale nel gene hapR che ha causato la perdita di questa regolazione dipendente dalla densità dell'espressione genetica di virulenza 24 , 25 . La misurazione dell'attività di proteasi regolata da HapR utilizzando il supporto agarico del latte permette al ricercatore di identificare se un particolare isolato contiene un HapR 23 funzionale. IlI test di hemolysis per una capacità del ceppo di secernere enzimi emolitici che lissano i globuli rossi; Il grado di emolisi può essere visualizzato sulle piastre di agar sangue 23 . La motilità è spesso associata alla virulenza di V. cholerae e può essere analizzata usando le piastre agarico agar 23 . Il test Voges-Proskauer esamina la capacità di uno strain di fermentare il glucosio come una sola fonte di carbonio e produrre l'acetoina sottoprodotto 21 . Con l'emergere di varianti di El Tor, è difficile prevedere i risultati di un determinato dosaggio fenotipico senza estesa screening genotipica e prima di dedurre lo sfondo biotipo di V. Isolati di colerae, si raccomanda di eseguire questo insieme di dosaggi 23 e confrontare i risultati con i ceppi di riferimento come nella tabella 2 .
In questo contesto, abbiamo avanzato una serie di protocolli, utilizzando collettivamente l'aforemeI test genotipici e fenotipici per un approccio più completo alla caratterizzazione di V. Biotipi di colera. Inoltre, abbiamo descritto le distinzioni genotipiche e fenotipiche del V noto. Varianti del colerae El Tor (MQ1795 e BAA-2163), rispetto ai ceppi di riferimento di biotipo comunemente usati (WT classico O395, WT El Tor C6706 e WT El Tor N16961, Tabella 1 ). L'emergere di varianti El Tor ha presentato sfide all'affidabilità dei protocolli di individuazione biotipo di singolo dosaggio precedentemente impiegati; Tuttavia, questo sistema di identificazione multipla consentirà una caratterizzazione più affidabile dei criteri clinici e ambientali. Isolati di colera .
Protocol
Representative Results
Discussion
Dei oltre 200 identificati V. Colerae, solo O1 e O139 hanno un potenziale epidemico. Il serogroup di O1 può essere suddiviso in due biotipi: classici e El Tor. Tuttavia, sono emersi i ceppi ibridi, denominati varianti El Tor 13 , 17 , che possiedono il background Biotipo El Tor e le caratteristiche classiche del porto 8 , 9 , 10 , …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ricerca sostenuta da New Hampshire-INBRE attraverso un Premio di Sviluppo Istituzionale (IDeA), P20GM103506, presso l'Istituto Nazionale delle Scienze Mediche Generali del NIH.
Materials
| 1 kb DNA Ladder | New England Biolabs | N3232S | https://www.neb.com/products/n3232-1-kb-dna-ladder |
| 60% Glycerol | Calbiochem | 356352 | http://www.emdmillipore.com/US/en/product/Glycerol%2C-Molecular-Biology-Grade—CAS-56-81-5—Calbiochem,EMD_BIO-356352 |
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| Agar with brain-heart infusion | Becto, Dickinson and Co. | 237500 | http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=237500&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D237500%26typeOfSearch%3DproductSearch |
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| Gentra Puregene Yeast/Bact. Kit | Qiagen | 158567 | https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/dna/dna-preparation/gentra-puregene-yeastbact-kit/#orderinginformation |
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| NanoDrop Lite Spectrophtometer | Thermo Scientific | ND-LITE-PR | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/ND-LITE-PR?ICID=search-ND-LITE-PR |
| Nonfat dry milk | Nestle Carnation | N/A | N/A |
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| α-napthol | MP Biomedicals | 204189 | http://www.mpbio.com/product.php?pid=05204189 |
Riferimenti
- Shimada, T., et al. Extended serotyping scheme for Vibrio cholerae. Curr. Microbiol. 28 (3), 175-178 (1994).
- Yamai, S., Tadayuki, O., Toshio, S., Yasuji, K. Distribution of serogroups of Vibrio cholerae non-O1 non-O139 with specific reference to their ability to produce cholera toxin, and addition of novel serogroups. Jpn. J. Infect. Dis. 71 (10), 1037-1045 (1997).
- Karaolis, D. K., Lan, R., Reeves, P. R. The sixth and seventh cholera pandemics are due to independent clones separately derived from environmental, nontoxigenic, non-O1 Vibrio cholerae. J. Bacteriol. 177 (11), 3191-3198 (1995).
- Albert, M. J., et al. Large epidemic of cholera-like disease in Bangladesh caused by Vibrio cholerae O139 synonym Bengal. Lancet. 342 (8868), 387 (1993).
- Barua, D., Barua, D., Greenough III, W. B. History of Cholera. Cholera. , 1-36 (1992).
- Morales, R., Delgado, G., Cravioto, A., Faruque, S. M., Nair, G. B. Population Genetics of Vibrio cholerae. Vibrio cholerae-Genomics and Molecular Biology. , 29-47 (2008).
- Samadi, A. R., Chowdhury, M. K., Huq, M. K., Khan, M. U. Seasonality of classical and El Tor cholera in Dhaka, Bangladesh: 17-year trends. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 77 (6), 853-856 (1983).
- Son, M. S., Megli, C. J., Kovacikova, G., Qadri, F., Taylor, R. K. Characterization of Vibrio cholerae O1 El Tor biotype variant clinical isolates from Bangladesh and Haiti, including a molecular genetic analysis of virulence genes. J. Clin. Microbiol. 49 (11), 3739-3749 (2011).
- Ghosh-Banerjee, J., et al. Cholera toxin production by the El Tor variant of Vibrio cholerae O1 compared to prototype El Tor and classical biotypes. J. Clin. Microbiol. 48 (11), 4283-4286 (2010).
- Ansaruzzaman, M., et al. Cholera in Mozambique, variant of Vibrio cholerae. Emerg. Infect. Dis. 10 (11), 2057-2059 (2004).
- Ansaruzzaman, M., et al. Genetic diversity of El Tor strains of Vibrio cholerae O1 with hybrid traits isolated from Bangladesh and Mozambique. Int. J. Med. Microbiol. 297 (6), 443-449 (2007).
- Lan, R., Reeves, P. R. Pandemic spread of cholera: genetic diversity and relationships within the seventh pandemic clone of Vibrio cholerae determined by amplified fragment length polymorphism. J. Clin. Microbiol. 40 (1), 172-181 (2002).
- Nair, G. B., Faruque, S. M., Bhuiyan, N. A., Kamruzzaman, M., Siddique, A. K., Sack, D. A. New variants of Vibrio cholerae O1 biotype El Tor with attributes of the classical biotype from hospitalized patients with acute diarrhea in Bangladesh. J. Clin. Microbiol. 40 (9), 3296-3299 (2002).
- Nair, G. B., et al. Isolation of Vibrio cholerae O1 strains similar to pre-seventh pandemic El Tor strains during an outbreak of gastrointestinal disease in an island resort in Fiji. J. Med. Microbiol. 55 (11), 1559-1562 (2006).
- Nair, G. B., Mukhopadhyay, A. K., Safa, A., Takeda, Y., Faruque, S. M., Nair, G. B. Emerging hybrid variants of Vibrio cholerae O1. Vibrio cholerae—Genomics and Molecular Biology. , 179-190 (2008).
- Safa, A., et al. Genetic characteristics of Matlab variants of Vibrio cholerae O1 that are hybrids between classical and El Tor biotypes. J. Med. Microbiol. 55 (11), 1563-1569 (2006).
- Nusrin, S., et al. Diverse CTX phages among toxigenic Vibrio cholerae O1 and O139 strains isolated between 1994 and 2002 in an area where cholera is endemic. J. Clin. Microbiol. 42 (12), 5854-5856 (2004).
- Carignan, B. M., Brumfield, K. D., Son, M. S. Single nucleotide polymorphisms in regulator-encoding genes have an additive effect on virulence gene expression in a Vibrio cholerae clinical isolate. mSphere. 1 (5), e00253 (2016).
- Iwanaga, M., Yamamoto, K., Higa, N., Ichinose, Y., Nakasone, N., Tanabe, M. Culture conditions for stimulating cholera toxin production by Vibrio cholerae O1 El Tor. Microbiol. Immunol. 30 (11), 1075-1083 (1986).
- DiRita, V. J., Claude, P., Georg, J., Mekalanos, J. J. Regulatory cascade controls virulence in Vibrio cholerae. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88 (12), 5403-5407 (1991).
- Kovacikova, G., Lin, W., Skorupski, K. Duel regulation of genes involved in acetoin biosynthesis and motility/biofilm formation by the virulence activator AphA and the acetate-responsive Lys-R type regulator AlsR in Vibrio cholerae. Mol. Microbiol. 57 (2), 420-433 (2005).
- Vogel, H. J., Bonner, D. M. Acetylornithinase of Escherechia coli: partial purification and some properties. J. Biol. Chem. 218 (1), 97-106 (1956).
- Son, M. S., Taylor, R. K. Genetic screens and biochemical assays to characterize Vibrio cholerae O1 biotypes: classical and El Tor. Curr. Protoc. Microbiol. , 6A.2.1-6A.2.17 (2011).
- Kovacikova, G., Skorupski, K. Regulation of virulence gene expression in Vibrio cholerae by quorum sensing: HapR functions at the aphA promoter. Mol. Microbiol. 46 (4), 1135-1147 (2002).
- Wang, Y., et al. The prevalence of functional quorum-sensing systems in recently emerged Vibrio cholerae toxigenic strains. Environ. Microbiol. Rep. 3 (2), 218-222 (2011).
- Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques. J. Vis. Exp. (63), e3064 (2012).
- Martinez, R. M., Megli, C. J., Taylor, R. K. Growth and laboratory maintenance of Vibrio cholerae. Curr. Protoc. , 6A.1.1-6A.1.6 (2010).
