생물학적 유형을 유지하고 차별화하기 위해 사용되는 실험실 기술<em> 콜레라 비브리오</em> 임상 적 및 환경 적 분리 물
Summary
이 원고는 일련의 생화학 분석법 외에도 적절한 Vibrio cholerae 유지 기술을 설명하며, 임상 적 및 환경 적 V 사이의 신속하고 안정적인 차별화를 위해 집합 적으로 활용됩니다. 실험실 환경에서 cholerae biotypes.
Abstract
수중 그람 음성 박테리아 Vibrio cholerae 는 감염성 위장병 콜레라의 원인균입니다. 이 질병의 세계적 유병률과 중증도 때문에 V. cholerae 는 환경 및 실험실 환경에서 광범위하게 연구되어 왔으며 적절한 유지 관리 및 배양 기술이 필요합니다. Classical과 El Tor는 V 를 구성하는 두 가지 주요 biotypes입니다. cholerae O1 serogroup은 각각 고유 한 genotypic과 phenotypic 특성을 나타내어 생물 종 특성 결정을위한 신뢰할 수있는 메커니즘을 제공하고 배양 조건을 유도하는 독성을 필요로한다. 주어진 감염 또는 발병에 대한 원인 균주의 생물 유형에 관계없이, 질병의 표준 치료에는 항생제 처방으로 보충 된 수분 요법이 포함됩니다. 그러나 생물학적 분류는 실험실 연구에 필요할 수 있으며 생물 의학 분야에서 더 광범위한 영향을 미칠 수 있습니다.2000 년대 초반에는 임상 적으로 분리 된 균주가 확인되었는데, 이는 고전 및 엘 토 바이오 타입의 유전형 및 표현형 특성을 나타냅니다. 엘 토르 (El Tor) 변종으로 불리는 새롭게 확인 된 잡종 (hybrid)은 임상 적 및 환경 적으로 격리 된 생물 종 식별을 이전의 전통적인 단일 분석 식별 프로토콜보다 더 복잡하게 만들었다. V 를 기술하는 것 외에. (copyyyin B 저항성, 구연산 대사, 단백 분해 활성, 용혈 활성, 운동성 및 포도당 대사)에 대한 일련의 유전자 특이 적 ( ctxB 및 tcpA ) PCR 기반 유전자 스크린과 표현형 분석을 기술하고있다. Proskauer assay)은 고전적 및 엘 토르 생물 유형을 특성화 및 / 또는 구별하기 위해 집합 적으로 사용되었습니다. 함께,이 assays는 대안으로, 또는 추가로, characteriza에 비용이 많이 드는, 노동 집약적 인 실험에 사용되는 효율적인 체계적인 접근 방식을 제공합니다V의 변화 . cholerae 임상 (및 환경) 균주.
Introduction
콜레라 (Cholera)는 오염 된 음식물이나 수생 그람 음성 박테리아 인 비브리오 콜레라 (Vibrio cholerae)를 함유 한 물의 섭취로 말초 소장의 질병입니다. 콜레라의 증상으로는 구토와 통제 할 수없는 수분 설사가 있으며 심한 탈수증을 유발합니다. 제대로 치료하지 않으면 사망에 이릅니다. V. 콜레라 는 세포 표면 리포 폴리 사카 라이드 O- 항원의 구조에 따라 200 개 이상의 혈청군으로 나눌 수 있습니다. 그러나 O1과 O139의 2 가지 혈청군 만이 전염병 또는 유행성 잠재력 1 , 2을 나타냈다. 또한, 혈청 그룹 O13은 주로 동남 아시아 3 , 4에 격리되어 있으며 혈청 그룹 O1은 전 세계적으로 분포되어있다. 또한, O1 혈청 그룹은 2 가지 주요 바이오 타입으로 분류 될 수있다 : 클래식 및 엘 토르. 고전적인 생물 종은 콜레라 전염병 유행병진행중인 일곱 번째 전염병은 엘 토르 (El Tor) 바이오 타입의 결과로 환경에서 5 , 6 , 7 의 고전적 바이오 타입을 전 세계적으로 대체하고있다. 최근에는 클래식 및 엘 토 바이오 타입 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 의 특징을 지닌 균주가 생겨 났으며 , 이후 엘 토르 변종 13 , 17 이라고 명명되었습니다. 일부 엘 토르 (El Tor) 변종은 이전에 관찰 된 것보다 더 빠르고 심각한 질병 진행으로 상승 된 병독성 능력을 입증했으며,에이전트 식별 및 질병 예방 및 치료에 대한보다 포괄적 인 접근 방법의 필요성 8 , 9 , 18 . 생물 종 동정은 치료를 즉시 지시하지는 않지만 백신 개발 및 향후 치료제의 발전은 생물 형별의 이점을 얻을 수 있습니다.
여기에 열거 된 첫 번째 일련의 프로토콜은 조사자가 V 를 적절히 유지할 수있게합니다. cholerae 실험실 환경에서의 변종. 일관성 및 후속 분석을 위해서는 생물학적 특성에 의존하지 않는 균주의 재배 및 성장이 필요합니다. 그러나, 독성 유전자 발현을 최적으로 유도하기 위해서는 독립적 인 생물 종 특이 적 배양 기술이 필요합니다 19 . 또한, 다양한 유전 및 생화학 분석을위한 준비가이 원고에 설명되어 있습니다.
콜레라 독소 (CT)와 독소가 다시 반응합니다.gulated pilus (TCP)는 V 의 두 가지 생물 유형 모두에서 마스터 조절 자 ToxT에 의해 제어되는 두 가지 주요 독성 인자이다. cholerae O1 혈청 군 20 . CT는 5 개의 CtxB로 구성된 bipartite 독소입니다. 단일 CtxA 서브 유닛을 둘러싸고있는 서브 유닛이며 콜레라와 관련된 급속한 전해질 손실을 일으킨다. TCP는 tcp 오페론 ( tcpABQCRDSTEF )에 의해 암호화 된 유형 IV 파일로 말초 소장의 부착과 집락에 관여합니다. tcpA 는 필라 스 8 구축에 필수적인 개별 필린 서브 유닛을 암호화하는 tcp 오페론의 첫 번째 유전자입니다. ctxA 의 유전자 서열은 클래식과 El Tor 바이오 타입 사이에서 완전히 보존되는 반면, ctxB 와 tcpA 는 두 바이오 타입 간에 다르지만 각 바이오 타입 내에서 보존된다. ctxB 는 2 개의 염기 자리를 제외한 바이오 타입 사이에서 완전히 보존된다(115 및 203). 엘 토르 (El Tor) 바이오 타입에서, 티민은 115 번과 203 번 위치에 있고, 전형적인 바이오 타입은이 염기에 시토신을 포함하고있다. tcpA 는 각 바이오 타입 내에서 완전히 보존되지만, 바이오 타입 사이의 여러 기지에서 다르다. 이러한 유전 적 특성은 일차적 인 생물 종 식별 마커 역할을하며, 이들 부위를 포함하는 폴리 메라 이제 연쇄 반응 (PCR) 증폭 산물을 시퀀싱 한 후에 야생형 (WT) 고전 O395 또는 WT El Tor N16961과 비교하여 생물 형질의 배경을 결정할 수있다 주어진 V. cholerae 균주에서 CT와 TCP의 발현 양상을 비교 하였다.
클래식과 El Tor biotypes 21 , 22 , 23 사이의 표현형 차이를 특성화하기 위해 수많은 프로토콜이 개발되었습니다. Polymyxin B는 그람 음성 백신에서 외부 세포막의 완전성을 손상시키는 펩타이드 항생제입니다.teria 및 polymyxin B 저항성은 polymyxin B 저항성 분석을 통해 시각화 할 수 있습니다 21 . 구연산염은 크렙스 사이클의 주요 기질이며 구연산염을 유일한 탄소원으로 대사하는 능력은 구연산 대사 분석법 22 를 사용하여 결정할 수 있습니다. hapR 은 다양한 프로모터 지역에 결합하고 유전자와 오페론 발현을 조절하는 V. cholerae, HapR의 글로벌 조절기와 마스터 쿼럼 감지 조절기를 암호화합니다. V. cholerae 의 일부 병원성 균주는 hapR 유전자에서 자연적으로 발생하는 프레임 변이 돌연변이를 가지고 있으며, 이로 인해 독성 유전자 발현의 밀도 의존적 조절이 24 , 25 개 손실되었다. 우유 한천 배지를 사용하여 HapR- 조절 프로테아제 활성을 측정하면 연구자는 특정 분리주가 기능적 HapR23을 함유하고 있는지 여부를 확인할 수 있습니다. 그만큼용혈 분석법은 적혈구를 용해시키는 용혈 효소를 분비하는 균주의 능력을 시험한다. 용혈 정도를 혈액 한천 플레이트 23 에서 시각화 할 수 있습니다. 운동성은 종종 V. cholerae의 병독성과 관련이 있으며 운동성 한천 플레이트 23을 사용하여 분석 할 수 있습니다. Voges-Proskauer assay는 포도당을 유일한 탄소원으로 발효시켜 부산물 인 acetoin 21 을 생산하는 균주의 능력을 시험합니다. 엘 토르 (El Tor) 변종이 출현함에 따라 광범위한 유전자형 스크리닝없이 V의 바이오 타입 배경을 추론하기 전에 주어진 표현형 분석의 결과를 예측하기가 어렵습니다. cholerae isolates의 경우, assays 23 의이 assembly를 수행하고 그 결과를 표 2 에서와 같이 참조 균주와 비교하는 것이 추천된다.
여기서 우리는 일련의 프로토콜을 발전 시켰으며,V 를 특성화하기위한보다 포괄적 인 접근을위한 genotypic 및 phenotypic 분석법의 사용. cholerae biotypes. 또한, 우리는 알려진 V 의 genotypic 및 phenotypic 구분을 설명했다. (WT 고전적 O395, WT El Tor C6706 및 WT El Tor N16961, 표 1 )와 비교하여, 콜레라 엘 토르 변이체 (MQ1795 및 BAA-2163)를 사용하는 것이 바람직하다. 엘 토르 (El Tor) 변종의 출현은 이전에 사용 된 단일 분석 생물 형질 규명 프로토콜의 신뢰성에 대한 문제점을 제기했다. 그러나,이 다중 분석법 식별 시스템은 임상 및 환경 V 의보다 신뢰성있는 특성 분석을 가능하게합니다. cholerae isolates.
Protocol
Representative Results
Discussion
200 개 이상의 식별 된 V 중 . cholerae serogroups, 오직 O1과 O139만이 전염병 가능성이있다. O1 혈청 그룹은 클래식과 엘 토르의 두 가지 바이오 타입으로 나눌 수 있습니다. 그러나 엘 토르 (El Tor) 변종 13,17이라고 불리는 하이브리드 계통이 엘 토르 (El Tor) 바이오 타입 배경을 가지고 있으며 고전적 특성 8 , 9 , 10 ,…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
뉴 햄프셔 – 인 브레 (New Hampshire-INBRE)가 NIH의 국립 종합 의학 연구소 (National Medical Sciences of NIH)의 기관 개발상 (IDeA), P20GM103506을 통해 지원
Materials
| 1 kb DNA Ladder | New England Biolabs | N3232S | https://www.neb.com/products/n3232-1-kb-dna-ladder |
| 60% Glycerol | Calbiochem | 356352 | http://www.emdmillipore.com/US/en/product/Glycerol%2C-Molecular-Biology-Grade—CAS-56-81-5—Calbiochem,EMD_BIO-356352 |
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| α-napthol | MP Biomedicals | 204189 | http://www.mpbio.com/product.php?pid=05204189 |
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