Лабораторные методы, используемые для поддержания и дифференциации биотипов<em> Vibrio cholerae</em> Клинические и экологические изоляты
Summary
В этой рукописи описываются правильные методы обслуживания Vibrio cholerae в дополнение к серии биохимических анализов, которые в совокупности используются для быстрой и надежной дифференциации между клиническим и экологическим V. Биотипы холеры в лабораторных условиях.
Abstract
Водная грамотрицательная бактерия Vibrio cholerae является этиологическим агентом холеры инфекционных желудочно-кишечных заболеваний. Из-за глобальной распространенности и тяжести этого заболевания, V. Cholerae широко изучается как в окружающей среде, так и в лабораторных условиях, требуя надлежащего обслуживания и методов культивирования. Классический и El Tor – два основных биотипа, которые составляют V. Cholerae O1, каждая из которых демонстрирует уникальные генотипические и фенотипические характеристики, которые обеспечивают надежные механизмы биотипической характеристики и требуют различной вирулентности, вызывающей условия культивирования. Независимо от биотипа причинного штамма для любой данной инфекции или вспышки, стандартное лечение заболевания включает в себя регидратационную терапию, дополненную режимом антибиотиков. Однако классификация биотипов может потребоваться для лабораторных исследований и может иметь более широкие последствия в биомедицинской области.В начале 2000-х годов были идентифицированы клинические изоляты, которые проявляют генотипические и фенотипические признаки как от классических, так и от биотипов El Tor. Недавно идентифицированные гибриды, называемые вариантами El Tor, вызвали идентификацию биотипа клинической и экологической изоляции, чтобы стать более сложными, чем предыдущие традиционные протоколы идентификации одного теста. В дополнение к описанию V. Холеры общего обслуживания и методов культивирования, эта рукопись описывает серию генетических экранов на основе гена ( ctxB и tcpA ) на основе ПЦР и фенотипические анализы (устойчивость к полимиксину B, метаболизм цитрата, протеолитическая активность, гемолитическая активность, подвижность и метаболизм глюкозы через Voges- Proskauer assay), все вместе используемые для характеристики и / или различия между классическими и El Tor биотипами. Вместе эти анализы обеспечивают эффективный систематический подход, который будет использоваться в качестве альтернативы или, кроме того, для дорогостоящих трудоемких экспериментов в характеристикеV. Холеры клинических (и экологических) изолятов.
Introduction
Холера – это заболевание дистального тонкого кишечника, вызванное потреблением загрязненной пищи или воды, содержащей водную грамотрицательную бактерию Vibrio cholerae . Симптомы холеры включают рвоту и неконтролируемую водянистую диарею, что приводит к серьезному обезвоживанию, которое, если его не лечить должным образом, приведет к смерти. V. Холеру можно разделить на более чем 200 серогрупп, основанных на структуре O-антигена липополисахарида клеточной поверхности. Однако только 2 серогруппы O1 и O139 продемонстрировали эпидемический или пандемический потенциал 1 , 2 . Более того, серогруппа O139 была в основном изолирована от Юго-Восточной Азии 3 , 4 , а серогруппа O1 распределена во всем мире. Кроме того, серогруппу O1 можно разделить на 2 основных биотипа: классический и El Tor. Классический биотип отвечал за первые 6 пандемий холерыС 1817 по 1923 год. Продолжающаяся седьмая пандемия является результатом биотипа Эль-Тор, который во всем мире смещает классический биотип в окружающую среду 5 , 6 , 7 . Недавно возникли штаммы, которые содержат отличительные характеристики как классических, так и биотипов El Tor 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 и с тех пор назывались вариантами El Tor 13 , 17 . Некоторые варианты El Tor продемонстрировали повышенную способность вирулентности с более быстрым и тяжелым прогрессированием заболевания, чем ранее наблюдалось, подчеркиваяНеобходимость более комплексного подхода к идентификации агентов и профилактике и лечению болезней 8 , 9 , 18 . Хотя идентификация биотипа не сразу диктует лечение, дальнейшие улучшения в развитии вакцины и будущих терапевтических агентах могут выиграть от различия биотипов.
Первая серия протоколов, перечисленных здесь, позволит исследователям правильно поддерживать V. Штаммов холеры в лабораторных условиях. Последовательность и последующий анализ требуют подготовки запасов и роста изолятов, которые не зависят от биотипа. Однако для оптимального индуцирования экспрессии генов вирулентности необходимы независимые биотипические методы культивирования 19 . Кроме того, в этой рукописи изложена подготовка к различным генетическим и биохимическим анализам.
Толерант холеры (КТ) и токсин co-reGulated pilus (TCP) – два основных фактора вирулентности, контролируемых главным регулятором ToxT в обоих биотипах V. Cholerae O1 серогруппа 20 . CT – двудольный токсин, состоящий из пяти CtxB Субъединиц, окружающих одну субъединицу CtxA, и отвечает за быструю потерю электролита, связанную с холерой. TCP является типом IV пилота, закодированным операндом tcp ( tcpABQCRDSTEF ), и участвует в прикреплении и колонизации дистального тонкого кишечника. TcpA является первым геном оперона tcp , который кодирует отдельные субъединицы пилина, необходимые для построения пилюса 8 . Последовательность генов для ctxA полностью сохраняется между классическими и биотипами El Tor, тогда как ctxB и tcpA различаются по двум биотипам, но сохраняются в каждом биотипе 8 . CtxB полностью сохраняется между биотипами, за исключением двух базовых позиций(115 и 203). В биотипе El Tor тимин находится в базовых положениях 115 и 203, тогда как классический биотип содержит цитозин на этих основаниях. TcpA полностью сохраняется в каждом биотипе, но отличается на нескольких основаниях между биотипами. Эти генетические различия служат в качестве первичных идентификационных маркеров биотипа, и после секвенирования продукта амплификации полимеразной цепной реакции (ПЦР), включающего эти сайты, изолятные последовательности можно сравнить с классическим классическим O395 дикого типа (WT) или WT El Tor N16961 для определения фона биотипа CT и TCP, соответственно, в данном изоляте V. cholerae .
Разработаны многочисленные протоколы для описания фенотипических различий между классическими и биотипами El Tor 21 , 22 , 23 . Полимиксин В представляет собой пептидный антибиотик, который ставит под угрозу целостность наружной клеточной мембраны в грамотрицательном бакеТерия и полимиксина В можно визуализировать с помощью анализа резистентности к полимиксину В 21 . Цитрат является основным субстратом цикла Креба, и способность метаболизировать цитрат в качестве единственного источника углерода может быть определена с использованием анализа метаболизма цитрата 22 . HapR кодирует глобальный регулятор и главный регулятор кворума в V cholerae, HapR, который связывается с различными областями промотора и регулирует экспрессию гена и оперона 24 . Некоторые патогенные штаммы V. cholerae имеют естественную мутацию смены кадров в гене hapR , что привело к потере этой зависимой от плотности регуляции экспрессии гена вирулентности 24 , 25 . Измерение активности протеазы, регулируемой HapR, с использованием молочных агаровых сред позволяет исследователю определить, содержит ли конкретный изолят функциональный HapR 23 .Анализы гемолиза для определения способности штамма выделять гемолитические ферменты, которые лизят эритроциты; Степень гемолиза может быть визуализирована на пластинах 23 агара. Подвижность часто ассоциируется с вирулентностью у V. cholerae и может быть проанализирована с использованием пластинчатых агаровых пластин 23 . Анализ Voges-Proskauer проверяет способность штамма ферментировать глюкозу в качестве единственного источника углерода и продуцировать ацетоин побочного продукта 21 . С появлением вариантов El Tor трудно предсказать результаты любого данного фенотипического анализа без обширного генотипического скрининга и до выведения биотипического фона V. Холеры, рекомендуется выполнить эту сборку анализов 23 и сравнить результаты с ссылочными штаммами, как в таблице 2 .
В этой связи мы разработали ряд протоколов, совместно использующих aforemeГенотипических и фенотипических анализов для более полного подхода к характеристике V. Холерные биотипы. Кроме того, мы описали генотипические и фенотипические различия известных V. Cholerae El Tor (MQ1795 и BAA-2163) по сравнению с обычно используемыми ссылочными штаммами биотипов (классический WT классический O395, WT El Tor C6706 и WT El Tor N16961, таблица 1 ). Появление вариантов El Tor показало проблемы надежности ранее использованных протоколов характеризации биотипа одного анализа; Однако эта система идентификации с множественным анализом позволит обеспечить более надежную характеристику клинического и экологического V. Изолятов холеры .
Protocol
Representative Results
Discussion
Из более чем 200 идентифицированных V. Холерные серогруппы, только O1 и O139 имеют эпидемический потенциал. Серогруппу O1 можно разделить на два биотипа: классический и El Tor. Однако появились гибридные штаммы, названные вариантами El Tor 13 , 17 , которые обладаю…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Исследования, поддержанные New Hampshire-INBRE через премию за институциональное развитие (IDeA), P20GM103506, из Национального института общих медицинских наук NIH.
Materials
| 1 kb DNA Ladder | New England Biolabs | N3232S | https://www.neb.com/products/n3232-1-kb-dna-ladder |
| 60% Glycerol | Calbiochem | 356352 | http://www.emdmillipore.com/US/en/product/Glycerol%2C-Molecular-Biology-Grade—CAS-56-81-5—Calbiochem,EMD_BIO-356352 |
| Agar | Becto, Dickinson and Co. | 214030 | http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=214030&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D214030%26typeOfSearch%3DproductSearch |
| Agar with brain-heart infusion | Becto, Dickinson and Co. | 237500 | http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=237500&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D237500%26typeOfSearch%3DproductSearch |
| Agarose | Peqlab | 732-2789 | https://de.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=732-2789&_DARGS=/store/cms/de.vwr.com/de_DE/header_2016111711383215.jsp_AF&_dynSessConf=1766917479792147141&targetURL=/store/catalog/product.jsp%3Fcatalog_number%3D732-2789&lastLanguage=en&/vwr/userprofiling/EditPersonalInfoFormHandler.updateLocale=&_D%3AcurrentLanguage=+¤tLanguage=en&_D%3AlastLanguage=+&_D%3A/vwr/userprofiling/EditPersonalInfoFormHandler.updateLocale=+ |
| Anhydrous K2HPO4 | Fisher Scientific | P288-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-phosphate-dibasic-anhydrous-crystalline-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/p288500?searchHijack=true&searchTerm=P288500&searchType=RAPID |
| Blood Agar Plates | Remel | R01200 | Store at 4 °C; http://www.remel.com/Catalog/Item.aspx?name=Blood+Agar |
| Boric Acid | Fisher Scientific | A73-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/boric-acid-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-6/a73500?searchHijack=true&searchTerm=A73500&searchType=RAPID |
| Bromothymol Blue | Fisher Scientific | B388-10 | https://www.fishersci.com/shop/products/bromothymol-blue-certified-acs-fisher-chemical/b38810?searchHijack=true&searchTerm=B38810&searchType=RAPID |
| Cirtric acid ·H2O | Fisher Scientific | S72836-3 | https://www.fishersci.com/shop/products/citric-acid-monohydrate-4/s728363#?keyword=s728363 |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Kit | New England Biolabs | N0446S | Store at -20 °C; https://www.neb.com/products/n0446-deoxynucleotide-solutionset |
| Disodium EDTA | Fisher Scientific | S311-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/ethylenediaminetetraacetic-acid-disodium-salt-dihydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-7/s311500?searchHijack=true&searchTerm=S311500&searchType=RAPID |
| DNA Clean & Concentrator™ -25 Kit | Zymo Research | D4007 | http://www.zymoresearch.com/dna/dna-clean-up/zymoclean-gel-dna-recovery-kit |
| GelGreen Nucleic Acid Stain | Biotium | 41005 | https://biotium.com/product/gelgreentm-nucleic-acid-gel-stain-10000x-in-water/ |
| Genesys 10SUV-VIS Spectrophotometer | Thermo Scientific | 840-208100 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/840-208100?ICID=search-840-208100 |
| Gentra Puregene Yeast/Bact. Kit | Qiagen | 158567 | https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/dna/dna-preparation/gentra-puregene-yeastbact-kit/#orderinginformation |
| HCl | Fisher Scientific | A144-212 | Corrosive; https://www.fishersci.com/shop/products/hydrochloric-acid-certified-acs-plus-fisher-chemical-10/a144212?searchHijack=true&searchTerm=A144212&searchType=RAPID |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-chloride-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-4/p217500?searchHijack=true&searchTerm=P217500&searchType=RAPID |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-phosphate-monobasic-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-5/p285500?searchHijack=true&searchTerm=P285500&searchType=RAPID |
| KOH | Fisher Scientific | P250-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-hydroxide-pellets-certified-acs-fisher-chemical-5/p250500?searchHijack=true&searchTerm=P250500&searchType=RAPID |
| Le Loop | Decon Labs Inc. | MP190-25 | http://deconlabs.com/products/leloop/ |
| Le Stab | Decon Labs Inc. | MP186-5 | http://deconlabs.com/products/lestab/ |
| MgSO4·7H2O | Fisher Scientific | M63-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?searchHijack=true&searchTerm=M63500&searchType=RAPID |
| Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System | Bio Rad Labs | 1704406 | http://www.bio-rad.com/en-us/product/mini-sub-cell-gt-cell?WT.srch=1&WT.mc_id=aw-cbb-NA-sub_cell_systems_brand_gold&WT.knsh_id=7eb1981f-a011-42a3-aece-1236ff453373 |
| MR-VP Broth | Difco | 216300 | http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=216300&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3Dmr-vp%2Bmedium%26typeOfSearch%3DproductSearch |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-phosphate-dibasic-anhydrous-granular-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/s374500?searchHijack=true&searchTerm=S374500&searchType=RAPID |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-10 | https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-chloride-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-6/s27110?searchHijack=true&searchTerm=S27110&searchType=RAPID |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | S233-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-bicarbonate-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/s233500?searchHijack=true&searchTerm=S233500&searchType=RAPID |
| NaNH4HPO4·4H2O | Fisher Scientific | S218-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-ammonium-phosphate-tetrahydrate-crystalline-certified-fisher-chemical/s218500?searchHijack=true&searchTerm=S218500&searchType=RAPID |
| NanoDrop Lite Spectrophtometer | Thermo Scientific | ND-LITE-PR | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/ND-LITE-PR?ICID=search-ND-LITE-PR |
| Nonfat dry milk | Nestle Carnation | N/A | N/A |
| Peptone | Becto, Dickinson and Co. | 211677 | http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=211677&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D211677%26typeOfSearch%3DproductSearch |
| Petri Dishes (100 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875712#?keyword=FB0875712 |
| Petri Dishes (150 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875714 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875714?searchHijack=true&searchTerm=FB0875714&searchType=RAPID |
| Polymyxin B sulfate salt | Sigma-Aldrich | P1004-10MU | Store at 2-4 °C; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p1004?lang=en®ion=US |
| Taq DNA Polymerase | New England Biolabs | M0273S | Store at -20 °C; https://www.neb.com/products/m0273-taq-dna-polymerase-with-standard-taq-buffer |
| Taq Reaction Buffer | New England Biolabs | M0273S | Store at -20 °C; https://www.neb.com/products/m0273-taq-dna-polymerase-with-standard-taq-buffer |
| Thermal Cycler Bio-Rad C1000 Touch™ | Bio Rad Labs | 1840148 | http://www.bio-rad.com/evportal/evolutionPortal.portal?_nfpb=true&_pageLabel=search_page&sfMode=search&sfStartNumber=1&clearQR=true&js=1&searchString=1840148&database=productskus+productcategories+productdetails+abdProductDetails+msds+literatures+inserts+faqs+downloads+webpages+assays+genes+pathways+plates+promotions&tabName=DIVISIONNAME |
| Triphenyltetrazolium chloride | Alfa Aesar | A10870 | https://www.alfa.com/en/catalog/A10870/ |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | https://www.fishersci.com/shop/products/tris-base-white-crystals-crystalline-powder-molecular-biology-fisher-bioreagents-7/bp1521?searchHijack=true&searchTerm=BP1521&searchType=RAPID |
| Tris∙HCl | Calbiochem | 9310 | http://www.emdmillipore.com/US/en/product/OmniPur-TRIS-Hydrochloride—CAS-1185-53-1—Calbiochem,EMD_BIO-9310-OP |
| Tryptone | Becto, Dickinson and Co. | 211705 | http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=211705&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D211705%26typeOfSearch%3DproductSearch |
| Yeast Extract | Becto, Dickinson and Co. | 212750 | http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=212750&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D212750%26typeOfSearch%3DproductSearch |
| α-napthol | MP Biomedicals | 204189 | http://www.mpbio.com/product.php?pid=05204189 |
Riferimenti
- Shimada, T., et al. Extended serotyping scheme for Vibrio cholerae. Curr. Microbiol. 28 (3), 175-178 (1994).
- Yamai, S., Tadayuki, O., Toshio, S., Yasuji, K. Distribution of serogroups of Vibrio cholerae non-O1 non-O139 with specific reference to their ability to produce cholera toxin, and addition of novel serogroups. Jpn. J. Infect. Dis. 71 (10), 1037-1045 (1997).
- Karaolis, D. K., Lan, R., Reeves, P. R. The sixth and seventh cholera pandemics are due to independent clones separately derived from environmental, nontoxigenic, non-O1 Vibrio cholerae. J. Bacteriol. 177 (11), 3191-3198 (1995).
- Albert, M. J., et al. Large epidemic of cholera-like disease in Bangladesh caused by Vibrio cholerae O139 synonym Bengal. Lancet. 342 (8868), 387 (1993).
- Barua, D., Barua, D., Greenough III, W. B. History of Cholera. Cholera. , 1-36 (1992).
- Morales, R., Delgado, G., Cravioto, A., Faruque, S. M., Nair, G. B. Population Genetics of Vibrio cholerae. Vibrio cholerae-Genomics and Molecular Biology. , 29-47 (2008).
- Samadi, A. R., Chowdhury, M. K., Huq, M. K., Khan, M. U. Seasonality of classical and El Tor cholera in Dhaka, Bangladesh: 17-year trends. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 77 (6), 853-856 (1983).
- Son, M. S., Megli, C. J., Kovacikova, G., Qadri, F., Taylor, R. K. Characterization of Vibrio cholerae O1 El Tor biotype variant clinical isolates from Bangladesh and Haiti, including a molecular genetic analysis of virulence genes. J. Clin. Microbiol. 49 (11), 3739-3749 (2011).
- Ghosh-Banerjee, J., et al. Cholera toxin production by the El Tor variant of Vibrio cholerae O1 compared to prototype El Tor and classical biotypes. J. Clin. Microbiol. 48 (11), 4283-4286 (2010).
- Ansaruzzaman, M., et al. Cholera in Mozambique, variant of Vibrio cholerae. Emerg. Infect. Dis. 10 (11), 2057-2059 (2004).
- Ansaruzzaman, M., et al. Genetic diversity of El Tor strains of Vibrio cholerae O1 with hybrid traits isolated from Bangladesh and Mozambique. Int. J. Med. Microbiol. 297 (6), 443-449 (2007).
- Lan, R., Reeves, P. R. Pandemic spread of cholera: genetic diversity and relationships within the seventh pandemic clone of Vibrio cholerae determined by amplified fragment length polymorphism. J. Clin. Microbiol. 40 (1), 172-181 (2002).
- Nair, G. B., Faruque, S. M., Bhuiyan, N. A., Kamruzzaman, M., Siddique, A. K., Sack, D. A. New variants of Vibrio cholerae O1 biotype El Tor with attributes of the classical biotype from hospitalized patients with acute diarrhea in Bangladesh. J. Clin. Microbiol. 40 (9), 3296-3299 (2002).
- Nair, G. B., et al. Isolation of Vibrio cholerae O1 strains similar to pre-seventh pandemic El Tor strains during an outbreak of gastrointestinal disease in an island resort in Fiji. J. Med. Microbiol. 55 (11), 1559-1562 (2006).
- Nair, G. B., Mukhopadhyay, A. K., Safa, A., Takeda, Y., Faruque, S. M., Nair, G. B. Emerging hybrid variants of Vibrio cholerae O1. Vibrio cholerae—Genomics and Molecular Biology. , 179-190 (2008).
- Safa, A., et al. Genetic characteristics of Matlab variants of Vibrio cholerae O1 that are hybrids between classical and El Tor biotypes. J. Med. Microbiol. 55 (11), 1563-1569 (2006).
- Nusrin, S., et al. Diverse CTX phages among toxigenic Vibrio cholerae O1 and O139 strains isolated between 1994 and 2002 in an area where cholera is endemic. J. Clin. Microbiol. 42 (12), 5854-5856 (2004).
- Carignan, B. M., Brumfield, K. D., Son, M. S. Single nucleotide polymorphisms in regulator-encoding genes have an additive effect on virulence gene expression in a Vibrio cholerae clinical isolate. mSphere. 1 (5), e00253 (2016).
- Iwanaga, M., Yamamoto, K., Higa, N., Ichinose, Y., Nakasone, N., Tanabe, M. Culture conditions for stimulating cholera toxin production by Vibrio cholerae O1 El Tor. Microbiol. Immunol. 30 (11), 1075-1083 (1986).
- DiRita, V. J., Claude, P., Georg, J., Mekalanos, J. J. Regulatory cascade controls virulence in Vibrio cholerae. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88 (12), 5403-5407 (1991).
- Kovacikova, G., Lin, W., Skorupski, K. Duel regulation of genes involved in acetoin biosynthesis and motility/biofilm formation by the virulence activator AphA and the acetate-responsive Lys-R type regulator AlsR in Vibrio cholerae. Mol. Microbiol. 57 (2), 420-433 (2005).
- Vogel, H. J., Bonner, D. M. Acetylornithinase of Escherechia coli: partial purification and some properties. J. Biol. Chem. 218 (1), 97-106 (1956).
- Son, M. S., Taylor, R. K. Genetic screens and biochemical assays to characterize Vibrio cholerae O1 biotypes: classical and El Tor. Curr. Protoc. Microbiol. , 6A.2.1-6A.2.17 (2011).
- Kovacikova, G., Skorupski, K. Regulation of virulence gene expression in Vibrio cholerae by quorum sensing: HapR functions at the aphA promoter. Mol. Microbiol. 46 (4), 1135-1147 (2002).
- Wang, Y., et al. The prevalence of functional quorum-sensing systems in recently emerged Vibrio cholerae toxigenic strains. Environ. Microbiol. Rep. 3 (2), 218-222 (2011).
- Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques. J. Vis. Exp. (63), e3064 (2012).
- Martinez, R. M., Megli, C. J., Taylor, R. K. Growth and laboratory maintenance of Vibrio cholerae. Curr. Protoc. , 6A.1.1-6A.1.6 (2010).
