Questo protocollo descrive un metodo per osservare l'embriogenesi in Arabidopsis tramite liquidazione ovulo seguita dal controllo della formazione di pattern di embrione sotto un microscopio.
Articolo metodologico
Questo protocollo descrive un metodo per osservare l'embriogenesi in Arabidopsis tramite liquidazione ovulo seguita dal controllo della formazione di pattern di embrione sotto un microscopio.
Data la natura altamente prevedibile del loro sviluppo, embrioni di Arabidopsis sono stati utilizzati come modello per gli studi della morfogenesi in piante. Tuttavia, primi embrioni di pianta di fase sono piccoli e contengono poche cellule, che li rende difficili da osservare e analizzare. Un metodo è descritto qui per caratterizzare la formazione di pattern in embrioni di pianta sotto un microscopio usando l'organismo modello Arabidopsis. A seguito della liquidazione di ovuli freschi utilizzando soluzione di Hoyer, il numero di cell in e la morfologia degli embrioni ha potuto essere osservati, e loro stadio di sviluppo potrebbe essere determinata da microscopia di contrasto di interferenza differenziale utilizzando un 100x obiettivo d'immersione in olio. Inoltre, l'espressione delle proteine marker specifici contrassegnati con proteina fluorescente verde (GFP) è stato monitorato per annotare la specifica identità cellulare durante patterning di embrione di microscopia a scansione laser confocale. Pertanto, questo metodo può essere utilizzato per osservare la formazione di pattern in embrioni di selvaggio-tipo pianta a livello cellulare e molecolare e di caratterizzare il ruolo di geni specifici nel patterning embrione confrontando la formazione di pattern in embrioni da piante wild type e mutanti embrione-letale. Pertanto, il metodo può essere utilizzato per caratterizzare l'embriogenesi in Arabidopsis.
L'embriogenesi è l'evento più iniziale in maggiore sviluppo delle piante. Forma un embrione maturo da uno zigote attraverso divisione delle cellule e differenziazione sotto rigoroso controllo genetico1,2. Embrioni di Arabidopsis sono un modello utile per studiare il controllo della morfogenesi, perché la sequenza di divisioni cellulari durante l'embriogenesi segue un modello previsto3,4. Tuttavia, un embrione di Arabidopsis contenente uno a parecchie cellule è troppo piccolo per essere osservata e analizzata. Inoltre, la mutazione di ....
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Nota: Questo protocollo ha tre parti: 1) osservando la formazione di pattern in embrioni di Arabidopsis di selvaggio-tipo usando microscopia DIC; 2) che caratterizza l'embrione modello formazione tramite l'osservazione dell'espressione della proteina marker utilizzando laser confocale microscopia; e 3) determinazione del ruolo di un gene specifico nell'embriogenesi (utilizzando il mutante di naa10 ad esempio).
1. ovulo schiarimento
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Il metodo descritto in questo documento può essere utilizzato per osservare l'embriogenesi direttamente sotto un microscopio, annotare la specifica identità cellulare durante l'embriogenesi con marcatori specifici e caratterizzare il ruolo di un gene particolare durante l'embriogenesi.
Risultati rappresentativi dall'analisi dell'embrione patterning (dalla fase di zigote allungata per la fase matura del bastone) nel selvaggio-tip.......
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La clearance dell'ovulo è un metodo utile per rilevare la divisione cellulare e valutare morfologia durante l'embriogenesi in Arabidopsis; utilizzando questa tecnica, gli embrioni possono essere osservati direttamente nel DIC microscopia5,12. Il passaggio fondamentale per lo sdoganamento dell'ovulo è punto 1.3.4. Il tempo richiesto per lo sdoganamento dell'ovulo nel passaggio 1.3.4 è variabile. Embrioni allo stadio di 2/4-cellule possono essere osservati.......
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Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamo il Dr. Jessica Habashi per la lettura critica del manoscritto. Ringraziamo il Dr. Xianyong Sheng di Imaging Center, College di Scienze della vita, Capital Normal University (Cina), per eseguire la localizzazione del dosaggio di DR5-GFP . Quest'opera è stata sostenuta da sovvenzioni della Beijing Municipal governo Science Foundation (CIT & TCD20150102) e dal National Natural Science Foundation of China (31600248).
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Chloral Hydrate | Sigma | 15307 | |
| Murashige e Skoog Basal Medium | Sigma | M5519 | |
| Phytagel | Sigma | P8169 | |
| Hygromycin | Roche | 10843555001 | |
| Camera di crescita | Percival | CU36L5 | |
| Microscopio a fluorescenza | Zeiss Oberkochen | Zeiss Image M2 | fotocamera: AxioCam 506 |
| microscopia a scansione laser confocale | a colori Zeiss Oberkochen | Zeiss LSM 5 | filtri: BP 495 - 555 nm |
| Stereoscopio | Zeiss Oberkochen | Axio Zoom V16 | fotocamera: AxioCam MRc5 |
| terreno ricco di sostanze nutritive | KLASMANN, Germania | ||
| Tubo da 50 ml | Corning Inc. | ||
| Provetta da 1,5 mL | Corning Inc. | ||
| di ipoclorito di sodio al 10% | Reagente analitico domestico | ||
| saccarosio | Reagente analitico domestico | ||
| KOH | Reagente analitico domestico | ||
| glicerolo | Reagente analitico domestico | ||
| Piatto | Forniture domestiche | ||
| vermiculite | Forniture domestiche | ||
| vetrino Forniture | domestiche | ||
| ago | Forniture domestiche | ||
| Pinzette | Forniture domestiche | ||
| banco | Attrezzature domestiche |
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