أسلوب لوصف امبريوجينيسيس في نبات
Summary
ويحدد هذا البروتوكول وسيلة لمراقبة امبريوجينيسيس في نبات عن طريق إزالة ovule متبوعاً بالتفتيش على تشكيل نمط الجنين تحت مجهر.
Abstract
نظراً لطبيعة شديدة يمكن التنبؤ بها لتنميتها، استخدمت أجنة نبات كنموذج للدراسات morphogenesis في النباتات. ولكن الأجنة النباتية المرحلة المبكرة الصغيرة وتحتوي على بعض الخلايا، مما يجعل من الصعب مراقبة وتحليل. يتم وصف أسلوب هنا لوصف تشكيل نمط في الأجنة النباتية تحت مجهر باستخدام نموذج الكائن الحي نبات. بعد إزالة البويضات الطازجة الحل هوير باستخدام، يمكن ملاحظة مورفولوجيا الأجنة وعدد الخلايا في، ومرحلة إنمائية يمكن أن تحددها التدخل التفاضلية تباين مجهرية باستخدام 100 × النفط غمر عدسة. وبالإضافة إلى ذلك، تم رصد التعبير عن البروتينات علامة محددة معلم مع أخضر نيون البروتين (التجارة والنقل) لإضافة تعليق توضيحي مواصفات هوية الخلية أثناء الزخرفة الجنين بالليزر [كنفوكل] الفحص المجهري. وهكذا، يمكن استخدام هذا الأسلوب لمراقبة تشكيل نمط في الأجنة النباتية البرية من نوع المستويات الخلوية والجزيئية، وتلخص الدور جينات محددة في الزخرفة الجنين بمقارنة تشكيل نمط في الأجنة من النباتات البرية من نوع وطفرات الجنين الفتاكة. ولذلك، يمكن استخدام الأسلوب تميز embryogenesis في نبات.
Introduction
امبريوجينيسيس هو الحدث أقرب في أعلى النبات التنمية. أشكال جنين ناضجة من الزيجوت عن طريق انقسام الخلايا وتمايزها تحت رقابة صارمة على الوراثية1،2. أجنة نبات نموذجا مفيداً لدراسة مراقبة morphogenesis لأنه يتبع تسلسل انقسامات الخلية أثناء امبريوجينيسيس نمط المتوقع3،4. ومع ذلك، جنين نبات يحتوي على واحد إلى عدة خلايا صغير جداً مراعاتها وتحليلها. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يسبب الطفرة لبعض الجينات الجنين الفتك5، مما يشير إلى الدور الرئيسي لتلك الجينات في امبريوجينيسيس. وصف تشكيل نمط في طفرات الجنين الفتاكة يوفر أساسا لفهم الآلية الجزيئية بموجبه تنظيم الجينات الأساسية تنمية الجنين.
يتم وصف طريقة مفصلة هنا لوصف تشكيل نمط الجنين في المصنع النموذجي نبات بالملاحظة المجهرية المباشرة. الأسلوب الذي ينطوي على إزالة ovule تليها المراقبة المجهرية للجنين. ويرد أيضا وصف المسخ الجنين الفتاكة.
يمكن تحديد مورفولوجية الأجنة في مراحل إنمائية مختلفة مباشرة عن طريق الفحص المجهري باستخدام البويضات التي أزيلت مع هوير لحل6،7. هذه البويضات يحمل إنكسار عالية؛ وهكذا، ovule هذا مسح الأسلوب مفيد خاصة للعينات التي يجب مراعاتها قبل التدخل التفاضلية التباين (DIC) الفحص المجهري.
وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام الجينات التي يتم التعبير عنها في خلية معينة أو عدد محدود من الخلايا أثناء embryogenesis كعلامات لتحديد الخلايا في جنين. ولذلك، يمكن المشروح مواصفات هوية الخلية أثناء امبريوجينيسيس عن طريق رصد التعبير عن البروتينات بروتينات فلورية خضراء معلم علامة باستخدام الليزر [كنفوكل] الفحص المجهري. على العكس من ذلك، مراقبة نمط التعبيرالتجارة والنقل الانصهار الجينات الوظيفية غير معروف-أثناء embryogenesis يمكن توفير ارتباط بين الجنين الزخرفة والتعبير عن ذلك الجين، وتيسير تحديد الجينات الجديدة التي مطلوبة من أجل امبريوجينيسيس في نبات.
يمكن أيضا استخدام الأسلوب الموصوفة هنا تميز النمط الظاهري المسخ الجنين الفتاكة، وتحديد أثر الجينات المتضررة على امبريوجينيسيس على المستوى الخلوي. وعلاوة على ذلك، في تركيبة مع مقارنة بين نمط التعبير للجينات ماركر خلال امبريوجينيسيس بين النباتات البرية من نوع ومتحولة، الطريقة يمكن أن تسفر عن أدلة حول الآليات الجزيئية ومسارات الإشارات المشتركة في امبريوجينيسيس8،9. في الواقع، تم تطبيق الأسلوب للنباتات naa10 ، ووجد أن الشعبة غير طبيعي من النخامية في المسخ قد تنجم عن تغيير في توزيع اكسين خلال embryogenesis5.
Protocol
Representative Results
Discussion
إزالة ovule طريقة مفيدة للكشف عن انقسام الخلية وتقييم مورفولوجيا أثناء امبريوجينيسيس في نبات؛ باستخدام هذا الأسلوب، يمكن ملاحظة الأجنة مباشرة تحت المجهر DIC5،12. أن الخطوة الحاسمة لإزالة ovule خطوة 1.3.4. الوقت اللازم لإزالة أبل في الخطوة 1.3.4 متغير. يمكن ملاحظة …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونشكر الدكتور جيسيكا حبشي لقراءة خطيرة من المخطوطة. ونشكر الدكتور Xianyong شنغ من مركز التصوير، كلية علوم الحياة، جامعة العاصمة للمعلمين (بيجين، الصين)، للقيام بترجمة الإنزيم DR5-التجارة والنقل . هذا العمل كان يدعمها المنح من “مؤسسة العلوم حكومة بلدية بكين” (CIT & TCD20150102) ومن “مؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية الصينية” (31600248).
Materials
| Chloral Hydrate | Sigma | 15307 | |
| Murashige and Skoog Basal Medium | Sigma | M5519 | |
| Phytagel | Sigma | P8169 | |
| Hygromycin | Roche | 10843555001 | |
| Growth chamber | Percival | CU36L5 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss Oberkochen | Zeiss Image M2 | camera: AxioCam 506 color |
| Confocal Laser Scanning Microscopy | Zeiss Oberkochen | Zeiss LSM 5 | filters: BP 495-555 nm |
| Stereoscope | Zeiss Oberkochen | Axio Zoom V16 | camera: AxioCam MRc5 |
| nutrient-rich soil | KLASMANN, Germany | ||
| 50-ml tube | Corning Inc. | ||
| 1.5-ml tube | Corning Inc. | ||
| 10% sodium hypochlorite solution | Domestic analytical reagent | ||
| sucrose | Domestic analytical reagent | ||
| KOH | Domestic analytical reagent | ||
| glycerol | Domestic analytical reagent | ||
| culture dish | Domestic supplies | ||
| vermiculite | Domestic supplies | ||
| glass slide | Domestic supplies | ||
| syringe needle | Domestic supplies | ||
| fine-tipped tweezers | Domestic supplies | ||
| super clean bench | Domestic equipment | ||
Riferimenti
- Jenik, P. D., Gillmor, C. S., Lukowitz, W. Embryonic patterning in Arabidopsis thaliana. Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 207-236 (2007).
- Lau, S., Slane, D., Herud, O., Kong, J., Jurgens, G. Early embryogenesis in flowering plants: setting up the basic body pattern. Annu Rev Plant Biol. 63, 483-506 (2012).
- Wendrich, J. R., Weijers, D. The Arabidopsis embryo as a miniature morphogenesis model. New Phytol. 199 (1), 14-25 (2013).
- ten Hove, C. A., Lu, K. J., Weijers, D. Building a plant: cell fate specification in the early Arabidopsis embryo. Development. 142 (3), 420-430 (2015).
- Feng, J., et al. Protein N-terminal acetylation is required for embryogenesis in Arabidopsis. J Exp Bot. 67 (15), 4779-4789 (2016).
- Berleth, T., Jurgens, G. The role of the monopteros gene in organising the basal body region of the Arabidopsis embryo. Development. 118, 575-587 (1993).
- Luo, Y., et al. D-myo-inositol-3-phosphate affects phosphatidylinositol-mediated endomembrane function in Arabidopsis and is essential for auxin-regulated embryogenesis. Plant Cell. 23 (4), 1352-1372 (2011).
- Nodine, M. D., Yadegari, R., Tax, F. E. RPK1 and TOAD2 are two receptor-like kinases redundantly required for Arabidopsis embryonic pattern formation. Dev Cell. 12 (6), 943-956 (2007).
- Ulmasov, T., Murfett, J., Hagen, G., Guilfoyle, T. J. Aux/IAA proteins repress expression of reporter genes containing natural and highly active synthetic auxin response elements. Plant Cell. 9 (11), 1963-1971 (1997).
- Friml, J., et al. Efflux-dependent auxin gradients establish the apical-basal axis of Arabidopsis. Nature. 426 (6963), 147-153 (2003).
- Clough, S. J., Bent, A. F. Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16 (16), 735-743 (1998).
- Fiume, E., Fletcher, J. C. Regulation of Arabidopsis embryo and endosperm development by the polypeptide signaling molecule CLE8. Plant Cell. 24 (3), 1000-1012 (2012).
- Jurkuta, R. J., Kaplinsky, N. J., Spindel, J. E., Barton, M. K. Partitioning the apical domain of the Arabidopsis embryo requires the BOBBER1 NudC domain protein. Plant Cell. 21 (21), 1957-1971 (2009).
