Embriyogenez Arabidopsis olarak karakterize bir yöntem
Summary
Bu iletişim kuralı Arabidopsis içinde embriyogenez embriyo Desen oluşumu bir mikroskop altında incelenmesi ve ardından ovule izni ile gözlemlemek için bir yöntem özetliyor.
Abstract
Gelişimleri çok öngörülebilir doğası göz önüne alındığında, Arabidopsis embriyo bir model olarak morfogenez tesislerinde çalışmaları için kullanılmaktadır. Ancak, erken aşamada bitki embriyo küçük ve onları gözlemlemek ve çözümlemek zor hale birkaç hücre içeriyor. Bir yöntemi Desen oluşumu bitki embriyo model organizma Arabidopsiskullanma mikroskop altında karakterize için burada kullanılmıştır. Taze ovules Hoyer’ın solution’ı kullanma izni, cep telefonu numarasını ve Morfoloji embriyo gözlenen ve onların gelişim aşamasında fark girişim kontrast mikroskobu bir 100 X yağı daldırma objektifi kullanarak tarafından tespit edilemedi. Buna ek olarak, belirli işaret proteinlerin yeşil flüoresan Protein (GFP ile) öğesini ifade mikroskobu tarama confocal lazerle hücre Kimlik belirtimi embriyo desenlendirme sırasında ek açıklama eklemek için takip. Böylece, bu yöntem vahşi-türü bitki embriyolar, hücresel ve moleküler düzeyde oluşumunda desen gözlemlemek ve embriyo vahşi-türü bitkiler ve embriyo ölümcül mutantlar Desen oluşumu karşılaştırarak embriyo desenlendirme belirli genlerin rol tanımlamak için kullanılabilir. Bu nedenle, yöntem Arabidopsisembriyogenez karakterize etmek için kullanılabilir.
Introduction
Embriyogenez daha yüksek bitki gelişiminde ilk olaydır. Olgun embriyo formlarının dışında bir zigot hücre bölünmesi ve farklılaşma altında sıkı genetik kontrol1,2. Arabidopsis embriyoların hücre bölünmeler embriyogenez sırasında dizi beklenen desen3,4takip çünkü morfogenez kontrolünü çalışmaya uzun bir faydalı model vardır. Ancak, bir birkaç hücreyi içeren bir Arabidopsis embriyo gözlenen ve analiz için çok küçük. Buna ek olarak, bazı genler mutasyon embriyo ölümcül5embriyo bu genlerin rol gösteren, neden olabilir. Embriyo ölümcül mutantlar Desen oluşumu karakterizasyonu sayede embriyo gelişimi temel genler düzenleyen moleküler mekanizması anlamak için bir temel sağlar.
Detaylı bir yöntem burada embriyo Desen oluşumu model bitki Arabidopsis karakterizasyonu için doğrudan mikroskobik gözlem tarafından açıklanmıştır. Yöntem ovule izni bir embriyo mikroskobik gözlem tarafından takip içerir. Embriyo öldürücü bir mutant karakterizasyonu ayrıca açıklanmıştır.
Embriyo farklı gelişim aşamalarında morfolojisi Hoyer’ın çözüm6,7ile temizlenmiş ovules kullanarak doğrudan mikroskobu tarafından belirlenebilir. Böyle ovules bir yüksek Kırılma indisi sergi; Böylece, bu ovule yöntemi temizlenmesi özellikle fark girişim kontrast (DIC) mikroskopi tarafından uyulmalıdır numuneler için avantajlıdır.
Buna ek olarak, belirli bir hücre veya hücreler sınırlı sayıda embriyo sırasında ifade edilir genler imleyicileri bir embriyo hücreleri tanımlamak için kullanılabilir. Bu nedenle, hücre Kimlik belirtimi embriyogenez sırasında ifade confocal lazer mikroskobu tarama kullanarak GFP öğesini işaret proteinlerin izleyerek açıklamalı. Tersine, bir bilinmeyen işlev gen –GFP füzyon embriyogenez sırasında ifade desenini gözlemleyerek embriyo desenlendirme ve o gen ifade arasında bir bağlantı sağlamak ve Arabidopsisembriyo için gerekli olan yeni genlerin tanımlaması kolaylaştırmak.
Burada açıklanan yöntemi de embriyo öldürücü bir mutant fenotip karakterize ve etkilenen gen embriyogenez hücresel düzeyde üzerinde etkisini belirlemek için kullanılabilir. Ayrıca, marker gen ifade deseninin ile birlikte bir karşılaştırma sırasında embriyogenez vahşi tipi ve mutant bitkiler arasında moleküler mekanizmaları ve sinyal yollar embriyogenez8,9‘ ilgili hakkında ipuçları yöntemi yol açabilir. Gerçekten de, naa10 bitkiler için yöntem uygulandı ve mutant hypophysis anormal bölünmesi sırasında embriyo5auxin dağıtım bir değişiklik nedeni olabilir bulundu.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ovule izni hücre bölünmesi tespit ve Morfoloji Arabidopsisembriyogenez sırasında değerlendirilmesi için kullanışlı bir yöntemdir; Bu tekniği kullanarak, embriyo doğrudan DIC mikroskobu5,12altında görülebilir. Kritik ovule izni için adım 1.3.4 adımdır. Adım 1.3.4 ovule izni için gereken süreyi değişkendir. 12 h sonra belli belirsiz görünüyorlar ise 2/4 hücreli aşamada embriyo Hoyer’ın çözümünde, 2 h sonra açıkça gör?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Dr Jessica Habashi el yazması eleştirel okuma için teşekkür ederiz. Dr. Xianyong Sheng görüntüleme Merkezi, yaşam bilimleri, sermaye Normal Üniversitesi (Pekin, Çin), üniversite DR5-GFP tahlil lokalizasyonu gerçekleştirmek için teşekkür ediyoruz. Bu eser hibe Pekin belediye hükümeti Bilim Vakfı tarafından desteklenmiştir (CIT & TCD20150102) ve ulusal doğal Bilim Vakfı, Çin’den (31600248).
Materials
| Chloral Hydrate | Sigma | 15307 | |
| Murashige and Skoog Basal Medium | Sigma | M5519 | |
| Phytagel | Sigma | P8169 | |
| Hygromycin | Roche | 10843555001 | |
| Growth chamber | Percival | CU36L5 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss Oberkochen | Zeiss Image M2 | camera: AxioCam 506 color |
| Confocal Laser Scanning Microscopy | Zeiss Oberkochen | Zeiss LSM 5 | filters: BP 495-555 nm |
| Stereoscope | Zeiss Oberkochen | Axio Zoom V16 | camera: AxioCam MRc5 |
| nutrient-rich soil | KLASMANN, Germany | ||
| 50-ml tube | Corning Inc. | ||
| 1.5-ml tube | Corning Inc. | ||
| 10% sodium hypochlorite solution | Domestic analytical reagent | ||
| sucrose | Domestic analytical reagent | ||
| KOH | Domestic analytical reagent | ||
| glycerol | Domestic analytical reagent | ||
| culture dish | Domestic supplies | ||
| vermiculite | Domestic supplies | ||
| glass slide | Domestic supplies | ||
| syringe needle | Domestic supplies | ||
| fine-tipped tweezers | Domestic supplies | ||
| super clean bench | Domestic equipment | ||
Riferimenti
- Jenik, P. D., Gillmor, C. S., Lukowitz, W. Embryonic patterning in Arabidopsis thaliana. Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 207-236 (2007).
- Lau, S., Slane, D., Herud, O., Kong, J., Jurgens, G. Early embryogenesis in flowering plants: setting up the basic body pattern. Annu Rev Plant Biol. 63, 483-506 (2012).
- Wendrich, J. R., Weijers, D. The Arabidopsis embryo as a miniature morphogenesis model. New Phytol. 199 (1), 14-25 (2013).
- ten Hove, C. A., Lu, K. J., Weijers, D. Building a plant: cell fate specification in the early Arabidopsis embryo. Development. 142 (3), 420-430 (2015).
- Feng, J., et al. Protein N-terminal acetylation is required for embryogenesis in Arabidopsis. J Exp Bot. 67 (15), 4779-4789 (2016).
- Berleth, T., Jurgens, G. The role of the monopteros gene in organising the basal body region of the Arabidopsis embryo. Development. 118, 575-587 (1993).
- Luo, Y., et al. D-myo-inositol-3-phosphate affects phosphatidylinositol-mediated endomembrane function in Arabidopsis and is essential for auxin-regulated embryogenesis. Plant Cell. 23 (4), 1352-1372 (2011).
- Nodine, M. D., Yadegari, R., Tax, F. E. RPK1 and TOAD2 are two receptor-like kinases redundantly required for Arabidopsis embryonic pattern formation. Dev Cell. 12 (6), 943-956 (2007).
- Ulmasov, T., Murfett, J., Hagen, G., Guilfoyle, T. J. Aux/IAA proteins repress expression of reporter genes containing natural and highly active synthetic auxin response elements. Plant Cell. 9 (11), 1963-1971 (1997).
- Friml, J., et al. Efflux-dependent auxin gradients establish the apical-basal axis of Arabidopsis. Nature. 426 (6963), 147-153 (2003).
- Clough, S. J., Bent, A. F. Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16 (16), 735-743 (1998).
- Fiume, E., Fletcher, J. C. Regulation of Arabidopsis embryo and endosperm development by the polypeptide signaling molecule CLE8. Plant Cell. 24 (3), 1000-1012 (2012).
- Jurkuta, R. J., Kaplinsky, N. J., Spindel, J. E., Barton, M. K. Partitioning the apical domain of the Arabidopsis embryo requires the BOBBER1 NudC domain protein. Plant Cell. 21 (21), 1957-1971 (2009).
