シロイヌナズナの胚発生の特性評価法
Summary
このプロトコルでは、顕微鏡下で胚パターン形成の検査続く胚珠クリアランスを介してシロイヌナズナの胚発生を観察するためのメソッドについて説明します。
Abstract
彼らの開発の高い予測可能な性質を与えられて、シロイヌナズナ胚として使用されている、モデル植物の形態形成の研究。ただし、早い段階の植物の胚は小さく、観察・分析が困難、ほとんどの細胞を含みません。モデル生物のシロイヌナズナを用いた顕微鏡下で植物胚におけるパターン形成の手法が記載されています。ホイヤーのソリューションを使用して新鮮な胚珠のクリアランス、胚の形態と細胞数の観察、発達段階には、微分干渉顕微鏡倍油浸漬レンズ 100 を使用してによって決められるかもしれません。また、タグ付きの緑色蛍光タンパク質 (GFP) と特定のマーカー蛋白質の表現は、共焦点レーザ走査型顕微鏡により胚形成の間にセル identity の指定に注釈を付ける監視だった。したがって、細胞・分子レベルでは、野生型植物胚におけるパターン形成を観察して野生型植物胚致死突然変異胚におけるパターン形成を比較することによって胚パターン形成における特定遺伝子の役割を特徴付けるには、このメソッドを使用できます。したがって、メソッドは、シロイヌナズナの胚発生の特性評価に使用できます。
Introduction
胚より高い植物の開発の最も早いイベントです。細胞分裂と分化厳格な遺伝子管理1,2の下で受精卵から胚形態。シロイヌナズナの胚は、胚発生の間に細胞分裂の順序が予想されるパターンは3,4あるため形態形成の制御の研究に有用なモデルです。ただし、複数のセルを 1 つを含むシロイヌナズナ胚は観察して分析するのには小さすぎます。さらに、ある特定の遺伝子の突然変異は胚致死5胚のそれらの遺伝子の重要な役割を示す可能性があります。胚致死突然変異体におけるパターン形成の解析という必須遺伝子は胚発生を調節する分子機構を理解するための基礎を提供します。
詳細な方法は、直接顕微鏡観察によってモデル植物シロイヌナズナの胚パターン形成の特性評価のためここで記述されます。メソッドには、胎児の観察に続いて胚珠クリアランスが含まれます。胚致死突然変異体の特性評価についても述べる.
さまざまな発達段階で胚の形態は、ホイヤーのソリューション6,7でクリアされている胚珠を使用して顕微鏡による直接決定できます。このような胚珠展示高屈折;したがって、メソッドをクリアこの胚珠は差動干渉の対照 (DIC) 顕微鏡で観察する必要があります標本で特に有利です。
さらに、胚発生時に特定のセルまたはセルの限られた数で表現される遺伝子は、胚の細胞を識別するマーカーとして使用できます。したがって、共焦点レーザ走査型顕微鏡を使用してマーカーの GFP 付けられた蛋白質の発現を監視することによって胚発生の間に細胞の identity の指定を付けることができます。逆に、胚発生中に不明な機能遺伝子 –GFP融合の発現パターンを観察し、胚のパターン形成とその遺伝子の発現の間のリンクを提供できますシロイヌナズナの胚発生に必要な新しい遺伝子の同定を容易にします。
ここで説明する方法は、胚致死性の変異体の表現型を特徴付けると胚細胞レベルでの影響を受けた遺伝子の影響を判断するにも使えます。さらに、野生型と変異型の植物間の胚発生中にマーカー遺伝子の発現パターンの比較と組み合わせて、メソッドは胚8,9に関与するシグナル伝達経路の分子機構についての手がかりを得ることができます。確かに、 naa10の植物に適用した、変異における脳下垂体の異常分裂が胚5中のオーキシンの分布の変化によって引き起こされることが分かった。
Protocol
Representative Results
Discussion
胚珠のクリアランスは、細胞分裂を検出およびシロイヌナズナの胚の形態を評価するための便利なメソッドこの手法を使用して、胚が DIC 顕微鏡5,12の下で直接観察できます。胚珠のクリアランスのための重要なステップは、1.3.4 のステップです。1.3.4 の手順で胚珠クリアランスに必要な時間変数です。2/4 細胞期胚はホイヤーのソリューショ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
博士ジェシカ Habashi は、批判的に読む原稿を感謝いたします。私たちはDR5 GFPの試金のローカリゼーションを実行するイメージング センター、ライフ サイエンス、首都師範大学 (中国北京) の大学の博士 Xianyong 盛を感謝します。この作品は北京市政府科学財団からの助成金によって支えられた (CIT & TCD20150102)、中国の国家自然科学基金 (31600248) から。
Materials
| Chloral Hydrate | Sigma | 15307 | |
| Murashige and Skoog Basal Medium | Sigma | M5519 | |
| Phytagel | Sigma | P8169 | |
| Hygromycin | Roche | 10843555001 | |
| Growth chamber | Percival | CU36L5 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss Oberkochen | Zeiss Image M2 | camera: AxioCam 506 color |
| Confocal Laser Scanning Microscopy | Zeiss Oberkochen | Zeiss LSM 5 | filters: BP 495-555 nm |
| Stereoscope | Zeiss Oberkochen | Axio Zoom V16 | camera: AxioCam MRc5 |
| nutrient-rich soil | KLASMANN, Germany | ||
| 50-ml tube | Corning Inc. | ||
| 1.5-ml tube | Corning Inc. | ||
| 10% sodium hypochlorite solution | Domestic analytical reagent | ||
| sucrose | Domestic analytical reagent | ||
| KOH | Domestic analytical reagent | ||
| glycerol | Domestic analytical reagent | ||
| culture dish | Domestic supplies | ||
| vermiculite | Domestic supplies | ||
| glass slide | Domestic supplies | ||
| syringe needle | Domestic supplies | ||
| fine-tipped tweezers | Domestic supplies | ||
| super clean bench | Domestic equipment | ||
Riferimenti
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