Een methode voor het karakteriseren van de embryogenese Arabidopsis
Summary
Dit protocol beschrijft een methode voor de waarneming van de embryogenese Arabidopsis via zaadknop goedkeuring, gevolgd door de inspectie van embryo patroonformatie onder een microscoop.
Abstract
Gezien het zeer voorspelbare karakter van hun ontwikkeling, zijn Arabidopsis embryo’s gebruikt als een model voor studies van genuitdrukking in planten. Echter vroeg stadium plant embryo’s zijn klein en bevatten weinig cellen, waardoor ze moeilijk te observeren en te analyseren. Een methode is hier beschreven voor het karakteriseren van patroonformatie in plant embryo’s onder een microscoop met behulp van de model-organisme Arabidopsis. Na de goedkeuring van de verse zaadknoppen met behulp van Hoyer de oplossing, het mobiele nummer in en morfologie van embryo’s kon worden waargenomen en hun ontwikkelingsstadium door differentiële interferentie contrast microscopie met behulp van een 100 X olie-immersie objectief kan worden vastgesteld. Bovendien was de expressie van specifieke marker eiwitten gelabeld met Green Fluorescent Protein (GFP) gecontroleerd om te annoteren cel identiteit specificatie tijdens embryo patronen door confocale laser scanning microscopie. Dus, deze methode kan worden gebruikt om te observeren patroonformatie in wild-type plant embryo’s de cellulaire en moleculaire niveau, en te karakteriseren van de rol van specifieke genen in embryonale patronen door het vergelijken van patroonformatie in embryo’s van wild-type planten en embryo-dodelijke mutanten. Daarom kan de methode worden gebruikt om te karakteriseren embryogenese Arabidopsis.
Introduction
Embryogenese is de vroegste gebeurtenis in de ontwikkeling van hogere planten. Een volwassen embryo vormt van een zygote door celdeling- en differentiatie onder strenge controle van de genetische1,2. Arabidopsis embryo’s zijn een nuttig model voor de controle op de voedselproductie studeren omdat de volgorde van de celdelingen tijdens de embryogenese een verwachte patroon3,4 volgt. Een embryo van Arabidopsis met één tot meerdere cellen is echter te klein om te worden waargenomen en geanalyseerd. Bovendien kan de mutatie van bepaalde genen embryo letaliteit5, met vermelding van de sleutelrol van die genen in embryogenese veroorzaken. De karakterisering van patroonformatie in de embryo-dodelijke mutanten biedt een basis voor het begrijpen van het moleculaire mechanisme waarbij essentiële genen embryo-ontwikkeling reguleren.
Een gedetailleerde methode wordt hier beschreven voor de karakterisatie van embryo patroonformatie in de model plant Arabidopsis met directe microscopische observatie. Bij deze methode wordt de zaadknop goedkeuring, gevolgd door de microscopische observatie van een embryo. De karakterisering van een embryo-dodelijke mutant wordt ook beschreven.
De morfologie van de embryo’s op verschillende ontwikkelingsstadia kan direct door microscopie met behulp van de zaadknoppen die zijn gewist met7-Hoyer van oplossing6,worden bepaald. Dergelijke zaadknoppen vertonen een hoge brekingsindex; Deze zaadknop clearing methode is dus vooral voordelig voor specimens die moeten worden nageleefd door differentiële interferentie contrast (DIC) microscopie.
Daarnaast is de genen die worden uitgedrukt in een bepaalde cel of een beperkt aantal cellen tijdens de embryogenese inzetbaar als markeringen te identificeren van de cellen in het embryo. Daarom kan de cel identiteit specificatie tijdens de embryogenese geannoteerde worden door het toezicht op de expressie van marker GFP-gelabelde proteïnen met behulp van confocale laser scanning microscopie. Omgekeerd, observeren het expressiepatroon van een onbekende functioneel gen –GFP fusion tijdens de embryogenese kan beschikken over een koppeling tussen embryo patronen en de uitdrukking van dit gen, en vergemakkelijken de identificatie van nieuwe genen die vereist voor embryogenese Arabidopsis zijn.
De hier beschreven methode kan ook worden gebruikt om karakteriseren het fenotype van een embryo-dodelijke mutant, te bepalen en het effect van het betrokken gen op embryogenese op cellulair niveau. Bovendien kan de methode in combinatie met een vergelijking van het expressiepatroon van markers tijdens de embryogenese tussen wild-type en mutant planten, aanwijzingen over de moleculaire mechanismen en signaalroutes betrokken bij embryogenese8,9opleveren. Inderdaad, de methode werd toegepast op naa10 planten, en het bleek dat de abnormale verdeling van de hypophysis in de mutant kan worden veroorzaakt door een wijziging in de verdeling van de auxine tijdens de embryogenese5.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zaadknop klaring is een handige methode voor het opsporen van de celdeling en morfologie beoordelen tijdens de embryogenese Arabidopsis; met behulp van deze techniek, kunnen direct onder DIC microscopie5,12embryo’s worden waargenomen. De kritieke stap voor zaadknop goedkeuring is stap 1.3.4. De tijd die nodig is voor de zaadknop mijnen in stap 1.3.4 is variabel. Embryo’s in het stadium van 2/4-cel duidelijk waarneembaar na 2U in van de Hoyer oplossing, t…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Dr. Jessica Habashi voor het kritisch lezen van het manuscript. Wij danken Dr. Xianyong Sheng van het Imaging Center, College van de biowetenschappen, hoofdstad Normal University (Peking, China), voor het uitvoeren van de lokalisatie van DR5-GFP assay. Dit werk werd gesteund door subsidies van de Beijing Municipal regering Science Foundation (CIT & TCD20150102) en van de nationale Natural Science Foundation van China (31600248).
Materials
| Chloral Hydrate | Sigma | 15307 | |
| Murashige and Skoog Basal Medium | Sigma | M5519 | |
| Phytagel | Sigma | P8169 | |
| Hygromycin | Roche | 10843555001 | |
| Growth chamber | Percival | CU36L5 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss Oberkochen | Zeiss Image M2 | camera: AxioCam 506 color |
| Confocal Laser Scanning Microscopy | Zeiss Oberkochen | Zeiss LSM 5 | filters: BP 495-555 nm |
| Stereoscope | Zeiss Oberkochen | Axio Zoom V16 | camera: AxioCam MRc5 |
| nutrient-rich soil | KLASMANN, Germany | ||
| 50-ml tube | Corning Inc. | ||
| 1.5-ml tube | Corning Inc. | ||
| 10% sodium hypochlorite solution | Domestic analytical reagent | ||
| sucrose | Domestic analytical reagent | ||
| KOH | Domestic analytical reagent | ||
| glycerol | Domestic analytical reagent | ||
| culture dish | Domestic supplies | ||
| vermiculite | Domestic supplies | ||
| glass slide | Domestic supplies | ||
| syringe needle | Domestic supplies | ||
| fine-tipped tweezers | Domestic supplies | ||
| super clean bench | Domestic equipment | ||
Riferimenti
- Jenik, P. D., Gillmor, C. S., Lukowitz, W. Embryonic patterning in Arabidopsis thaliana. Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 207-236 (2007).
- Lau, S., Slane, D., Herud, O., Kong, J., Jurgens, G. Early embryogenesis in flowering plants: setting up the basic body pattern. Annu Rev Plant Biol. 63, 483-506 (2012).
- Wendrich, J. R., Weijers, D. The Arabidopsis embryo as a miniature morphogenesis model. New Phytol. 199 (1), 14-25 (2013).
- ten Hove, C. A., Lu, K. J., Weijers, D. Building a plant: cell fate specification in the early Arabidopsis embryo. Development. 142 (3), 420-430 (2015).
- Feng, J., et al. Protein N-terminal acetylation is required for embryogenesis in Arabidopsis. J Exp Bot. 67 (15), 4779-4789 (2016).
- Berleth, T., Jurgens, G. The role of the monopteros gene in organising the basal body region of the Arabidopsis embryo. Development. 118, 575-587 (1993).
- Luo, Y., et al. D-myo-inositol-3-phosphate affects phosphatidylinositol-mediated endomembrane function in Arabidopsis and is essential for auxin-regulated embryogenesis. Plant Cell. 23 (4), 1352-1372 (2011).
- Nodine, M. D., Yadegari, R., Tax, F. E. RPK1 and TOAD2 are two receptor-like kinases redundantly required for Arabidopsis embryonic pattern formation. Dev Cell. 12 (6), 943-956 (2007).
- Ulmasov, T., Murfett, J., Hagen, G., Guilfoyle, T. J. Aux/IAA proteins repress expression of reporter genes containing natural and highly active synthetic auxin response elements. Plant Cell. 9 (11), 1963-1971 (1997).
- Friml, J., et al. Efflux-dependent auxin gradients establish the apical-basal axis of Arabidopsis. Nature. 426 (6963), 147-153 (2003).
- Clough, S. J., Bent, A. F. Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16 (16), 735-743 (1998).
- Fiume, E., Fletcher, J. C. Regulation of Arabidopsis embryo and endosperm development by the polypeptide signaling molecule CLE8. Plant Cell. 24 (3), 1000-1012 (2012).
- Jurkuta, R. J., Kaplinsky, N. J., Spindel, J. E., Barton, M. K. Partitioning the apical domain of the Arabidopsis embryo requires the BOBBER1 NudC domain protein. Plant Cell. 21 (21), 1957-1971 (2009).
