Un método para la caracterización de embriogénesis en Arabidopsis
Summary
Este protocolo describe un método para la observación de embriogénesis en Arabidopsis vía separación de óvulo, seguido por la inspección de la formación de patrones de embrión bajo un microscopio.
Abstract
Dada la naturaleza altamente predecible de su desarrollo, embriones de Arabidopsis se han utilizado como modelo de estudios de morfogénesis en plantas. Sin embargo, embriones en fase temprana de plantas son pequeños y contienen pocas células, haciéndolas difíciles de observar y analizar. Aquí se describe un método para caracterizar la formación de embriones de la planta bajo el microscopio utilizando el organismo modelo Arabidopsis. Tras la separación de óvulos frescos usando solución de Hoyer, pudieran observarse el número de celular de y morfología de los embriones, y su etapa de desarrollo podría ser determinado por microscopía de contraste de interferencia diferencial usando un 100 X lente de inmersión de aceite. Además, la expresión de proteínas del marcador específico etiquetadas con proteína fluorescente verde (GFP) fue supervisada para anotar la especificación de identidad de la célula durante el dibujo de embrión por microscopía de láser confocal. Así, este método puede utilizarse para observar la formación de embriones de la planta de tipo salvaje a nivel celular y molecular y caracterizar el papel de genes específicos en modelar embrionario mediante la comparación de la formación de patrones en los embriones de las plantas de tipo silvestre y mutantes letales para el embrión. Por lo tanto, el método puede utilizarse para caracterizar la embriogénesis en Arabidopsis.
Introduction
Embriogénesis es el evento más temprano en el desarrollo de las plantas superior. Una forma de embriones maduros de un cigoto por división celular y diferenciación bajo estricto control genético1,2. Embriones de Arabidopsis son un modelo útil para estudiar el control de la morfogénesis porque la secuencia de divisiones celulares durante la embriogénesis sigue un patrón esperado3,4. Sin embargo, un embrión de Arabidopsis con una a varias células es demasiado pequeño para ser observado y analizado. Además, la mutación de ciertos genes puede causar embrión letalidad5, que indica el papel clave de estos genes en la embriogénesis. La caracterización de la formación de patrones en los mutantes letales para el embrión constituye una base para entender el mecanismo molecular por el que genes esenciales regulan el desarrollo embrionario.
Un método detallado se describe aquí para la caracterización de la formación de patrón del embrión en la planta modelo Arabidopsis por observación microscópica directa. El método implica la separación del óvulo seguido por la observación microscópica de un embrión. También se describe la caracterización de un mutante letal para el embrión.
La morfología de los embriones en diferentes etapas de desarrollo se puede determinar directamente por microscopia con los óvulos que han sido borrados solución6,7 de Hoyer. Estos óvulos exhiben un alto índice de refracción; así, este óvulo claro método es especialmente ventajoso para las muestras que deben ser observadas por microscopia de interferencia diferencial (DIC) de contraste.
Además, los genes que se expresan en una celda determinada o un número limitado de células durante la embriogénesis pueden utilizarse como marcadores para identificar las células en un embrión. Por lo tanto, la especificación de identidad celular durante la embriogénesis se puede anotar mediante el control de la expresión de proteínas del marcador etiquetado GFP utilizando microscopía de láser confocal. Por el contrario, observando el patrón de expresión de un gen funcional desconocida –GFP fusion durante la embriogénesis puede proporcionar un vínculo entre patrones de embrión y la expresión de ese gen y facilitar la identificación de nuevos genes que se requieren para la embriogénesis en Arabidopsis.
El método aquí descrito puede utilizarse también para caracterizar el fenotipo de un mutante letal para el embrión y para determinar el impacto del gen afectado en la embriogénesis a nivel celular. Además, en combinación con una comparación de los patrones de expresión de genes marcadores durante la embriogénesis entre plantas tipo salvaje y mutantes, el método puede producir pistas sobre los mecanismos moleculares y las vías de señalización implicadas en la embriogénesis8,9. De hecho, el método fue aplicado a las plantas de naa10 , y se encontró que la división anormal de la hipófisis en el mutante puede ser causada por un cambio en la distribución de la auxina durante embriogénesis5.
Protocol
Representative Results
Discussion
Óvulo es un método útil para detectar la división celular y la evaluación de morfología durante la embriogénesis en Arabidopsis; usando esta técnica, embriones pueden ser observados directamente bajo DIC microscopía5,12. El paso crítico para la remoción del óvulo es paso 1.3.4. El tiempo requerido para la remoción del óvulo en el paso 1.3.4 es variable. Embriones en la etapa de 2/4-cell pueden observarse claramente después de 2 h en soluci…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Dr. Jessica Habashi para la lectura crítica del manuscrito. Agradecemos a Dr. Xianyong Sheng de la centro de la imagen, Facultad de Ciencias de la vida, Capital Normal University (Beijing, China), para realizar la localización de ensayo DR5-GFP . Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación de Ciencias de Gobierno Municipal de Beijing (CIT & TCD20150102) y de la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (31600248).
Materials
| Chloral Hydrate | Sigma | 15307 | |
| Murashige and Skoog Basal Medium | Sigma | M5519 | |
| Phytagel | Sigma | P8169 | |
| Hygromycin | Roche | 10843555001 | |
| Growth chamber | Percival | CU36L5 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss Oberkochen | Zeiss Image M2 | camera: AxioCam 506 color |
| Confocal Laser Scanning Microscopy | Zeiss Oberkochen | Zeiss LSM 5 | filters: BP 495-555 nm |
| Stereoscope | Zeiss Oberkochen | Axio Zoom V16 | camera: AxioCam MRc5 |
| nutrient-rich soil | KLASMANN, Germany | ||
| 50-ml tube | Corning Inc. | ||
| 1.5-ml tube | Corning Inc. | ||
| 10% sodium hypochlorite solution | Domestic analytical reagent | ||
| sucrose | Domestic analytical reagent | ||
| KOH | Domestic analytical reagent | ||
| glycerol | Domestic analytical reagent | ||
| culture dish | Domestic supplies | ||
| vermiculite | Domestic supplies | ||
| glass slide | Domestic supplies | ||
| syringe needle | Domestic supplies | ||
| fine-tipped tweezers | Domestic supplies | ||
| super clean bench | Domestic equipment | ||
Riferimenti
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