Denna video visar en procedur för att generera neuronala kulturer från slutet av embryot och tidiga postnatala mus cortex. Dessa kulturer kan användas för immuncytokemi, biokemi, elektrofysiologi, kalcium och natrium bildbehandling och tillhandahålla en plattform för att studera nervsystemets utveckling av transgena djur som bär en postnatal dödliga genmutation.
Abstract
Denna video kommer att guida dig genom processen för att skapa kortikala neuronala kulturer från slutet av embryot och tidiga postnatala musen hjärnan. Dessa kulturer kan användas för en mängd olika tillämpningar, inklusive immuncytokemi, biokemi, elektrofysiologi, kalcium och natrium bildbehandling, protein och / eller RNA isolering. Dessa kulturer ger också en plattform för att studera nervsystemets utveckling av transgena djur som bär en sen embryonal eller postnatal dödliga genmutation. Förfarandet är relativt rakt fram, kräver en del erfarenhet av vävnadsodling teknik och bör inte ta längre än två till tre timmar om du är ordentligt förberedd. Noggrann separation av kortikala svålen från thalamo-kortikala fiber tarmkanalen kommer att minska antalet oönskade icke-neuronala celler. För att öka avkastningen av neuronala celler mal sönder bitar av kortikala vävnaden försiktigt efter enzymet inkuberingssteget. Detta är viktigt eftersom det förhindrar onödig skada på celler och för tidig nervcellsdöd. Eftersom dessa kulturer upprätthålls i avsaknad av celler Glia feeder, de erbjuder även en extra fördel att växa kulturer anrikas i nervceller.
Protocol
Förberedelser inför dagen i odling: Förbered steril dissekera lösning (DS). Förbered NBM/B27 (Neurobasal Mediom med B27 tillskott). Autoklav DDH 2 O och sterilisera glas coversilps, om det behövs. Coat vävnadskultur rätter eller täckglas glas med poly-D-lysin. Poly-D-Lysin Beläggning: Förbered dagen innan odling under sterila förhållanden. Tina alikvot av 10X PDL och placera på is. <…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Materials
Material Name
Tipo
Company
Catalogue Number
Comment
5-Fluoro-2′-deoxyuridine
Sigma
F0503
Sodium Chloride
Sigma
S9625
Vibraslicer
Campden Instruments Ltd.
Potassim Chloride
Sigma
P4504
Sodium Phosphate Dibasic
Sigma
S0876
Potassium Phosphate Monobasic
Sigma
P5379
Hepes
Sigma
H3375
D (+)-Glucose
Sigma
G8270
Sucrose
Sigma
S0389
Poly-D-Lysine
Sigma
P7280
B27 Supplement
Invitrogen (Gibco)
17504-044
Neurobasal Media (NBM)
Invirtogen (Gibco)
21103-049
2-Amino-5-phosphonopentanoic acid
Sigma
A5282
Bovine Albumin
Sigma
A7030
Trypsin Inhibitor
Sigma
T9253
Sodium Hydroxide, 1N solution
Fisher
SS266-1
L-Cysteine
Sigma
C7755
Bacto Agar
Difco
0140-01
Papain
Worthington
LS 03126
Sterile 0.2 µm Syringe Filter
Fisher
DDA02025S0
Glass Coverslips, No1, Ø12mm
Bellco Glass Inc.
1943-00012
Minimum Essential Media (MEM)
Invitrogen (Gibco)
11090-081
with Earle’s salts
without L-glutamine, needed for growing non-neuronal cultures
Penicillin/Streptomycin
Invitrogen (Gibco)
15070-063
for non-neuronal culture
Fetal Bovine Serum
Invitrogen (Gibco)
16140-071
needed for non-neuronal cultures
Nunclon “Triple Flask” Tissue Culture Bottle
Fisher
12-565-25
Use for non-neuronal cultures. these flasks are very convenient when producing “conditioned Neurobasal Media/B27”, but any other tissue culture flasks or dishes can be used instead.
Glass bottom “Imaging dishes”
MatTek Corp.
P35G-1.5-10-C
Glass bottomed, Ø35mm culture dishes ideal for Calcium or Sodium Imaging when using an inverted imaging setup. But expensive!