Questo video mostra una procedura per la generazione di culture neuronali dall'embrione fine e l'inizio della corteccia del mouse postnatale. Queste culture possono essere utilizzati per immunocitochimica, biochimica, elettrofisiologia, calcio e sodio di imaging e di fornire una piattaforma per studiare lo sviluppo neuronale di animali transgenici che portano una mutazione genetica postnatale letale.
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Articolo metodologico
Preparazione del dissociato Culture Neuron mouse corticale
In questo articolo
Sommario
Abstract
Questo video vi guiderà attraverso il processo per la generazione di neuroni corticali culture dall'embrione fine e l'inizio del cervello di topo postnatale. Queste culture può essere utilizzato per una varietà di applicazioni, tra cui immunocitochimica, biochimica, elettrofisiologia, imaging di calcio e sodio, proteine e / o RNA isolamento. Queste culture anche fornire una piattaforma per studiare lo sviluppo neuronale di animali transgenici che portano una mutazione in ritardo embrionale o postnatale gene letale. La procedura è relativamente semplice, richiede una certa esperienza nelle tecniche di coltura e non dovrebbe richiedere più di due o tre ore se si è adeguatamente preparati. Un'attenta separazione della crosta corticale dal talamo-corticale del tratto di fibra ridurrà il numero degli indesiderati cellule non neuronali. Per aumentare la resa delle cellule neuronali triturare i pezzi del tessuto corticale delicatamente dopo la fase di incubazione dell'enzima. Questo è indispensabile in quanto previene inutili danni alle cellule e la morte prematura delle cellule neuronali. Dato che queste colture sono mantenute in assenza di cellule di alimentazione glia, offrono anche un vantaggio aggiunto di culture crescente arricchito nei neuroni.
Protocollo
I preparativi prima del giorno di coltura:
- Preparare soluzione sterile dissezione (DS).
- Preparare NBM/B27 (Mediom Neurobasal con supplementi di B27).
- Autoclave DDH 2 O e sterilizzare coversilps vetro, se necessario.
- Cappotto tessuto piatti cultura o coprioggetto di vetro con poli-D-lisina.
Poli-D-lisina Coating:
Preparare il giorno prima della coltura in condizioni di sterilità.
- Aliquota del disgelo PDL 10X e posto sul ghiaccio.
- Aggiungere 9 ml sterile ultra-filtrata acqua a 1 ml di PDL e mescolare bene (1X).
- Superfici cappo....
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da dichiarare.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 5-Fluoro-2’-deossiuridina | Sigma-Aldrich | F0503 | |
| Cloruro di sodio | Sigma-Aldrich | S9625 | |
| Vibraslicer | Campden Instruments | ||
| Cloruro di potassio | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Fosfato di sodio bibasico | Sigma-Aldrich | S0876 | |
| Fosfato di potassio monobasico | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| D(+)-Glucosio | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Saccarosio | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Poli-D-lisina | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| Supplemento B27 | Invitrogen | 17504-044 | |
| Mezzo Neurobasale (NBM) | Invitrogen | 21103-049 | |
| Acido 2-ammino-5-fosfonopentanoico | Sigma-Aldrich | A5282 | |
| Albumina bovina | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Inibitore della tripsina | Sigma-Aldrich | T9253 | |
| Soluzione di idrossido di sodio 1N | Fisher Scientific | SS266-1 | |
| L-Cisteina | Sigma-Aldrich | C7755 | |
| Bacto Agar | Difco Laboratories | 0140-01 | |
| Papaina | Worthington Biochemical | LS 03126 | |
| Filtro per siringa sterile da 0,2 μm | Fisher Scientific | DDA02025S0 | |
| Coverslip di vetro, No1, 12 mm | Bellco Glass | 1943-00012 | |
| Mezzo Minimo Essenziale (MEM) | Invitrogen | 11090-081 | con sali di Earle’s senza L-glutammina, necessario per la coltivazione di colture non neuronali |
| Penicillina/Streptomicina | Invitrogen | 15070-063 | per colture non neuronali |
| Siero fetale bovino | Invitrogen | 16140-071 | necessario per colture non neuronali |
| Flacone per colture cellulari Nunclon "Triple Flask" | Fisher Scientific | 12-565-25 | Da utilizzare per colture non neuronali. Questi flaconi sono molto comodi per produrre "mezzo Neurobasale/B27 condizionato", ma possono essere usati anche altri flaconi o piastre per colture cellulari. |
| Piastre per imaging con fondo in vetro "Imaging dishes" | MatTek Corp. | P35G-1.5-10-C | Piastre per colture da 35 mm con fondo in vetro, ideali per l'imaging del calcio o del sodio quando si utilizza un sistema di imaging invertito. Ma costose! |
Ristampe e permessi
