解離マウス皮質ニューロンの培養の準備

Summary

このビデオでは、後期胚と早期出生後のマウス皮質からニューロン培養を生成するための手順を示しています。これらの培養物は、免疫細胞化学、生化学、電気生理学、カルシウムとナトリウムのイメージングに使用され、出生後致死遺伝子の突然変異を運ぶトランスジェニック動物の神経発達を研究するためのプラットフォームを提供することができます。

Abstract

このビデオでは、後期胚と早期出生後マウス脳から皮質ニューロン培養を生成するためのプロセスをガイドします。これらの培養物は、免疫細胞化学、生化学、電気生理学、カルシウムやナトリウムイメージング、蛋白質および/またはRNA分離など、様々なアプリケーションに使用することができます。これらの文化はまた、後期胚または出生後致死遺伝子の突然変異を運ぶトランスジェニック動物の神経発達を研究するためのプラットフォームを提供しています。手順は比較的単純であり、組織培養技術のいくつかの経験を必要とし、あなたが適切に準備されている場合2〜3時間を上回ってはいけません。視床皮質線維路から皮質外皮を慎重に分離が不要な非神経細胞の数が削減されます。上げるには神経細胞の収量は、酵素インキュベーションステップの後に優しく皮質組織片を砕いて粉にする。それが細胞や未熟神経細胞死への不必要な傷害を防ぐため、これは不可欠です。これらの文化は、グリア細胞のフィーダー細胞の非存在下で維持されているので、彼らはまた、神経細胞に富む成長する文化の付加的な利点を提供します。

Protocol

培養の一日前の準備： 無菌解剖ソリューション（DS）を準備する。 NBM/B27（B27サプリメントとNeurobasal Mediom）を準備する。 オートクレーブのddH 2 O及び必要に応じて、ガラスのcoversilpsを滅菌する。 ポリ- D -リジンでコーティングの組織培養皿またはガラス製カバースリップ。 ポリ- D -リジンコーティング： 無菌条…

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
5-Fluoro-2′-deoxyuridine		Sigma	F0503
Sodium Chloride		Sigma	S9625
Vibraslicer		Campden Instruments Ltd.
Potassim Chloride		Sigma	P4504
Sodium Phosphate Dibasic		Sigma	S0876
Potassium Phosphate Monobasic		Sigma	P5379
Hepes		Sigma	H3375
D (+)-Glucose		Sigma	G8270
Sucrose		Sigma	S0389
Poly-D-Lysine		Sigma	P7280
B27 Supplement		Invitrogen (Gibco)	17504-044
Neurobasal Media (NBM)		Invirtogen (Gibco)	21103-049
2-Amino-5-phosphonopentanoic acid		Sigma	A5282
Bovine Albumin		Sigma	A7030
Trypsin Inhibitor		Sigma	T9253
Sodium Hydroxide, 1N solution		Fisher	SS266-1
L-Cysteine		Sigma	C7755
Bacto Agar		Difco	0140-01
Papain		Worthington	LS 03126
Sterile 0.2 µm Syringe Filter		Fisher	DDA02025S0
Glass Coverslips, No1, Ø12mm		Bellco Glass Inc.	1943-00012
Minimum Essential Media (MEM)		Invitrogen (Gibco)	11090-081	with Earle’s salts without L-glutamine, needed for growing non-neuronal cultures
Penicillin/Streptomycin		Invitrogen (Gibco)	15070-063	for non-neuronal culture
Fetal Bovine Serum		Invitrogen (Gibco)	16140-071	needed for non-neuronal cultures
Nunclon “Triple Flask” Tissue Culture Bottle		Fisher	12-565-25	Use for non-neuronal cultures. these flasks are very convenient when producing “conditioned Neurobasal Media/B27”, but any other tissue culture flasks or dishes can be used instead.
Glass bottom “Imaging dishes”		MatTek Corp.	P35G-1.5-10-C	Glass bottomed, Ø35mm culture dishes ideal for Calcium or Sodium Imaging when using an inverted imaging setup. But expensive!