Este video muestra un procedimiento para la generación de cultivos neuronales a partir de finales de embriones y la corteza temprana de ratón postnatal. Estos cultivos pueden ser utilizados para inmunocitoquímica, la bioquímica, la electrofisiología, calcio y sodio de imagen y proporcionar una plataforma para estudiar el desarrollo neuronal de los animales transgénicos que portan una mutación del gen letal después del parto.
Abstract
Este video lo guiará en el proceso de generación de cultivos de neuronas corticales de embrión tardío y temprano del cerebro del ratón postnatal. Estas culturas se pueden utilizar para una variedad de aplicaciones, incluyendo la inmunocitoquímica, la bioquímica, la electrofisiología, imágenes de calcio y sodio, proteínas y / o aislamiento de ARN. Estas culturas también proporcionan una plataforma para estudiar el desarrollo neuronal de los animales transgénicos que portan una mutación letal del gen embrionario tardío y postnatal. El procedimiento es relativamente sencillo, requiere de cierta experiencia en la técnica de cultivo de tejidos y no debe tardar más de dos o tres horas si está debidamente preparado. Cuidadosa separación de la corteza cortical del tracto de fibras tálamo-corticales se reducirá el número de embarazos no deseados células no neuronales. Para aumentar la producción de las células neuronales triturar las piezas del tejido cortical suavemente después de la etapa de incubación enzimática. Esto es imprescindible, ya que evita daños innecesarios a las células y la muerte prematura de las células neuronales. Debido a que estos cultivos se mantienen en ausencia de células alimentadoras glía, sino que también ofrecen una ventaja adicional de cultivos en crecimiento enriquecido en las neuronas.
Protocol
Los preparativos antes del día de cultivo: Prepare una solución estéril de disección (DS). Prepare NBM/B27 (Mediom Neurobasal con suplementos B27). Autoclave ddH2O y esterilizar coversilps vidrio, si es necesario. Escudo platos de cultivo de tejidos o cubreobjetos de vidrio con poli-D-lisina. Poli-D-lisina de revestimiento: Preparar el día antes de cultivo en condiciones estériles. Descongel…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Materials
Material Name
Tipo
Company
Catalogue Number
Comment
5-Fluoro-2′-deoxyuridine
Sigma
F0503
Sodium Chloride
Sigma
S9625
Vibraslicer
Campden Instruments Ltd.
Potassim Chloride
Sigma
P4504
Sodium Phosphate Dibasic
Sigma
S0876
Potassium Phosphate Monobasic
Sigma
P5379
Hepes
Sigma
H3375
D (+)-Glucose
Sigma
G8270
Sucrose
Sigma
S0389
Poly-D-Lysine
Sigma
P7280
B27 Supplement
Invitrogen (Gibco)
17504-044
Neurobasal Media (NBM)
Invirtogen (Gibco)
21103-049
2-Amino-5-phosphonopentanoic acid
Sigma
A5282
Bovine Albumin
Sigma
A7030
Trypsin Inhibitor
Sigma
T9253
Sodium Hydroxide, 1N solution
Fisher
SS266-1
L-Cysteine
Sigma
C7755
Bacto Agar
Difco
0140-01
Papain
Worthington
LS 03126
Sterile 0.2 µm Syringe Filter
Fisher
DDA02025S0
Glass Coverslips, No1, Ø12mm
Bellco Glass Inc.
1943-00012
Minimum Essential Media (MEM)
Invitrogen (Gibco)
11090-081
with Earle’s salts
without L-glutamine, needed for growing non-neuronal cultures
Penicillin/Streptomycin
Invitrogen (Gibco)
15070-063
for non-neuronal culture
Fetal Bovine Serum
Invitrogen (Gibco)
16140-071
needed for non-neuronal cultures
Nunclon “Triple Flask” Tissue Culture Bottle
Fisher
12-565-25
Use for non-neuronal cultures. these flasks are very convenient when producing “conditioned Neurobasal Media/B27”, but any other tissue culture flasks or dishes can be used instead.
Glass bottom “Imaging dishes”
MatTek Corp.
P35G-1.5-10-C
Glass bottomed, Ø35mm culture dishes ideal for Calcium or Sodium Imaging when using an inverted imaging setup. But expensive!