Summary
Målet med detta protokoll är att demonstrera en effektiv metod för att decellularize och om avkalkning mus cochleae för utnyttjande som ställningar för tissue engineering program.
Abstract
Hos däggdjur, mechanosensory hårcellerna som underlättar förhandlingen saknar förmågan att regenerera, som har begränsad behandlingar för hörselnedsättning. Nuvarande strategier för regenerativ medicin har fokuserat på transplantation av stamceller eller genetisk manipulation av omgivande stödjeceller i innerörat att uppmuntra utbyte av skadade stamceller att korrigera hörselnedsättning. Men den extracellulär matrixen (ECM) kan spela en viktig roll i inducerande och upprätthålla funktion av hårceller, och har inte undersökts väl. Med hjälp av cochlear kan ECM som en byggnadsställning växa adulta stamceller ge unika insikter i hur sammansättning och arkitekturen av den extracellulära miljön hjälper celler upprätthålla förhandlingen funktion. Här presenterar vi en metod för att isolera och decellularizing cochleae från möss att använda som ställningar att acceptera perfunderade adulta stamceller. I det nuvarande protokollet isoleras cochleae från euthanized möss, cell-lösa och urkalkade permanenta. Efteråt, var mänskliga Wharton's jelly celler (hWJCs) som var isolerade från navelsträngen noggrant perfusion in varje cochlean. Cochleae användes som bioreaktorer och celler odlades i 30 dagar innan de genomgick behandling för analys. Cell-lösa cochleae behöll identifierbar extracellulära strukturer, men avslöja inte förekomsten av celler eller märkbar fragment av DNA. Celler perfusion in i cochlean invaderade de flesta av interiör och exteriör av cochlean och växte utan incidenter under en löptid på 30 dagar. Dagskursmetoden kan således användas för att studera hur cochlear ECM påverkar cell utveckling och beteende.
Introduction
Snäckan är en intrikat spiralstrukturen Funna i tinningbenet. Den består av en yttre benig labyrint och en koncentrisk, inre membranös labyrint1. Membranös labyrinten består av tre flytande utrymmen: Scala vestibuli, Scala media och Scala tympani1. Scala media hus sensoriska epitelet, som består av en mängd celltyper, men sensoriska hårcellerna (HC), som transduce mekanisk energi i ljudvågor till nervimpulser2, är av särskilt intresse. Exponering för akustisk trauma3,4,5, medicinering6, sjukdom7,8och åldrande9 kan alla leda till nedsatt hörsel funktion via HC död. Hår cellförlust hos däggdjur är permanent, till skillnad från aviär HCs, som kan regenerera efter skada10.
En mängd samtida forskningsansträngningar har försökt att återställa förlorade HCs, även om de specifika experimentella metoderna varierar. Manipulation av genuttryck i sensoriska epitelet och implantation av stamcellerna differentierade utanför kroppen är dominerande ansatser inom, men induktion metoder som syftar till att differentiera stamceller till cochlear organoids har varit försökt11,12,13. Alla dessa metoder är antingen direkt beroende av stamceller eller utvecklingsmässiga ledtrådar används av stamceller; dock en andra delade, och potentiellt kritiska, elementet är ECM av snäckan själv14,15.
ECM ger inte bara fysiska stöd för celler och vävnad, som omfattar en yta för celladhesion, spridning, överlevnad och migration, men också spelar avgörande roller i utvecklingen av HCs och spiral ganglion15,16 ,17. Naturligt ger förekommande ECM induktiva signaler som kan vägleda cell fenotyp bestämning eller cell adhesion, spridning och överlevnad18. Därför, användningen av cell-lösa snäckan i kombination med odlade hWJCs erbjuder en unik möjlighet att utforska rollen av ECM och HC regeneration. HWJCs är en lättillgänglig, icke-kontroversiella celltyp som isolerats från mänskliga navelsträngar som beter sig som mesenkymala stamceller19. HWJCs har visat förmågan att skilja ned sensorineural cell härstamningar20,21. Således, det nuvarande protokollet uppgifter om isolering, decellularization och genomblödning av cochleae från C57BL mus slaktkroppar med hWJCs för innerörat vävnadsteknik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden, inklusive djur dödshjälp, genomfördes enligt godkända institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) protokoll (misstänkt #2014-2234) vid University of Kansas Medical Center (KUMC).
Obs: HWJCs isolerades från mänskliga navelsträngar som skänktes av patienter som gett informerat samtycke och prover användes i enlighet med de protokoll som godkänts av University of Kansas mänskliga försökspersoner kommittén (KU-IRB #15402).
1. tinningbenet skörd och snäckan isolering
- Halshugga en lämpligt euthanized, 15 veckor gamla musen genom att skära mellan skallen och första halskotan med en kraftig kirurgisk sax och sedan spraya ner huvudet med 70% etanol att desinficera (figur 1A).
- Tudela skallen i ett mitten-sagittalt plan med samma skarpa par kirurgisk sax (figur 1B-C, streckade linjer).
- Ta bort hjärnvävnad från skallen med hjälp av ett par pincett (figur 1 d, pilspets).
- Identifiera tinningbenet genom närvaron av de auditiva och vestibulära nerven rotar (figur 1E-F, pilspetsar) på insidan av skallen och hörselgången från utsidan (figur 1F, pil). Skär försiktigt genom skallen att isolera tinningbenet från resten av skallen (figur 1 g).
Obs: I vissa fall kan det vara möjligt att försiktigt bända omgivande ben i skallen från tinningbenet utan att skära. - In fina tången i hörselgången ca 5 mm (figur 1 H), öppning så tipsen inte riskerar punktera snäckan. Försiktigt bryta öppna ben av bulla (figur 1 H, top röd skuggade området) så det frakturer (figur 1I, röda prickade linjen).
Obs: Om det behövs, dissektion Mikroskop får stöd i denna process att säkerställa exakt placering och manipulation av instrument. - Med fin pincett, bända bort resten av bulla från tinningbenet, utsätta beniga labyrinten av snäckan (figur 1J, röda parentes).
- Placera en petriskål som är stor nog att rymma tinningbenet (t.ex., 30 mm eller större) under den dissekera omfattning synfält och fyll den med tillräckligt fosfat buffrad saltlösning (PBS) att täcka tinningbenet (t.ex., 0,5 till 1 mL).
- Dränka tinningbenet med den bulla bort i PBS med ovala och runda fönstren i hörselsnäckan uppåt.
Obs: Avlägsnande av det vestibulära systemet från snäckan är inte nödvändigt, eftersom det vestibulära systemet fungerar väl som ett handtag för att manipulera och styra funktioner i cochlean (figur 1I och figur 2B). - Med en ultrafin par pincett, ta bort den stapedial artär, som passerar genom stigbygeln.
- Infoga ett tips av ultrafina tången genom bågen av stigbygeln där artären passerade och fint lyft stigbygeln uppåt. Disarticulated stigbygeln ska lyfta bort av den ovala fönstret.
- Använder ett tips av ultrafina tången, punktera ovalen och runda windows.
- Med hjälp av en 1 x PBS fylld 28,5-gauge spruta med slang (innerdiameter 0,28 mm, ytterdiameter 0,61 mm) fäst, Placera slangen över ovala fönstret (figur 2A -B).
Obs: Öppnandet av tuben kan manipuleras med hjälp av ultrafina pincett hjälper till att säkerställa korrekt placering.- Använd en ny spruta och slang för varje snäckan.
- BEGJUTA 2 mL 10% antibiotika-antimycotic (anti anti) och 10% penicillin-streptomycin (pen-strep) i PBS genom snäckan över 5 min för att ta bort perilymph. Startas för fort med för mycket tryck kommer att skada böter strukturerna inom snäckan.
Obs: Manuellt köra sprutan för hand att BEGJUTA vätskan genom snäckan är effektiv, även om en perfusion pump kunde användas som ett alternativ.- Om manuellt startas, använda ett par fina, självstängande pincett att stabilisera snäckan (figur 2A) under perfusion genom att greppa den vestibulära delen av tinningbenet.
Obs: Även om inte krävs, detta lämnar båda händerna fria att hantera instrument. å ena sidan kan köra sprutan (figur 2A) medan andra kan placera slangen på lämpligt sätt (figur 2B). - Från detta steg framåt, var noga med för att undvika att utsätta snäckan onödigt till luft. Att införa luftbubblor in i vätska blockerar vätskecirkulation, och ytterligare uttorkning kommer skada böter strukturerna inom snäckan.
- Om manuellt startas, använda ett par fina, självstängande pincett att stabilisera snäckan (figur 2A) under perfusion genom att greppa den vestibulära delen av tinningbenet.
- Avlägsna och kassera återstående muskel vävnad och ben fragment med fin pincett.
- Om nödvändigt, lagra isolerade cochleae vid 4 ° C i 10% anti anti och 10% penna-strep lösning i PBS för upp till sju dagar med regelbundna ändringar av antibiotika lösning varje 48 h.
2. cochlear bearbetning
- Decellularization
- För varje cochlean, Fyll en 20 mL scintillation injektionsflaska av glas med en 1% sodium dodecyl sulfate (SDS) lösning i avjoniserat vatten (DI), som används för att decellularize snäckan.
- Skär spetsen av plast 7 mL överföring pipett med ett rakblad så att öppningen är stor nog för en snäckan att passera.
- Använda överföring pipetten, försiktigt upprätta snäckan till pipetten så det bara passerar cut-off kanten med några millimeter.
- Utvisa snäckan i injektionsflaskan 1% SDS lösning-fyllda scintillation.
- Cirkulera 2 mL 1% SDS i avjoniserat (DI) vatten genom snäckan i scintillation injektionsflaskan med överföring pipett.
- Placera injektionsflaskan med scintillation i en rotator och ska injektionsflaskan scintillation rotera på 10 rpm under 72 timmar vid rumstemperatur.
- Ändra 1% SDS lösning varje 24 h under 72 h. Var försiktig när du ändrar SDS att aldrig utsätta snäckan till luft.
- Tvätta snäckan tre gånger för 30 min varje med DI-vatten.
- Ta bort återstående DI vattnet från injektionsflaskan scintillation, lämnar bara tillräckligt för att hålla snäckan nedsänkt.
- För att börja urkalkning, tillsätt 5 mL 10% etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA) (0,02 M) i DI vatten till scintillation injektionsflaskan med snäckan.
- Cirkulera 2 mL 10% EDTA i DI vatten genom snäckan i scintillation injektionsflaskan med överföring pipett.
- Placera injektionsflaskan med scintillation tillbaka i rotator och ska injektionsflaskan scintillation rotera på 10 rpm under 72 timmar vid rumstemperatur. Ändra den 10% EDTA-lösningen varje 24 h under 72 h. Var försiktig när du ändrar lösningar så att snäckan inte utsätts för luft.
- Skölj snäckan 3 gånger för 2 h varje med 1 x PBS; i detta skede är snäckan urkalkade permanenta.
- Lagra cochleae för upp till 72 h i en 10% anti anti, 10% penna-strep lösning i PBS vid 4 ° C.
Obs: Längre lagringstider kan vara möjligt med regelbundna ändringar av antibiotika lösning; utökad lagring av bearbetade cochleae har dock inte validerats i detta protokoll.
3. upphandling och utbyggnad av hWJCs
- Isolera hWJCs enligt tidigare publicerade protokoll22. Kort, segmentera navelsträngar i 3 cm sektioner.
- Noggrant göra en grunda snitt med en skalpell på längden på varje navelsträngen segment att rulla ut och exponera den Whartons gelé av navelsträngen. Använda pincett för att ta bort blodkärlen.
- Tvätta två gånger med tillräckligt PBS (t.ex., 40 mL i en 60 mm petriskål) segment på navelsträngen för att dränka vävnaden. Fint finhacka vävnad segment med en skalpell. Smälta vävnad i ett 100 mm petriskål med 50 mL av matsmältningen medium (0,2% typ 2 kollagenas, 1% penicillin-streptomycin, i låg-glukos Dulbeccos modifierade örnens Medium (DMEM)).
- Placera vävnad i smälta medium i orbitalskak vid 50 rpm övernattning i en 5% CO2, 37 ° C inkubator. Följande dag, späd matsmältningen medium i ett förhållande av 1:16 i 2% antibiotika-antimycotic i PBS, och pellet celler genom centrifugering vid 500 x g vid rumstemperatur (~ 27 ° C) för 10 min. Kassera supernatanten.
- Omsuspendera pellets i mesenkymala stamceller tillväxt Medium (MSCGM) och rekombinera celler. Platta celler med en täthet av 7 x 103 celler/cm2 i vävnadsodling behandlade T-75 kolvar. Kultur HWJCs i MSCGM och expandera till passage 5 för experiment.
Obs: HWJCs kan vara sub odlade till större T-kolvar (t.ex., T-150, T-300) när passaging för att öka avkastningen av hWJCs för experiment.
4. infusion av hWJCs i cell-lösa Cochleae
- Förbereda cell-lösa cochleae
- Använd aseptisk teknik, tvätta lagrad cochleae i 1 x PBS tre gånger för varje 30 min.
- Överför cochleae till separata brunnar i en 24-väl-plattan och tillsätt 1 mL 37 ° C före värmde MSCGM.
- Inkubera cochleae i en 5% CO2, 37 ° C cell kultur inkubator för minst 1 h före infusion av celler.
- Separera hWJCs och resuspendera
- Tvätta hWJCs med 37 ° C värms före 1 x PBS två gånger.
- Lägg tillräckligt 37 ° C före värmde Trypsin med 0,5% EDTA att täcka fartyget cellytan.
- Inkubera hWJCs för upp till 5 min i en 5% CO2, 37 ° C cell kultur inkubator.
- Kontrollera att 90% av cellerna har lossnat från cellytan kultur genom att visa celler under ett inverterat Mikroskop.
Obs: Celler som flytta när kultur fartyget är försiktigt knackade, har lossnat. Celler som förblir stillastående, har inte lossnat. - Knacka försiktigt på sidorna av kolven ytterligare rubba bifogade celler.
- Kontrollera att 90% av cellerna har lossnat från cellytan kultur genom att visa celler under ett inverterat Mikroskop.
- Använd aseptisk teknik, används överföring hWJCs från kultur fartyget till en 50 mL konisk röret som innehåller en motsvarande volym av MSCGM till volymen av Trypsin för att separera celler.
- Pellets av hWJCs genom centrifugering vid 500 x g vid rumstemperatur (~ 27 ° C) under 5 minuter.
- Aspirera supernatanten och återsuspendera hWJCs i MSCGM med en koncentration på 500 000 celler/mL.
- BEGJUTA cochleae
- Överför cochleae till en ny 24-well platta med överföring pipett.
- Lägg en droppe av MSCGM till varje snäckan att förhindra eventuella snäckan från att torka ut.
- Delikat orient snäckan med ultrafina pincett så att de ovala och runda windows vänd uppåt.
Obs: Ta extrem försiktighet vid direkt hantering varje snäckan snäckan är lätt skadad. - Med en steril 28,5-gauge insulinspruta med anslutna slangar, upprätta 0,2 mL resuspended hWJCs (100 000 celler).
- Använda steriliserade fin pincett, Placera slangen över ovala fönstret.
- Försiktigt och långsamt BEGJUTA snäckan med 0,2 mL återsuspenderade hWJCs använder en 28,5-gauge insulinspruta ansluten till polyeten slangen (Ytterdiameter: 0,61 mm, innerdiameter: 0,28 mm) under cirka 5 minuter.
- Efter perfusion, tillsätt 0,8 mL 37 ° C före värmde MSCGM till den brunn innehållande snäckan för att få den totala volymen i brunnen till 1 mL.
- Upprepa steg 4.3.3-4.3.7 för varje cochlean, med en ny spruta och slang varje gång.
- Placera perfunderade cochleae i en 5% CO2, 37 ° C cell kultur inkubator, och ändra media tre gånger per vecka.
5. snäckan skörd och konservering
Obs: Cochleae kan vara odlade och skördade vid någon tidpunkt upp till 30 dagar efter perfusion.
- För att bevara cochleae, fixa i 4% PARAFORMALDEHYD i 1 x PBS över natten vid 4 ° C på en gungande plattform.
- Efter fixering, tvätta cochleae med 1 x PBS tre gånger för 5 min varje.
- Gradvis torkar snäckan med etanol och klara med ett alifatiskt kolväte lösningsmedel innan inbäddning i paraffin.
- Avsnitt prover till en tjocklek av 10 µm med hjälp av en mikrotom och montera på glas objektglas.
Obs: Prover är nu redo för histologisk eller immunhistokemisk bearbetning med hjälp av standardprotokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med hjälp av metoder som presenteras här, lyckad decellularization av cochleae bedömdes genom att undersöka närvaron eller frånvaron av DNA genom 4', 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI) färgning. Cochleae ansågs fullt cell-lösa om DNA inte identifierades inom cell-lösa snäckan. En infödd snäckan från ett tidigare experiment som inte genomgår decellularization eller urkalkning användes som en positiv kontroll för att illustrera strukturer och celler som traditionellt finns i en C57BL mus snäckan. Cell-lösa-urkalkade permanenta snäckan, som inte hade någon hWJCs som infunderas, användes som en negativ kontroll. Inga kvantifierbara DAPI målat cellkärna observerades i någon region i avsnittet vävnad (figur 3). Två cochleae var cell-lösa urkalkade permanenta och sedan infunderas med hWJCs för det aktuella projektet. De cell-lösa-urkalkade permanenta cochleae som var perfusion med hWJCs observerades att ha många DAPI missfärgade kärnor inom snäckan och växer på beniga skalet utanför snäckan (tabell 1). Totala uppskattade cell densiteter för cellen infunderas första snäckan var 113,759 celler/snäckan efter 30 dagar av kultur (figur 4 och figur 5) och för andra snäckan var 118,732 celler/snäckan efter 30 dagar av kultur (figur 6 och (Se figur 7). Dessa cell densiteten uppskattningar inkluderar den Scala tympani och Scala absid, Scala media, och volymerna av de strukturer som finns inom de tre flytande utrymmena, men dessa uppskattningar uteslutit någon av de återstående benig labyrinten. Dessutom prover från varje snäckan var färgas med Hematoxylin och Eosin (H & E) att visa närvaron av celler och anatomiska funktioner inom varje snäckan (figur 8). Gross anatomi av cochlear mikrostrukturer var huvudsakligen oförändrad under hela alla färgade sektioner; dock var inga celler identifierbar i avsnittet cell-lösa-urkalkade permanenta (figur 8B). Identifiering av cellkärnor var dramatiskt annorlunda mellan infödda snäckan (figur 8A) och de cell-lösa-urkalkade permanenta cochleae infunderas med celler (figur 8 c–D).
Figur 1: mus tinningbenet isolering. När musen har varit lämpligt euthanized, halshugga djuret genom att skära mellan basen av skallen och den första halskotan och spraya huvudet med etanol att desinficera (A). Tudela skallen i en sagittalplanet i avsnitt (B–C) med hjälp av en vass par kirurgisk sax, skär genom både på hjärnvävnad och ben. Tudelas mus huvudet (D, underkäken bort för orelaterade experimentellt arbete) måste sedan ha hjärnvävnaden bort för att avslöja tinningbenet. De två foramina genom vilken den auditiva och vestibulära nerver passet (E, röda pilspetsar) är användbara ledtrådar för att framgångsrikt identifiera tinningbenet. Ta bort köttet från skallen (F). Den yttre hörselgången (F, pil, övre panelen) ger en användbar externa cue samt. Försiktigt trimma bort överflödigt ben, lämnar bara isolerade tinningbenet (G). Bulla (H, topplåten, röd markerade området) måste sedan försiktigt avlägsnas med fin pincett (H, nedre panelen). Bulla är tunna ben och kan vara lätt tärt (jag) tills beniga labyrinten av snäckan är avslöjade (J, röda parentes). Skala barer alla bilder är 1 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2: Cochlear Perfusion. När tinningbenet har isolerats och bulla har tagits bort, kan snäckan sedan ställas in för perfusion vid Mikroskop. När startas med en manuellt driven spruta med slangen ansluten (A, prickade linjen) kan det vara bra att stabilisera snäckan med hjälp av ett par självstängande pincett. Försiktigt bifoga tången till vestibulära delen av tinningbenet (B) och vila tången mot läppen av petriskål (A). Detta lämnar båda händerna fria att manipulera instrument under perfusion. Å ena sidan kan sedan manipulera sprutan, reglering av flöde av vätska, medan å andra sidan kan placera slangen över den ovala fönstret med hjälp av ett par pincett (B). Skära den fria änden av slangen i en vinkel möjliggör enklare positionering, vilket gör att slangen placeras korrekt utan blockerar synfältet. Skalstapeln är 1 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3: vävnad avsnitt i en cell-lösa mus cochlean. En upprätt epi-fluorescerande mikroskopet användes till bild prover vid 200 X förstoring (10 X okular och 20 X-objektiv). Bilder var sys ihop för att skapa ungefär en 4 x 5 montage. DAPI nukleär färgning visar avsaknad av celler visas i sidopanelen A använda en DAPI gemensamma filter (350 nm excitation, 470 nm utsläpp), och en överexponerad, gråskalebild av den autofluorescens med fluorescein fluoresceinisothiocyanat (FITC) gemensamma filter Set (490 nm excitation, 525 nm utsläpp), som ger anatomiska landmärken, visas i panelen B. Automatiserad blodkroppar utfördes i tre områden av intresse, som är avgränsad på båda paneler A och B. Totala antalet beräknades för avsnittet hela vävnad (1, vit linje) och snäckan (2, streckad linje). Dessa två tal användes för att beräkna antalet celler i benstrukturer utanför snäckan men inom avsnittet vävnad (3, utrymmet mellan den streckade linjen och streckad linje) exteriör, beniga kanter. Skala barer alla bilder är 500 µm.Klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 4: en nära-modiolar del av cell-lösa mus snäckan 1 infunderas med hWJCs. DAPI nukleär färgning visas i panelen A överlagras på en överexponerad, gråskala autofluorescens från den gröna kanalen, vilket ger anatomiska landmärken. Automatiserad cell räknas utfördes i tre områden av intresse, som är avgränsad i panel A. Totala antalet beräknades för avsnittet hela vävnad (1, vit linje) och snäckan (2, streckad linje). Dessa två tal användes för att beräkna antalet celler i benstrukturer utanför snäckan men inom avsnittet vävnad (3, utrymmet mellan den streckade linjen och streckad linje) exteriör, beniga kanter. Isolerade DAPI färgning visas i panelen Boch tröskeln till DAPI färgningen används under automatiserad kvantifiering visas i panelen C. Skala barer alla bilder är 500 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 5: hög förstoring Visa en nära-modiolar del av cell-lösa mus snäckan 1 infunderas med hWJCs. DAPI nukleär färgning visas i panelen A överlagras på en överexponerad, gråskalebild av autofluorescens från den gröna kanalen, vilket ger anatomiska landmärken. Isolerade DAPI färgning visas i panelen Boch tröskel bilden används under automatiserad cell inventering visas i panelen C. Flytande utrymmen och finare mikrostrukturer inrymt i hörselsnäckan bevaras fint under decellularization och cell kultur faser av experimentet. Scala Vestibuli (SV), Scala Tympani (SM), basilarmembranet (BM), Tectorial Membrane (TM), Spiral Limbus (L), Rosenthal's Canal (RC), Modiolus (M), Spiral Ligament (SL) och Stria Vascularis (*). Reissners membran definierades inte tydligt i vävnadssnitt och därmed Scala Media inte var tydligt definierade. Skala barer alla bilder är 250 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 6: en nära-modiolar del av cell-lösa mus snäckan 2 som var berikad med hWJCs. DAPI nukleär färgning visas i panelen A, överlagras på gråskala autofluorescens från den gröna kanalen, vilket ger anatomiska landmärken. Automatiserad cell räknas utfördes i tre områden av intresse, som är avgränsad i panel A. Totala antalet beräknades för avsnittet hela vävnad (1, vit linje) och snäckan (2, streckad linje). Dessa två tal användes för att beräkna antalet celler i benstrukturer utanför snäckan men inom avsnittet vävnad (3, utrymmet mellan den streckade linjen och streckade linjer) exteriör, beniga kanter. Isolerade DAPI färgning visas i panelen Boch tröskeln till DAPI färgningen används under automatiserad kvantifiering visas i panelen C. Skala barer alla bilder är 500 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 7: hög förstoring Visa en nära-modiolar del av cell-lösa mus snäckan 2 som var berikad med hWJCs. DAPI nukleär färgning visas i panelen A, överlagras på gråskala autofluorescens från den gröna kanalen, vilket ger anatomiska landmärken. Isolerade DAPI färgning visas i panelen Boch tröskel bilden används under automatiserad cell inventering visas i panelen C. Flytande utrymmen och finare mikrostrukturer inrymt i den cochlear bevaras under decellularization och cell kultur fasen av experimentet. Scala Vestibuli (SV), Scala Tympani (SM), basilarmembranet (BM), Tectorial Membrane (TM), Spiral Limbus (L), Rosenthal's Canal (RC), Modiolus (M), Spiral Ligament (SL) och Stria Vascularis (*). Reissners membran definierades inte tydligt i vävnadssnitt och därmed Scala Media inte var tydligt definierade. Skala barer alla bilder är 250 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 8: Hematoxylin och Eosin färgning av kontroll och behandlade cochleae. Hematoxylin och Eosin färgade sektioner visar en typisk snäckan med infödda celler närvarande visas i panel A. Panel B innehåller samma strukturer som panel A, men är från en helt cell-lösa cochlean, vilket lämnar bakom extracellulärmatrix. De två tidigare visad cochleae infunderas med hWJCs ses i paneler C och D. Brutto cochlear anatomi är huvudsakligen oförändrad genom decellularization och cell kultur processer, även om de specifika cellpopulationer och platser är dramatiskt förändrad. Scala Vestibuli (SV), Scala Tympani (SM), basilarmembranet (BM), Tectorial Membrane (TM), Spiral Limbus (L), Rosenthal's Canal (RC), Modiolus (M), Spiral Ligament (SL) och Stria Vascularis (*). Skala barer alla bilder är 250 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
| A1 Snäckan + celler | A2 Snäckan + celler | B2 Neg. |
Tabell 1: Cell räknas. DAPI målat cochlear sektioner var thresholded och kvantifierade använder automatiska verktyg för inventering i ImageJ i 3 icke-överlappande regioner av intresse (utanför beniga labyrinten, tinningbenet utanför cochlear vätska utrymmen, och inom cochlean). Cochlear tvärsnittsarea mättes också i ImageJ, och detta värde användes för att beräkna avsnitt volym i kombination med snittjockleken (10 µm). Använda en uppskattning av totala cochlear volym utgiven av Santi o.a. 23, relativa cochlear volymen av ett visst avsnitt beräknades. Cell densiteten av hela snäckan uppskattades med relativa cochlear volymen av ett visst avsnitt i kombination med det ihopkopplade celltalet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har framgångsrikt visat att infödda cochlear celler kan tas bort från snäckan via en decellularization process, vilket möjliggör användning av snäckan som en intrikat, tredimensionella vävnad byggnadsställning. Santi et al. 15 utvecklade den första metoden för decellularizing cochleae, och har korrekt uppskattade volymerna för många cochlear strukturer genom med hjälp av lätta blad mikroskopi23. Sådana tidiga arbete fungerat som en stark grund för vävnadsteknik och cell kultur tekniker presenteras här. Cell-lösa snäckan framgångsrikt kan vara infunderas med celler, och odlade sedan under en längre tid. Cochleae från en rad olika djur skulle teoretiskt kunna utnyttjas i kombination med en liknande rad av celler typer. Dessa kombinationer tillåta de tekniker som presenteras här för att utnyttjas i många möjliga experimentell design, såsom Vävnadsrekonstruktion program som undersöka sensoriska epitelet utveckling14, drog testning av nya farmaceutiska medel 24, och utvecklingen av cochlear reparation modeller25. Men trots omfattande tillämpligheten av dessa tekniker är de inte utan begränsningar.
En av begränsningarna av den aktuella tekniken är att perfusionen är variabel utifrån individen. Utveckla en hållare, för snäckan, och använda en sprutpump för att genomföra perfusioner kan öka noggrannheten och framgång i processen. Dessutom skulle slutgiltigt bevisa framgångsrika decellularization potentiellt kunna åstadkommas genom flera metoder. Vi anställda DAPI färgning som används för att kvantifiera återstående cellkärnor, och vi observerade inga kvarvarande kärnor post-decellularization. Dessutom utnyttja DNA kvantifiering standardanalyser de reagens, grön dye upptäcka pikogram mängder DNA, att identifiera nukleinsyra rester, som visuellt kan vara mer känsliga än DAPI för att identifiera närvaron av små fragment av nucleic syror i cell-lösa vävnader26. Oavsett vilka metoder som används för att validera framgångsrika decellularization, kan det inte vara möjligt att Visa fullständig decellularization av en individuell snäckan före utnyttja det som en byggnadsställning. Dock har vi funnit den decellularization processen skall bli framgångsrik och robust.
De två mest kritiska steg i det nuvarande protokollet är isolering och hanteringen av cochleae och perfusionen i cochleae. Vara måste mycket försiktig när snäckan är initialt isolerat, eftersom snäckan är känslig och skör. Om alltför mycket kraft appliceras vid hantering snäckan med pincett, kunde snäckan fragment. Därför är det absolut nödvändigt att hantera varje snäckan försiktigt innan decellularization och avkalkning. Det vestibulära systemet, fungerar om de lämnas intakt, som ett bra handtag för greppa komplexa innerörat med pincett, och inrikta snäckan. Likaså när startas snäckan med celler, trycket bakom perfusionen får inte vara för stor, annars kan celler överlever inte perfusionen. Som påpekas i det nuvarande protokollet, tillåter fästa slangar till slutet av en 1 mL insulinspruta för enklare hantering av snäckan med ena handen, och större precision i startas celler genom snäckan med den andra handen.
Som ett nästa steg, skulle det vara naturligt att bedöma utvecklingsmässiga och funktionella markörer för att avgöra om cochlear ECM inducerande differentieringen av stamceller, och om så, vilka specifika ECM komponenter i hörselsnäckan framkalla förändringar i cellerna. Startas olika typer av celler (t.ex., stamceller, neuroprogenitors, fibroblaster, etc.) genom snäckan till monitor celldifferentiering och beteende skulle vara en annan fascinerande uppföljande undersökning. Celler som har modifierats genetiskt eller utsätts för en tillväxtfaktor differentiering protokoll kan dessutom ge nya insikter i hur cochlear ECM stöder sensorineural utveckling och eventuellt även funktionen i hörsel. Således, det nuvarande protokollet är ett viktigt första steg i använder cochlear ECM för att studera innerörat sensorineural utveckling och underhåll, som en dag leda till utvecklingen av nya terapier att återställa hörselnedsättning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Det aktuella projektet finansierades av University of Kansas bevis på konceptet fonden. Vi vill tacka vårdpersonalen på KUMC (Kansas City, KS) för att hjälpa oss att få mänskliga navelsträngar, och David Jorgensen bistå med cochleae kulturer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Allegra X-14R Centrifuge | Beckman-Coulter | B08861 | |
| Intramedic Semi-Rigid Tubing | Becton Dickinson | 427401 | |
| New Brunswick Innova 2000 Orbital Shaler | Eppendorf | M1190-0002 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14060-10 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | |
| Ultra-Fine Forceps | Fine Science Tools | 18155-13 | |
| 50-mL Conical Tubes | Fisher Scientific | 12565271 | |
| Petri Dish | Fisher Scientific | FB087579B | |
| U-100 Insulin Syringe | Fisher Scientific | 14-829-1B | |
| Scintillation Vial | Fisher Scientific | 03-341-73 | |
| Rotator | Fisher Scientific | 88-861-049 | |
| Transfer Pipette | Fisher Scientific | 22-170-404 | |
| Razor Blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Fisher Scientific | 15-240-062 | |
| Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
| 24-Well Plate | Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| SuperFrost PLUS Glass Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Transfer Pipette | Fisher Scientific | 22-170-404 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Fisher Scientific | P36935 | |
| Clear-Rite 3 | Fisher Scientific | 22-046341 | |
| Thermo Scientific Forma Series II 3110 Water-Jacekted CO2 Incubator | Fisher Scientific | 13-998-078 | |
| Mesenchymal Stem Cell Growth Medium | Lonza | PT-3001 | |
| Trypsin-EDTA | Lonza | CC-3232 | |
| TPP T-75 Culture Flask | MidSci | TP90076 | |
| TPP T-150 Culture Flask | MidSci | TP90151 | |
| TPP T-300 Culture Flask | MidSci | TP90301 | |
| Dissection Microscope | Nikon Instruments | SMZ800 | |
| Nikon Eclipse Ts2R-FL Inverted Microscope | Nikon Instruments | MFA51010 | |
| NuAire Class II, Type A2 Biosafety Cabinet | NuAire | NU-425-600 | |
| 1X PBS | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | |
| 1% SDS Solution | Sigma-Aldrich | 436143-100G | |
| 10% EDTA | Sigma-Aldrich | E9884-100G |
References
- Raphael, Y., Altschuler, R. A.
- LeMasurier, M., Gillespie, P. G. Hair-Cell Mechanotransduction and Cochlear Amplification. Neuron. 48 (3), 403-415 (2005).
- Neal, C., et al. Hair cell counts in a rat model of sound damage: Effects of tissue preparation & identification of regions of hair cell loss. Hear Res. 328, 120-132 (2015).
- Ivory, R., Kane, R., Diaz, R. C. Noise-induced hearing loss: a recreational noise perspective. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 22 (5), 394-398 (2014).
- Stucken, E. Z., Hong, R. S. Noise-induced hearing loss: an occupational medicine perspective. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 22 (5), 388-393 (2014).
- Dille, M. F., et al. Tinnitus onset rates from chemotherapeutic agents and ototoxic antibiotics: results of a large prospective study. J Am Acad Audiol. 21 (6), 409-417 (2010).
- Sajjadi, H., Paparella, M. M. Meniere's disease. Lancet. 372 (9636), 406-414 (2008).
- House, J. W., Brackmann, D. E.
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Acceleration of age-related hearing loss by early noise exposure: evidence of a misspent youth. J Neurosci. 26 (7), 2115-2123 (2006).
- Ryals, B. M., et al. Avian species differences in susceptibility to noise exposure. Hear Res. 131 (1-2), 71-88 (1999).
- Koehler, K. R., Mikosz, A. M., Molosh, A. I., Patel, D., Hashino, E. Generation of inner ear sensory epithelia from pluripotent stem cells in 3D culture. Nature. 500 (7461), 217-221 (2013).
- Sekiya, T., et al. Cell transplantation to the auditory nerve and cochlear duct. Exp Neurol. 198 (1), 12-24 (2006).
- Shi, F., Edge, A. S. Prospects for replacement of auditory neurons by stem cells. Hear Res. 297, 106-112 (2013).
- Mellott, A. J., Shinogle, H. E., Nelson-Brantley, J. G., Detamore, M. S., Staecker, H. Exploiting decellularized cochleae as scaffolds for inner ear tissue engineering. Stem Cell Res Ther. 8, (2017).
- Santi, P. A., Johnson, S. B. Decellularized ear tissues as scaffolds for stem cell differentiation. J Assoc Res Otolaryngol. 14 (1), 3-15 (2013).
- Davies, D., Holley, M. C. Differential expression of alpha 3 and alpha 6 integrins in the developing mouse inner ear. J Comp Neurol. 445 (2), 122-132 (2002).
- Gerchman, E., Hilfer, S. R., Brown, J. W. Involvement of extracellular matrix in the formation of the inner ear. Dev Dyn. 202 (4), 421-432 (1995).
- Goodyear, R. J., Richardson, G. P. Extracellular matrices associated with the apical surfaces of sensory epithelia in the inner ear: molecular and structural diversity. J Neurobiol. 53 (2), 212-227 (2002).
- Mellott, A. J., et al. Improving Viability and Transfection Efficiency with Human Umbilical Cord Wharton's Jelly Cells Through Use of a ROCK Inhibitor. Cell Reprogram. , (2014).
- Mellott, A. J., Shinogle, H. E., Moore, D. S., Detamore, M. S. Fluorescent Photo-conversion: A second chance to label unique cells. Cell Mol Bioeng. 8 (1), 187-196 (2015).
- Mitchell, K. E., et al. Matrix cells from Wharton's jelly form neurons and glia. Stem Cells. 21 (1), 50-60 (2003).
- Mellott, A. J., et al. Nonviral Reprogramming of Human Wharton's Jelly Cells Reveals Differences Between ATOH1 Homologues. Tissue Eng Part A. 21 (11-12), 1795-1809 (2015).
- Buytaert, J. A., Johnson, S. B., Dierick, M., Salih, W. H., Santi, P. A. MicroCT versus sTSLIM 3D imaging of the mouse cochlea. J Histochem Cytochem. 61 (5), 382-395 (2013).
- Nonoyama, H., et al. Investigation of the ototoxicity of gadoteridol (ProHance) and gadodiamide (Omniscan) in mice. Acta Otolaryngol. 136 (11), 1091-1096 (2016).
- Dai, C., et al. Rhesus Cochlear and Vestibular Functions Are Preserved After Inner Ear Injection of Saline Volume Sufficient for Gene Therapy Delivery. J Assoc Res Otolaryngol. , (2017).
- Sutherland, A. J., Converse, G. L., Hopkins, R. A., Detamore, M. S. The bioactivity of cartilage extracellular matrix in articular cartilage regeneration. Adv Healthc Mater. 4 (1), 29-39 (2015).
