تشريح وثقافة Explant موريني Allantois للتحليل في المختبر للحجز الانتويك

Summary

يصف لنا فحص في المختبر لنموذج مرفق تشوريوالانتويك، الخطوة الأولى في تكوين المشيمة. البروتوكول يوضح ثقافة تشريح و explant مورين اللانتويديس على إنتغرين α4β1 المعطل تداولها. يتم تقييم مرفق allantois مجهريا في نقاط زمنية محددة سلفا.

Abstract

المشيمة أمر ضروري لنمو وتطور أجنة الثدييات. ولهذا السبب، العديد من التعديلات الوراثية والشتائم البيئية كما يحتمل أن تخل التنمية المشيمة أو وظيفة يمكن أن يسبب فقدان الحمل المبكر في الفئران والبشر. ومع ذلك، تفتقر إلى فحوصات بسيطة في المختبر الشاشة للآثار المحتملة على تكوين المشيمة. هنا، نحن نركز على النمذجة الخطوة الأولى والحاسمة في تكوين المشيمة، والذي يتألف من إرفاق اللانتويس للمشيمة. يصف لنا طريقة لتقييم سرعة إلحاق explants الانتويك في إنتغرين α4β1 المعطل تداولها، هو بمثابة ركيزة كوريو mimetic. ويمكن هذا النهج في المختبر تقييم نوعي للمرفق وينتشر سلوك explants allantois متعددة في نقاط زمنية مختلفة على التوالي. وقد يمكن استخدام البروتوكول للتحقيق في تأثير الطفرات الماوس المستهدفة، والمخدرات، أو العوامل البيئية المختلفة التي تم ربطها إلى مضاعفات الحمل أو فقدان الجنين على اللانتويس مرفق السابقين فيفو.

Introduction

المشيمة أمر لا غنى عنه للنمو الجنينية والتنمية في بيئة الرحم. وهو يشكل واجهة للأكسجين المستقلب وتبادل المغذيات بين الجنين والأم الدورة الدموية، وأيضا وظائف كجهاز الغدد الصماء والمناعية. أي إهانة الذاتية أو الخارجية التي يعوق التنمية المشيمة يؤدي إلى تأخر النمو داخل الرحم، وفقدان الجنين، أو مضاعفات الحمل، في الفئران والبشر¹. في حين لا يزال عدد الطفرات الماوس المستهدفة التي تسبب فسيولوجيا المشيمة غير طبيعي لزيادة²، مع الأنماط الجينية 219 المدرجة حاليا على الموقع الشبكي للمعلوماتية الجينوم الماوس (MGI) (http://www.informatics.jax.org/vocab/mp_ontology/ MP:0010038)، العديد من هذه تعمل ليست مفهومة جيدا من وجهة نظر آليا. بالإضافة إلى التعديلات الوراثية، المخدرات جزيء صغير، والأجسام المضادة، السموم، مسببات الأمراض، والايضات الزائدة، أو مختلف العوامل البيئية قد تؤثر على وضع المشيمة والدالة^3،،من^{45 , 6 , 7}-بعد، بسيطة في المختبر فحوصات أن نموذج الخطوات الحاسمة في تطور المشيمة شحيحة.

التنمية المشيمية مورين هو بدأت في وقت مبكر ميدجيستيشن، عندما اللانتويس (سلف الإنمائية الحبل السري) ينبثق من نهاية الخلفي للجنين برعم أن ينمو نحو المشيمة⁸. التوسط تشوريواديسيفي الخلايا في الطبقة الخارجية من المهد الانتويك المرفق ونشر اللانتويس على سطح المشيمة (تشوريوالانتويك “الانصهار”). يطوي المشيمة فيما بعد إلى الزوائد التي ينمو المفرج اللانتويس شكل المتاهة، الطبقة المشيمية الداخلية حيث يتم تبادل المواد الغذائية والأكسجين بين دم الأم عن كثب محاذياً الكبدية والأوعية الجنينية^{9 ،10}.

إرفاق اللانتويس للمشيمة هو الخطوة الأولى والحاسمة في تشكيل المتاهة، والعيوب في هذه العملية من بين الأسباب الأكثر شيوعاً للفتك الجنينية في ميدجيستيشن¹. على الرغم من أن عددا من طفرات الماوس قد وصف مرفق تشوريوالانتويك فشل تحدث¹⁰، حيث يسرد قاعدة يتجاوزون حاليا 108 طفرات الماوس التي تتميز بها الشاذ الانصهار تشوريوالانتويك (http:// www.informatics.jax.org/vocab/mp_ontology/MP:0002824)، التفاعل بين الخلايا بين الخلية والأوعية الدموية التصاق جزيء-1 (VCAM-1، أعرب عن ميسوديرم الانتويك) وانتغرين α4β1 (المعبر عنها في mesothelium المشيمة، المستمدة من اكسترامبريونيك mesoderm) يبدو أنه لا غنى عنه للحجز تشوريوالانتويك والانصهار^11،،من¹²¹³. المناعي تلطيخ جبل كل البرية من نوع الأجنة قد أظهرت أعرب VCAM-1 داخل ثلثي القاصي من ساق الانتويك في اليوم تقريبا الجنينية (ه) 7.5¹³ (المرحلة سميط 1-4)، وأن التعبير عن ما زال مرتفعا أثناء الحجز تشوريوالانتويك-والانصهار^11،12. عادة يتم الكشف عن فشل مرفق الانتويك للمشيمة بتحاليل نسيجية من براعم الرحم. ومع ذلك، أحجام allantois متغير فسيولوجيا عاليا في بين وحتى داخل ليتر من نفس المرحلة الإنمائية¹⁴، وفقط إرفاق allantois للمشيمة عندما قد بلغ حجم كافية لجعل الاتصال الجسدي. يعكس هذا التغير الطبيعي، مرفق تشوريوالانتويك يأخذ مكان في وقت ما بين ~ ه 8.0 و E 9.0 في الرحم، وتقييم موثوق بها إحصائيا لهذه العملية عن طريق الأنسجة فتعتمد على تحليل عدد كبير من كونسيبتوسيس للحصول على عينات كافية في المرحلة التنموية المناسبة.

هنا، يمكننا وصف أسلوب تقييم مرفق الانتويك خارج الرحم أقل اعتماداً على حجم اللانتويس. نظهر تشريح الأجنة الماوس وما اللانتويديس من يشكل الفئران الحوامل ~ 8 أيام ما بعد كويتوم (dpc؛ dpc 0.5 يعين الكشف عن المكونات المهبلي)، وثقافة اللاحقة من اللانتويس اكسبلانتس في α4β1 المعطل تداولها إينتيجرينس. هذا الأسلوب يتيح إجراء تقييم سريع الفنية المرفق وينتشر سلوك متعددة allantois explants بالتوازي وعند نقاط زمنية متتالية مختلفة. يمكن استخدام البروتوكول إلى الشاشة لآثار الطفرات المستهدفة، والمخدرات، أو العوامل البيئية المختلفة على اللانتويس مرفق السابقين فيفو.

Protocol

وأقر تربية الماوس اونترفرانكين ريجيرونج، وأجريت جميع التحاليل طبقاً للقوانين المعمول بها في كل من ألمانيا والاتحاد الأوروبي، والأنظمة المتعلقة برعاية واستخدام الحيوانات المختبرية. 1-طلاء Microtiter لوحات مع إنتغرين α4β1 للثقافة Explant Allantois الرحم السابقين إعادة تشكيل ?…

Representative Results

هذا البروتوكول وصف أسلوب لعزل و explant اللانتويديس مورين السابقين فيفو، وتفاصيل التقييم النوعي لمرفق allantois إنتغرين α4β1، وهي عملية حاسمة خلال في فيفو تشوريوالانتويك الانصهار. تدل نتائج الممثل هو مبين في الشكل 1 ألف–ح الخطوات الم…

Discussion

حضور المصل، ومصدر غنى لجزيئات لاصقة المؤيدة المصفوفة خارج الخلية مثل فيبرونيكتين، سوف نعلق allantois explants سهولة إلى مختلف من البلاستيك، الزجاج، أو تصفية السطوح^9،16. وهكذا، إذا يهدف تحليل أجرى للتحقيق على وجه التحديد أثر التعديل الوراثي أو أي معاملة أخرى في مرفق…

Materials

C57BL/6J wildtype mice	The Jackson Laboratory	Stock No: 000664
70 % (v/v) Ethanol	VWR International	930031006
Standard pattern forceps	Fine Science Tools	11000-12	Forceps used to open the abdominal cavity.
Micro dissecting forceps	Fine Science Tools	11254-20	Dumont # 5 medical biology forcepts with fine, sharp tip.
Fine scissors	Fine Science Tools	14094-11	Straight blades.
Spring scissors	Fine Science Tools	15012-12	Noyes spring scissors with 14 mm blades for the dissection of uterus buds.
Microspoon	Carl Roth	AT18.1	5 mm Spoon diameter.
Microtiter plates	ibidi	81501	We use uncoated, sterile angiogenesis slides (internal volume 50 µL) with a hydrophobic surface that is not tissue-culture treated to reduce non-a4b1-mediated binding to plastic.
10 cm dish	Nunc	150350	Sterile tissue culture dishes.
3.5 cm dish	Nunc	150288	Sterile tissue culture dishes.
Large orifice pipette tips	Biozym	VT0140X	Low binding pipette tips, 200 µL.
a4b1 integrin	R&D Systems	6054-A4	Murine a4b1 integrin recombinantly expressed and purified from a Chinese hamster ovary cell line.
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma Aldrich	D8537	Without Ca2+ and Mg2+.
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	PAN Biotech	P04-03600	The formulation contains 4.5 g/L glucose, 110 mg/L sodium pyruvate and 3.7 g/L NaHCO3 but no L-glutamine, which is added separately.
Penicillin/Streptomycin	Gibco (ThermoFisher Scientific)	15140-122	100 x (10,000 U/mL Penicillin and 10,000 µg/mL streptomycin) stock solution. Prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw.
L-Glutamine	PAN Biotech	P04-80100	100 x (200 mM) Stock solution. Prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw.
Fetal bovine serum	Biochrom	S 0115	We use heat-inactivated FBS (heated to 56 °C for 30 min with mixing to inactivate complement).
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A7030	We use protease- and fatty acid-free albumin. Prepare a 0.1 % (w/v) solution in DMEM. Sterile filter the solution through a disposable cell culture filter with a 0.22 µm pore size and low protein-binding membrane, and store aliquots at -20 °C.
para-Formaldehyde	Carl Roth	0335.2	To make a formaldehyde solution in PBS, weigh para-formaldehyde powder in a ventilated hood, and add it to PBS preheated to ca. 60 °C in a beaker on a stir plate. Add 1 N NaOH dropwise until solution clears. Let solution cool to room temperature, and filter through 0.22 mm filter syringe. Adjust pH with diluted HCl to ca. 6.9, and adjust to final volume with PBS. We aliquot and freeze the solution, but it can also be stored at 4 °C for approximately four weeks.
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100	Use wide-orifice pipette tips to handle undiluted Triton X-100.
Normal goat serum	Sigma Aldrich	G9023	To block non-specific binding of antibodies in immunofluorescence analyses.
a-CD31 Antibodies	BD Biosciences	550274	Purified rat anti-mouse monoclonal antibodies, clone MEC 13.3.
Secondary goat anti-rat antibodies	Thermo Fisher	A-11006	Goat anti-rat IgG (heavy and light chains), cross-adsorbed, fluorescently labeled with Alexa Fluor 488. Other fluorescent labels are also possible.
Mowiol 4-88	Sigma Aldrich	81381	Mounting medium for cytochemistry. MW ~31,000
Labovert	Leitz	Labovert	Inverted phase contrast microscope equipped with a 4 x and 10 x objective for somite pair counting. Other phase contrast microscopes (such as those that are routinely used in tissue culture) are also suitable.
M80	Leica Microsystems	M80	Stereomicroscope with 8 : 1 zoom range (yielding a magnification between 7.5 x and 60 x) for embryo and allantois dissection.
DM4000B	Leica Microsystems	DM4000B	Microscope system for histology with LED illumination. We use HCX PL FLUOTAR 5 x/0.15 and HC PL FLUOTAR 10 x/0.30 objectives. Other microscopes equipped phase contrast and fluorescence optics can be used to score allantois attachment.
Digital camera	JVC	KY-F75U	3-CCD digital capture camera attached to the DM4000B LED microscope. We use Diskus software (Hilgers) to operate both the microscope and the camera.
Confocal microscope	Leica Microsystems	SP5	Confocal microscope for higher-resolution imaging of endothelia in the vascular plexus of allantois explants. Immunofluorescence images were taken with a 40 x objective.