Рассечение и экспланта культуры мышиных Аллантоис для анализа в пробирке Allantoic вложения

Summary

Мы описываем в vitro пробирного модель chorioallantoic насадку, первый шаг в формировании плаценты. Протокол показывает вскрытие и экспланта культуры мышиных allantoides на иммобилизованных α4β1 Интегрин. Аллантоис вложений оценивается микроскопически в предопределенное время точках.

Abstract

Плацента имеет важное значение для роста и развития у млекопитающих эмбрионов. По этой причине многие генетические изменения и вероятно также экологические оскорбления, которые мешают развитию плаценты или функция может привести к ранней потери беременности мышей и людей. Тем не менее хватает простой в vitro анализов для потенциального воздействия на формирование плаценты. Здесь мы сосредоточены на моделирование первый и критический шаг в формирования плаценты, которая состоит из приверженность Аллантоис хориона. Мы описываем метод, чтобы быстро оценить вложение allantoic эксплантов на иммобилизованных α4β1 Интегрин, который служит Хорио подражательный субстрата. Этот подход в vitro позволяет качественной оценки вложения и распространение поведение нескольких Аллантоис эксплантов в точках различных раз подряд. Протокол может использоваться для исследовать эффект целевой мыши мутации, наркотиков или различных экологических факторов, которые были связаны с осложнений беременности или потери плода на Аллантоис вложение ex vivo.

Introduction

Плацента является необходимым для эмбрионального роста и развития в условиях матки. Это представляет собой интерфейс для кислорода, метаболит и питательных обмен между обращения матери и плода, а также функции как эндокринной и иммунной орган. Любое эндогенного или экзогенного оскорбление, которое препятствует плацентарный развития может привести к внутриутробного развития, потери плода или осложнений беременности, мышей и людей¹. В то время как количество целевых мыши мутаций, которые вызывают аномальные плаценты физиологии продолжает расти², с 219 генотипов, в настоящее время перечислены на веб-сайте информатики генома мыши (MGI) (http://www.informatics.jax.org/vocab/ mp_ontology / MP:0010038), не многие из этих фенотипы хорошо известны из механистической точки зрения. Наряду с генетическими аномалиями, малые молекулы наркотики, моноклональные антитела, токсинов патогенов, избыток метаболитов или различных экологических агентов могут повлиять на развитие плаценты и функции^{3,4,5 , 6 , 7}. Тем не менее, простые в vitro assays модель важнейшие шаги в развитие плаценты скудны.

Мышиных плацентарной развития начинается в начале midgestation, когда Аллантоис (развития предшественник пуповины) вытекает из заднего конца эмбриона как бутон, который растет в сторону хориона⁸. Chorioadhesive клетки в наружном слое allantoic бутон посредником вложение и распространение Аллантоис на поверхности хориона (chorioallantoic «фьюжн»). Хорион впоследствии складывается в Вилли, в которые сосудистую Аллантоис растет сформировать лабиринт, внутренний слой плацентарный, где питательные вещества и кислород обмениваются тесно совмещенных материнской крови синусоиды и эмбриональных судов^{9 ,10}.

Приверженность Аллантоис Хорион является первоначальный и критический шаг в формировании лабиринт, и дефекты в этом процессе являются одними из наиболее распространенных причин эмбриональной летальность в midgestation¹. Хотя ряд мыши мутантов были описаны chorioallantoic вложений не происходят¹⁰, где базы данных MGI в настоящее время перечислены 108 мыши мутантов, которые характеризуются ненормальных chorioallantoic Фьюжн (http:// www.informatics.JAX.org/Vocab/mp_ontology/MP:0002824), межклеточное взаимодействие между адгезии клеток сосудистой молекулы-1 (VCAM-1, выраженные на allantoic мезодермы) и α4β1 Интегрин (выраженный на хорионический мезотелия, который является производные от extraembryonic мезодермы) представляется необходимым для chorioallantoic привязанность и фьюжн^11,12,13. Иммуногистохимическое окрашивание всей гора одичал тип эмбрионов показали, что VCAM-1 выражается в дистальной две трети allantoic стеблю на приблизительно эмбриональных день (E) 7,5¹³ (1-4 Сомит этап), и что его выражение остается высоким во время chorioallantoic привязанность и – сплавливание^11,12. Провал allantoic привязанность к Хорион обычно обнаруживается гистологический анализ матки почки. Однако размеры Аллантоис физиологически сильно варьирует между ними и даже в пределах пометов же стадии развития¹⁴, и Аллантоис можно подключать только к хориона, когда она достигла достаточного размера, чтобы сделать физический контакт. Отражая этот естественной изменчивости, chorioallantoic насадку происходит где-то между ~ E 8.0 и E 9.0 в утробе материи статистически достоверное оценки этого процесса, гистология зависит поэтому анализ большого числа conceptuses для получения достаточно образцов на соответствующей стадии развития.

Здесь мы описываем метод для оценки allantoic вложение ex внутриутробно , в меньшей степени зависит от размера Аллантоис. Мы демонстрируем рассечение зародышей мыши и их allantoides от матки беременных мышей ~ 8 дней, сообщение coitum (dpc; dpc 0.5 обозначает обнаружения Вагинальные вилка), и последующие культуры Аллантоис эксплантах на иммобилизованных α4β1 интегринов. Этот метод позволяет быстрый, функциональной оценки вложения и распространение поведение нескольких Аллантоис эксплантов параллельно и в разное время последовательных точек. Протокол может использоваться экран для воздействия целевых мутации, наркотиков или различных экологических факторов на Аллантоис вложение ex vivo.

Protocol

Разведение мыши был одобрен Regierung Унтерфранкен, и все анализы проводились в строгом соответствии с немецкого и Европейского союза применимые законы и правила, касающиеся ухода и использования лабораторных животных. 1. покрытие микротитровальных плиты с α4β1 Интегрин Ex Ut…

Representative Results

Этот протокол описывает метод для изоляции и explant мышиных allantoides ex vivoи деталей качественной оценки Аллантоис привязанность к α4β1 Интегрин, критический процесс во время в vivo chorioallantoic фьюжн. Представитель результаты, показанные на рисунке 1A…

Discussion

Присутствии сыворотки, которая является богатым источником про клей внеклеточного матрикса молекул, например, фибронектин, Аллантоис эксплантов будет легко прикрепить различные пластика, стекла или фильтр поверхности^9,16. Таким образом если цель выполн?…

Materials

C57BL/6J wildtype mice	The Jackson Laboratory	Stock No: 000664
70 % (v/v) Ethanol	VWR International	930031006
Standard pattern forceps	Fine Science Tools	11000-12	Forceps used to open the abdominal cavity.
Micro dissecting forceps	Fine Science Tools	11254-20	Dumont # 5 medical biology forcepts with fine, sharp tip.
Fine scissors	Fine Science Tools	14094-11	Straight blades.
Spring scissors	Fine Science Tools	15012-12	Noyes spring scissors with 14 mm blades for the dissection of uterus buds.
Microspoon	Carl Roth	AT18.1	5 mm Spoon diameter.
Microtiter plates	ibidi	81501	We use uncoated, sterile angiogenesis slides (internal volume 50 µL) with a hydrophobic surface that is not tissue-culture treated to reduce non-a4b1-mediated binding to plastic.
10 cm dish	Nunc	150350	Sterile tissue culture dishes.
3.5 cm dish	Nunc	150288	Sterile tissue culture dishes.
Large orifice pipette tips	Biozym	VT0140X	Low binding pipette tips, 200 µL.
a4b1 integrin	R&D Systems	6054-A4	Murine a4b1 integrin recombinantly expressed and purified from a Chinese hamster ovary cell line.
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma Aldrich	D8537	Without Ca2+ and Mg2+.
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	PAN Biotech	P04-03600	The formulation contains 4.5 g/L glucose, 110 mg/L sodium pyruvate and 3.7 g/L NaHCO3 but no L-glutamine, which is added separately.
Penicillin/Streptomycin	Gibco (ThermoFisher Scientific)	15140-122	100 x (10,000 U/mL Penicillin and 10,000 µg/mL streptomycin) stock solution. Prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw.
L-Glutamine	PAN Biotech	P04-80100	100 x (200 mM) Stock solution. Prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw.
Fetal bovine serum	Biochrom	S 0115	We use heat-inactivated FBS (heated to 56 °C for 30 min with mixing to inactivate complement).
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A7030	We use protease- and fatty acid-free albumin. Prepare a 0.1 % (w/v) solution in DMEM. Sterile filter the solution through a disposable cell culture filter with a 0.22 µm pore size and low protein-binding membrane, and store aliquots at -20 °C.
para-Formaldehyde	Carl Roth	0335.2	To make a formaldehyde solution in PBS, weigh para-formaldehyde powder in a ventilated hood, and add it to PBS preheated to ca. 60 °C in a beaker on a stir plate. Add 1 N NaOH dropwise until solution clears. Let solution cool to room temperature, and filter through 0.22 mm filter syringe. Adjust pH with diluted HCl to ca. 6.9, and adjust to final volume with PBS. We aliquot and freeze the solution, but it can also be stored at 4 °C for approximately four weeks.
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100	Use wide-orifice pipette tips to handle undiluted Triton X-100.
Normal goat serum	Sigma Aldrich	G9023	To block non-specific binding of antibodies in immunofluorescence analyses.
a-CD31 Antibodies	BD Biosciences	550274	Purified rat anti-mouse monoclonal antibodies, clone MEC 13.3.
Secondary goat anti-rat antibodies	Thermo Fisher	A-11006	Goat anti-rat IgG (heavy and light chains), cross-adsorbed, fluorescently labeled with Alexa Fluor 488. Other fluorescent labels are also possible.
Mowiol 4-88	Sigma Aldrich	81381	Mounting medium for cytochemistry. MW ~31,000
Labovert	Leitz	Labovert	Inverted phase contrast microscope equipped with a 4 x and 10 x objective for somite pair counting. Other phase contrast microscopes (such as those that are routinely used in tissue culture) are also suitable.
M80	Leica Microsystems	M80	Stereomicroscope with 8 : 1 zoom range (yielding a magnification between 7.5 x and 60 x) for embryo and allantois dissection.
DM4000B	Leica Microsystems	DM4000B	Microscope system for histology with LED illumination. We use HCX PL FLUOTAR 5 x/0.15 and HC PL FLUOTAR 10 x/0.30 objectives. Other microscopes equipped phase contrast and fluorescence optics can be used to score allantois attachment.
Digital camera	JVC	KY-F75U	3-CCD digital capture camera attached to the DM4000B LED microscope. We use Diskus software (Hilgers) to operate both the microscope and the camera.
Confocal microscope	Leica Microsystems	SP5	Confocal microscope for higher-resolution imaging of endothelia in the vascular plexus of allantois explants. Immunofluorescence images were taken with a 40 x objective.