Dissection et la Culture Explant allantoïde murin pour l’analyse In Vitro de l’attachement allantoïdien

Summary

Nous décrivons un dosage in vitro à l’attachement de Chorio-modèle, la première étape dans la formation du placenta. Le protocole montre la culture dissection et explant de murins allantoides sur l’intégrine α4β1 immobilisée. Fixation de l’allantoïde est évaluée au microscope à des moments prédéterminés.

Abstract

Le placenta est essentiel pour la croissance et le développement de l’embryon de mammifère. Pour cette raison, nombreuses altérations génétiques et probables insultes aussi environnementales qui perturbent le développement du placenta ou une fonction peuvent causer perte de grossesse précoce chez les souris et les humains. Néanmoins, on manque de simple in vitro tests pour dépister les effets potentiels sur la formation du placenta. Ici, nous nous concentrons sur la modélisation de la première étape critique dans la formation de placenta, qui consiste en la fixation de l’allantoïde sur le chorion. Les auteurs décrivent une méthode pour évaluer rapidement l’attachement des explants allantoïdien sur l’intégrine α4β1 immobilisé, qui sert de substrat chorio-mimétique. Cette approche in vitro permet une évaluation qualitative de l’attachement et la diffusion de comportement d’explants d’allantoïde multiples à différents moments consécutifs. Le protocole peut être utilisé pour étudier l’effet de mutations ciblées de souris, de drogues ou divers facteurs environnementaux qui ont été liés aux complications de la grossesse ou la perte fœtale sur allantoïde fixation ex vivo.

Introduction

Le placenta est indispensable pour la croissance embryonnaire et développement au sein de l’utérus. Elle constitue l’interface pour l’oxygène, métabolite et échange de nutriments entre la circulation fœtale et maternelle, ainsi que des fonctions comme un organe endocrine et immunologique. Toute insulte endogène ou exogène qui entrave le développement placentaire peut entraîner un retard de croissance intra-utérin, la perte fœtale ou complications de la grossesse, tant chez les souris et les humains¹. Alors que le nombre de mutations de souris ciblées qui causent anormale physiologie placentaire continue d’augmenter de², avec 219 génotypes qui figurent actuellement sur le site Web de génome de souris informatique (MGI) (http://www.informatics.jax.org/vocab/ mp_ontology / MP:0010038), bon nombre de ces phénotypes ne sont pas bien compris d’un point de vue mécaniste. En plus des altérations génétiques, médicaments à petites molécules, anticorps monoclonaux, toxines, agents pathogènes, les métabolites excès ou divers agents environnementaux peuvent affecter développement placentaire et fonction^{3,4,5 , 6 , 7}. encore, simple in vitro tests que les étapes critiques de modèle dans le développement du placenta sont rares.

Murine développement placentaire est initié début mi-gestation, lorsque l’allantoïde (le précurseur du développement du cordon ombilical) émerge de l’extrémité postérieure de l’embryon comme un bourgeon qui se développe vers le chorion⁸. Chorioadhesive cellules de la couche externe de le œuf liquide allantoïdien médient l’attachement et la propagation de l’allantoïde sur la surface du chorion (Chorio-« fusion »). Le chorion se plie par la suite dans les villosités dans lequel le système vasculaire de l’allantoïde se développe pour former le labyrinthe, la couche interne de placentaire où les nutriments et l’oxygène sont échangés entre les sinusoïdes de sang maternel étroitement juxtaposées et vaisseaux embryonnaires^{9 ,},¹⁰.

La fixation de l’allantoïde sur le chorion est l’étape initiale et critique dans la formation du labyrinthe, et défauts de ce processus sont parmi les causes les plus fréquentes de létalité embryonnaire en milieu¹. Bien qu’un certain nombre de souris mutantes ont été décrits où Chorio-accessoire ne parvient pas à se produire¹⁰, et la base de données MGI répertorie actuellement 108 souris mutantes qui sont caractérisées par des anomalies Chorio-fusion (http:// www.Informatics.JAX.org/Vocab/mp_ontology/MP:0002824), l’interaction intercellulaire entre la molécule d’adhésion cellulaire vasculaire-1 (VCAM-1, exprimé sur le mésoderme allantoïdien) et l’intégrine α4β1 (exprimées sur le mésothélium chorionique, qui est dérivé du mésoderme extra-embryonnaire) semble indispensable pour Chorio-attachement et fusion^11,12,13. Marquage immunohistochimique des embryons de type sauvage entier-montent a montré que la VCAM-1 est exprimé dans les deux-tiers distal du pédoncule allantoïdien au jour environ embryonnaire (E) 7,5¹³ (stade de segments de 1-4), et que son expression reste élevée au cours de la Chorio-attachement et – fusion^11,12. Échec de fixation allantoïdienne au chorion est généralement détecté par l’analyse histologique des bourgeons de l’utérus. Toutefois, allantoïde tailles sont physiologiquement très variables entre les deux et même au sein des portées du même stade de développement¹⁴et l’allantoïde pouvez uniquement attacher au chorion lorsqu’il a atteint une taille suffisante pour établir le contact physique. Reflétant cette variabilité naturelle, Chorio-fixation a lieu quelque temps entre ~ E 8.0 et 9.0 E le dans l’utéruset à une évaluation statistiquement fiable de ce processus par l’histologie est donc tributaire de l’analyse d’un grand nombre de foetus à obtenir suffisamment d’échantillons au stade du développement approprié.

Nous décrivons ici une méthode pour évaluer des attachement allantoïdien ex utero qui est moins tributaire de la taille de l’allantoïde. Nous démontrons la dissection des embryons de souris et leurs allantoides de l’utérus de souris enceintes ~ 8 jours post coitum (dpc ; dpc 0,5 désigne la détection d’un bouchon vaginal), et la culture subséquente de l’allantoïde explants sur α4β1 immobilisé intégrines. Cette méthode permet une évaluation rapide et fonctionnelle de l’attachement et la diffusion de comportement d’explants d’allantoïde multiples en parallèle et à différents moments successifs. Le protocole peut être utilisé pour dépister les effets des mutations ciblées, de drogues ou de différents facteurs environnementaux sur l’allantoïde fixation ex vivo.

Protocol

Élevage de souris a été approuvé par le Regierung Unterfranken, et toutes les analyses ont été réalisées en stricte conformité avec tous les allemands et l’Union européenne aux lois et règlements concernant le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. 1. revêtement de microplaques plaques avec l’intégrine α4β1 pour Ex Utero allantoïde Explant Culture Reconstituer l’intégrine α4β1 murin lyophilisée stérile solution saline tamponnée au pho…

Representative Results

Ce protocole décrit une méthode pour isoler et explantation murin allantoides ex vivoet détaille l’évaluation qualitative de l’allantoïde pièce jointe à l’intégrine α4β1, un processus critique pendant en vivo Chorio-fusion. Les résultats représentatifs, illustrés à la Figure 1 a–H montrent les étapes successives d’isolement allantoïde à partir de l’utérus gravide. Des tissus mat…

Discussion

En présence de sérum, qui est une source riche en molécules de la matrice extracellulaire Pro-adhésif telles que la fibronectine, allantoïde explants s’attacheront facilement à divers plastique, verre ou filtre surfaces^9,16. Ainsi, si l’objectif de l’essai effectué est d’étudier plus précisément l’effet d’une modification génétique ou tout autre traitement sur l’attachement allantoïde à immobilisé α4β1, il est essentiel de bloquer d…

Materials

C57BL/6J wildtype mice	The Jackson Laboratory	Stock No: 000664
70 % (v/v) Ethanol	VWR International	930031006
Standard pattern forceps	Fine Science Tools	11000-12	Forceps used to open the abdominal cavity.
Micro dissecting forceps	Fine Science Tools	11254-20	Dumont # 5 medical biology forcepts with fine, sharp tip.
Fine scissors	Fine Science Tools	14094-11	Straight blades.
Spring scissors	Fine Science Tools	15012-12	Noyes spring scissors with 14 mm blades for the dissection of uterus buds.
Microspoon	Carl Roth	AT18.1	5 mm Spoon diameter.
Microtiter plates	ibidi	81501	We use uncoated, sterile angiogenesis slides (internal volume 50 µL) with a hydrophobic surface that is not tissue-culture treated to reduce non-a4b1-mediated binding to plastic.
10 cm dish	Nunc	150350	Sterile tissue culture dishes.
3.5 cm dish	Nunc	150288	Sterile tissue culture dishes.
Large orifice pipette tips	Biozym	VT0140X	Low binding pipette tips, 200 µL.
a4b1 integrin	R&D Systems	6054-A4	Murine a4b1 integrin recombinantly expressed and purified from a Chinese hamster ovary cell line.
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma Aldrich	D8537	Without Ca2+ and Mg2+.
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	PAN Biotech	P04-03600	The formulation contains 4.5 g/L glucose, 110 mg/L sodium pyruvate and 3.7 g/L NaHCO3 but no L-glutamine, which is added separately.
Penicillin/Streptomycin	Gibco (ThermoFisher Scientific)	15140-122	100 x (10,000 U/mL Penicillin and 10,000 µg/mL streptomycin) stock solution. Prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw.
L-Glutamine	PAN Biotech	P04-80100	100 x (200 mM) Stock solution. Prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw.
Fetal bovine serum	Biochrom	S 0115	We use heat-inactivated FBS (heated to 56 °C for 30 min with mixing to inactivate complement).
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A7030	We use protease- and fatty acid-free albumin. Prepare a 0.1 % (w/v) solution in DMEM. Sterile filter the solution through a disposable cell culture filter with a 0.22 µm pore size and low protein-binding membrane, and store aliquots at -20 °C.
para-Formaldehyde	Carl Roth	0335.2	To make a formaldehyde solution in PBS, weigh para-formaldehyde powder in a ventilated hood, and add it to PBS preheated to ca. 60 °C in a beaker on a stir plate. Add 1 N NaOH dropwise until solution clears. Let solution cool to room temperature, and filter through 0.22 mm filter syringe. Adjust pH with diluted HCl to ca. 6.9, and adjust to final volume with PBS. We aliquot and freeze the solution, but it can also be stored at 4 °C for approximately four weeks.
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100	Use wide-orifice pipette tips to handle undiluted Triton X-100.
Normal goat serum	Sigma Aldrich	G9023	To block non-specific binding of antibodies in immunofluorescence analyses.
a-CD31 Antibodies	BD Biosciences	550274	Purified rat anti-mouse monoclonal antibodies, clone MEC 13.3.
Secondary goat anti-rat antibodies	Thermo Fisher	A-11006	Goat anti-rat IgG (heavy and light chains), cross-adsorbed, fluorescently labeled with Alexa Fluor 488. Other fluorescent labels are also possible.
Mowiol 4-88	Sigma Aldrich	81381	Mounting medium for cytochemistry. MW ~31,000
Labovert	Leitz	Labovert	Inverted phase contrast microscope equipped with a 4 x and 10 x objective for somite pair counting. Other phase contrast microscopes (such as those that are routinely used in tissue culture) are also suitable.
M80	Leica Microsystems	M80	Stereomicroscope with 8 : 1 zoom range (yielding a magnification between 7.5 x and 60 x) for embryo and allantois dissection.
DM4000B	Leica Microsystems	DM4000B	Microscope system for histology with LED illumination. We use HCX PL FLUOTAR 5 x/0.15 and HC PL FLUOTAR 10 x/0.30 objectives. Other microscopes equipped phase contrast and fluorescence optics can be used to score allantois attachment.
Digital camera	JVC	KY-F75U	3-CCD digital capture camera attached to the DM4000B LED microscope. We use Diskus software (Hilgers) to operate both the microscope and the camera.
Confocal microscope	Leica Microsystems	SP5	Confocal microscope for higher-resolution imaging of endothelia in the vascular plexus of allantois explants. Immunofluorescence images were taken with a 40 x objective.