Dissectie en Explant cultuur van lymfkliertest Allantois voor de In Vitro analyse van allantoïs bijlage

Summary

We beschrijven een in vitro assay model chorion gehechtheid, de eerste stap in de vorming van de placenta. Het protocol blijkt de dissectie en explant cultuur van lymfkliertest allantoides op geïmmobiliseerdet α4β1 integrine. Allantois bijlage wordt microscopisch beoordeeld op vooraf bepaalde tijdstippen.

Abstract

De placenta is essentieel voor de groei en ontwikkeling van zoogdieren embryo’s. Om deze reden vele genetische veranderingen en waarschijnlijk ook milieu beledigingen die verstoren de ontwikkeling van de placenta of functie kunnen leiden tot vroege zwangerschap verlies bij muizen en mensen. Niettemin, is het eenvoudig in vitro testen om te screenen op de mogelijke gevolgen voor de vorming van de placenta ontbreken. Hier, concentreren we op het modelleren van de eerste en essentiële stap in de vorming van de placenta, die uit de gehechtheid van de allantois aan het chorion bestaat. Beschrijven we een methode om snel beoordelen van de gehechtheid van allantoïs explantaten op geïmmobiliseerdet α4β1 integrine, die als een chorio-mimetische substraat fungeert. Deze aanpak in vitro kunnen een kwalitatieve evaluatie van de bijlage en het verspreiden van gedrag van meerdere allantois explantaten op verschillende opeenvolgende tijdstippen. Het protocol kan worden gebruikt voor het onderzoeken van het effect van gerichte muis mutaties, drugs of verschillende omgevingsfactoren die zijn gekoppeld aan de zwangerschapscomplicaties of foetus verlies op allantois bijlage ex vivo.

Introduction

De placenta is onmisbaar voor embryonale groei en ontwikkeling in de baarmoeder omgeving. Het vormt de interface voor zuurstof, metaboliet, en voedende gegevensuitwisseling tussen de foetale en maternale circulatie, en ook functies als endocriene en immunologisch orgaan. Een endogene of exogene belediging dat belemmert de ontwikkeling van de placenta kan leiden tot uteriene groei retardatie, foetale verlies of zwangerschapscomplicaties, zowel in mens¹in muizen. Terwijl het aantal gerichte muis mutaties die leiden abnormale placenta fysiologie tot blijft toenemen², met 219 genotypen momenteel vermeld op de website van de muis genoom informatica (MGI) (http://www.informatics.jax.org/vocab/ mp_ontology / MP:0010038), veel van deze fenotypen zijn niet goed wordt begrepen vanuit een mechanistische oogpunt. Naast genetische veranderingen, klein molecuul drugs, monoklonale antilichamen, toxinen, ziekteverwekkers, overtollige metabolieten of verschillende milieu-agentia kunnen invloed op de ontwikkeling van de placenta en functie^{3,4,5 , 6 , 7}. toch eenvoudig in vitro testen dat model kritische stappen in de ontwikkeling van de placenta schaars zijn.

Lymfkliertest placenta ontwikkeling wordt gestart in de vroege midgestation, wanneer de allantois (de ontwikkelingstoxiciteit voorloper van de navelstreng) komt naar voren uit het posterieure einde van het embryo als een knop die naar de chorion-^{8 groeit}. Chorioadhesive cellen in de buitenste laag van de allantoïs kiem bemiddelen de gehechtheid en de verspreiding van de allantois op het oppervlak van het chorion (chorion “fusion”). De chorion vouwen vervolgens in villi waarin de therapieën van de allantois groeit om te vormen van het labyrint, de placenta binnenlaag waar voedingsstoffen en zuurstof uitgewisseld tussen dicht naast elkaar geplaatste moederlijk bloed sinusoïdes en embryonale vaartuigen^{9 ,10}.

De bevestiging van de allantois aan de chorion is de eerste en essentiële stap in labyrint vorming en gebreken in dit proces behoren tot de meest voorkomende oorzaken van embryonale letaliteit in midgestation¹. Hoewel een aantal mutanten muis hebben beschreven waar chorion gehechtheid mislukt optreden van¹⁰en de MGI-database bevat momenteel 108 muis mutanten die worden gekenmerkt door abnormale chorion fusion (http:// www.Informatics.Jax.org/vocab/mp_ontology/MP:0002824), de intercellulaire interactie tussen de vasculaire cel adhesie molecuul-1 (VCAM-1, uitgedrukt op het allantoïs mesoderm) en α4β1 integrine (uitgedrukt op de chorionic mesothelium, die is afgeleid van extraembryonic mesoderm) lijkt te zijn onmisbaar voor het chorion gehechtheid en fusion^11,12,13. Immunohistochemische kleuring van geheel-mount wild-type embryo’s is gebleken dat VCAM-1 wordt uitgedrukt in de distale tweederde van de allantoïs stengel op ongeveer embryonale dag (E) 7,5¹³ (1-4 Somiet fase), en dat haar expressie hoog blijft tijdens het chorion gehechtheid en -fusion^11,12. Gebrek allantoïs gehechtheid aan het chorion wordt normaal gesproken gedetecteerd door histologische analyses van baarmoeder toppen. Echter, allantois maten zijn fysiologisch zeer variabel in tussen, en zelfs binnen de nesten van de dezelfde ontwikkelingsstadium¹⁴, en de allantois kunt alleen toevoegen aan de chorion wanneer het een voldoende omvang te maken van fysiek contact heeft bereikt. Als gevolg van deze natuurlijke variabiliteit, chorion bijlage vindt plaats ergens tussen ~ E 8.0 en 9.0 E in uteroen een statistisch betrouwbare evaluatie van dit proces door histologie is daarom afhankelijk van de analyse van een groot aantal conceptuses verkrijgen van voldoende exemplaren op de juiste ontwikkelingsstadium.

Hier beschrijven we een methode om te beoordelen allantoïs bijlage ex utero dat is minder afhankelijk van de grootte van de allantois. We tonen de dissectie van muis embryo’s en hun allantoides uit de baarmoeders van zwangere muizen ~ 8 dagen post coitum (dpc; dpc 0,5 geeft de detectie van een vaginale plug), en de daaropvolgende cultuur van allantois explants op geïmmobiliseerdet α4β1 Integrins. Deze methode maakt een snelle, functionele evaluatie van de bijlage en het verspreiden van gedrag van meerdere allantois explantaten parallel en op verschillende opeenvolgende tijdstippen. Het protocol kan worden gebruikt aan het scherm voor de gevolgen van gerichte mutaties, drugs of verschillende omgevingsfactoren voor allantois bijlage ex vivo.

Protocol

Muis fokken werd goedgekeurd door de Regierung Unterfranken, en alle analyses werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met alle Duitse en Europese Unie geldende wetten en regelgeving inzake verzorging en het gebruik van proefdieren. 1. coating van de microtiterplaat platen met α4β1 integrine voor Ex Utero Allantois Explant cultuur Het reconstrueren van het gelyofiliseerd lymfkliertest α4β1 integrine bij 200 µg/mL in steriel-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Ver…

Representative Results

Dit protocol beschrijft een methode om te isoleren en explant lymfkliertest allantoides ex vivo, en details van de kwalitatieve beoordeling van allantois gehechtheid aan α4β1 integrine, een kritische proces tijdens in vivo chorion fusion. De representatieve resultaten die worden weergegeven in figuur 1A-H tonen de opeenvolgende stappen van isolatie van de allantois vanaf de zwangere baarmoeder. Maternale w…

Discussion

In aanwezigheid van serum, die een rijke bron van Pro-lijm extracellulaire matrix moleculen zoals fibronectin is, zal allantois explantaten gemakkelijk hechten aan verschillende kunststof, glas of^9,16van de oppervlakken van de filter. Als het doel van de uitgevoerde test is te specifiek onderzoeken van het effect van een genetische modificatie of iedere andere behandeling op allantois gehechtheid aan geïmmobiliseerd α4β1, is het dus cruciaal voor het blokkeren…

Materials

C57BL/6J wildtype mice	The Jackson Laboratory	Stock No: 000664
70 % (v/v) Ethanol	VWR International	930031006
Standard pattern forceps	Fine Science Tools	11000-12	Forceps used to open the abdominal cavity.
Micro dissecting forceps	Fine Science Tools	11254-20	Dumont # 5 medical biology forcepts with fine, sharp tip.
Fine scissors	Fine Science Tools	14094-11	Straight blades.
Spring scissors	Fine Science Tools	15012-12	Noyes spring scissors with 14 mm blades for the dissection of uterus buds.
Microspoon	Carl Roth	AT18.1	5 mm Spoon diameter.
Microtiter plates	ibidi	81501	We use uncoated, sterile angiogenesis slides (internal volume 50 µL) with a hydrophobic surface that is not tissue-culture treated to reduce non-a4b1-mediated binding to plastic.
10 cm dish	Nunc	150350	Sterile tissue culture dishes.
3.5 cm dish	Nunc	150288	Sterile tissue culture dishes.
Large orifice pipette tips	Biozym	VT0140X	Low binding pipette tips, 200 µL.
a4b1 integrin	R&D Systems	6054-A4	Murine a4b1 integrin recombinantly expressed and purified from a Chinese hamster ovary cell line.
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma Aldrich	D8537	Without Ca2+ and Mg2+.
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	PAN Biotech	P04-03600	The formulation contains 4.5 g/L glucose, 110 mg/L sodium pyruvate and 3.7 g/L NaHCO3 but no L-glutamine, which is added separately.
Penicillin/Streptomycin	Gibco (ThermoFisher Scientific)	15140-122	100 x (10,000 U/mL Penicillin and 10,000 µg/mL streptomycin) stock solution. Prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw.
L-Glutamine	PAN Biotech	P04-80100	100 x (200 mM) Stock solution. Prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw.
Fetal bovine serum	Biochrom	S 0115	We use heat-inactivated FBS (heated to 56 °C for 30 min with mixing to inactivate complement).
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A7030	We use protease- and fatty acid-free albumin. Prepare a 0.1 % (w/v) solution in DMEM. Sterile filter the solution through a disposable cell culture filter with a 0.22 µm pore size and low protein-binding membrane, and store aliquots at -20 °C.
para-Formaldehyde	Carl Roth	0335.2	To make a formaldehyde solution in PBS, weigh para-formaldehyde powder in a ventilated hood, and add it to PBS preheated to ca. 60 °C in a beaker on a stir plate. Add 1 N NaOH dropwise until solution clears. Let solution cool to room temperature, and filter through 0.22 mm filter syringe. Adjust pH with diluted HCl to ca. 6.9, and adjust to final volume with PBS. We aliquot and freeze the solution, but it can also be stored at 4 °C for approximately four weeks.
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100	Use wide-orifice pipette tips to handle undiluted Triton X-100.
Normal goat serum	Sigma Aldrich	G9023	To block non-specific binding of antibodies in immunofluorescence analyses.
a-CD31 Antibodies	BD Biosciences	550274	Purified rat anti-mouse monoclonal antibodies, clone MEC 13.3.
Secondary goat anti-rat antibodies	Thermo Fisher	A-11006	Goat anti-rat IgG (heavy and light chains), cross-adsorbed, fluorescently labeled with Alexa Fluor 488. Other fluorescent labels are also possible.
Mowiol 4-88	Sigma Aldrich	81381	Mounting medium for cytochemistry. MW ~31,000
Labovert	Leitz	Labovert	Inverted phase contrast microscope equipped with a 4 x and 10 x objective for somite pair counting. Other phase contrast microscopes (such as those that are routinely used in tissue culture) are also suitable.
M80	Leica Microsystems	M80	Stereomicroscope with 8 : 1 zoom range (yielding a magnification between 7.5 x and 60 x) for embryo and allantois dissection.
DM4000B	Leica Microsystems	DM4000B	Microscope system for histology with LED illumination. We use HCX PL FLUOTAR 5 x/0.15 and HC PL FLUOTAR 10 x/0.30 objectives. Other microscopes equipped phase contrast and fluorescence optics can be used to score allantois attachment.
Digital camera	JVC	KY-F75U	3-CCD digital capture camera attached to the DM4000B LED microscope. We use Diskus software (Hilgers) to operate both the microscope and the camera.
Confocal microscope	Leica Microsystems	SP5	Confocal microscope for higher-resolution imaging of endothelia in the vascular plexus of allantois explants. Immunofluorescence images were taken with a 40 x objective.