Dissektion und modellabhängigen Kultur der murinen Allantois zur In-vitro- Analyse der Viruswenig Anlage

Summary

Wir beschreiben einen in-vitro- Test auf Modell chorioallantoic Anlage, der erste Schritt bei der Bildung der Plazenta. Das Protokoll zeigt die Dissektion und modellabhängigen Kultur der murinen Allantoides auf immobilisierte α4β1 Integrin. Allantois Anlage wird mikroskopisch zu vorher festgelegten Zeitpunkten ausgewertet.

Abstract

Die Plazenta ist essentiell für das Wachstum und die Entwicklung von Säugetier-Embryonen. Aus diesem Grund können zahlreiche genetische Veränderungen und wahrscheinlich auch ökologische Beleidigungen, die Plazenta-Entwicklung oder Funktion stören frühen Schwangerschaft bei Mäusen und Menschen verloren gehen. Dennoch fehlen einfache in-vitro- Assays für mögliche Auswirkungen auf die Bildung der Plazenta auf den Bildschirm. Hier konzentrieren wir uns auf die Modellierung der ersten und entscheidenden Schritt in Plazenta-Formation, bestehend aus der Befestigung des die Allantois an der Chorion. Wir beschreiben eine Methode, um schnell die Befestigung der Viruswenig Explantaten an immobilisierte α4β1 Integrin, bewerten die als Chorio-mimetischen Substrat dient. Dieser in-vitro- Ansatz ermöglicht eine qualitative Bewertung der Anlage und Verhalten von mehreren Allantois Explantaten zu verschiedenen aufeinander folgenden Zeitpunkten zu verbreiten. Das Protokoll kann verwendet werden, untersuchen die Wirkung von gezielten Maus Mutationen, Drogen oder verschiedene Umweltfaktoren, die zu Komplikationen während der Schwangerschaft oder fetale Verlust aus der Allantois Anlage ex Vivoverknüpft wurden.

Introduction

Die Plazenta ist unverzichtbar für embryonale Wachstum und Entwicklung in der Gebärmutter. Es bildet die Schnittstelle für Sauerstoff, Metaboliten und Nährstoffaustausch zwischen fetalen und mütterlichen Kreislauf, und auch Funktionen als endokrine und immunologische Organ. Jede endogene oder exogene Beleidigung, die plazentaren Entwicklung beeinträchtigt führen zu intrauterine Wachstumsverzögerung, fetale Verlust oder Komplikationen während der Schwangerschaft, bei Mäusen und Menschen¹. Während die Zahl der gezielten Maus Mutationen, abnorme plazentar Physiologie verursachen, weiter erhöht², 219 Genotypen, die derzeit auf der Website der Maus Genom Informatik (MGI) aufgeführt (http://www.informatics.jax.org/vocab/ Mp_ontology / MP:0010038), viele von diesen Phänotypen sind nicht gut verstanden, aus einem mechanistischen Sicht. Neben der genetischen Veränderungen, niedermolekulare Medikamente, monoklonale Antikörper, Toxine beeinträchtigen Krankheitserreger, überschüssige Stoffwechselprodukte oder verschiedene Umweltfaktoren Plazenta-Entwicklung und Funktion^{3,4,5 , 6 , 7}. doch einfach in-vitro- Tests, dass Modell wichtige Schritte in der Entwicklung der Plazenta knapp sind.

Murine plazentar Entwicklung im frühen Midgestation beginnt, wenn die Allantois (developmental Vorläufer der Nabelschnur) vom hinteren Ende des Embryos als eine Knospe entsteht, die in Richtung der Chorion⁸wächst. Chorioadhesive Zellen in der äußeren Schicht der Viruswenig Knospe vermitteln die Befestigung und Verbreitung der Allantois auf der Oberfläche des Chorion (chorioallantoic “Fusion”). Das Chorion faltet sich anschließend in Zotten in die das Gefäßsystem der Allantois wächst, das Labyrinth, die innere Schicht der Plazenta zu bilden, wo Nährstoffe und Sauerstoff zwischen eng nebeneinander angeordnete mütterlichen Blut Sinusoide und embryonale Gefäße^{9 ausgetauscht werden ,10}.

Die Befestigung der Allantois an das Chorion ist der erste und entscheidende Schritt in Labyrinth Bildung und Mängel in diesem Prozess gehören zu den häufigsten Ursachen von embryonalen Tödlichkeit in midgestation¹. Obwohl eine Reihe von Maus-Mutanten beschrieben worden, denen chorioallantoic Anlage scheitert¹⁰auftreten, und die MGI-Datenbank listet derzeit 108 Maus-Mutanten, die durch abnorme chorioallantoic Fusion (http:// gekennzeichnet sind Www.Informatics.Jax.org/Vocab/mp_ontology/MP:0002824), die interzelluläre Interaktion zwischen die vaskuläre Zelle Adhäsion Molekül-1 (VCAM-1, drückte auf den Viruswenig Mesoderm) und α4β1 Integrin (ausgedrückt auf die Chorion Mesothelium, die abgeleitet von extraembryonic Mesoderm) scheint für chorioallantoic Anlage und Fusion^11,12,13unverzichtbar sein. Immunhistochemische Färbung des gesamten-Mount Wildtyp Embryonen hat gezeigt, dass VCAM-1 innerhalb der distale zwei Drittel der Viruswenig Stiel etwa embryonale Tag (E) 7,5 ausgedrückt wird¹³ (1-4 Somiten Bühne) und seinen Ausdruck bleibt hoch während chorioallantoic Anlage und -Fusion^11,12. Ausfall der Viruswenig Bindung an das Chorion ist in der Regel durch histologische Analysen der Gebärmutter Knospen erkannt. Jedoch Allantois Größen sind physiologisch sehr variabel zwischen und sogar innerhalb Würfe von der gleichen Entwicklungsstufe¹⁴, und die Allantois kann nur an die Chorion anfügen, wenn sie eine ausreichende Größe, körperlichen Kontakt zu machen erreicht hat. Reflektieren diese natürliche Variabilität, chorioallantoic Anlage findet irgendwann zwischen ~ E 8.0 und 9.0 E in der Gebärmutterund eine statistisch zuverlässige Beurteilung dieses Verfahrens durch Histologie ist also abhängig von der Analyse einer großen Anzahl von Conceptuses, genügend Exemplare in den entsprechenden Entwicklungsstadium zu erhalten.

Hier beschreiben wir eine Methode zur Bestimmung Viruswenig Anlage ex Utero , die Allantois Größe weniger abhängig ist. Wir demonstrieren das Sezieren von Mäuseembryonen und ihre Allantoides aus Uteri von schwangeren Mäusen ~ 8 Tage post Coitum (Dpc; Dpc 0,5 bezeichnet die Erkennung von einem vaginalen Stecker), und die nachfolgende Kultur der Allantois explants auf immobilisierte α4β1 Integrine. Diese Methode ermöglicht eine schnelle, funktionale Bewertung der Anlage und Verhalten von mehreren Allantois Explantaten parallel und zu verschiedenen aufeinander folgenden Zeitpunkten zu verbreiten. Das Protokoll kann verwendet werden zum Bildschirm für die Auswirkungen von gezielter Mutationen, Drogen oder verschiedene Umweltfaktoren auf Allantois Anlage ex Vivo.

Protocol

Maus-Zucht von der Regierung Unterfranken genehmigt wurde, und alle Analysen wurden unter strikter Einhaltung aller deutschen und Europäischen Union geltenden Gesetzen und Vorschriften rund um Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt. (1) Beschichtung der Mikrotiter-Platten mit α4β1 Integrin für Ex Utero Allantois Explant Kultur Bereiten Sie die lyophilisierten murinen α4β1 Integrin bei 200 µg/mL in sterilen Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS). Um ein…

Representative Results

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zum isolieren und explant murinen Allantoides ex Vivound details die qualitative Bewertung der Allantois Bindung an α4β1 Integrin, ein kritischer Prozess bei der in Vivo chorioallantoic Fusion. Die repräsentativen Ergebnisse in Abbildung 1A–H zeigen die aufeinander folgenden Schritte der Allantois Isolation der schwangeren Gebärmutter ab. Mütterlichen Gewebe, d…

Discussion

In Anwesenheit von Serum, das ist eine reiche Quelle von pro-Kleber extrazelluläre Matrix Moleküle wie Fibronektin, werden Allantois Explantaten leicht verschiedenen Kunststoff, Glas oder Filter Oberflächen^9,16beimessen. Deshalb wenn der durchgeführten Test speziell die Auswirkung einer genetischen Veränderung zu untersuchen soll oder eine andere Behandlung auf Allantois Bindung an α4β1 immobilisiert, kritische, unspezifischen Bindungsstellen (z. B.</e…

Materials

C57BL/6J wildtype mice	The Jackson Laboratory	Stock No: 000664
70 % (v/v) Ethanol	VWR International	930031006
Standard pattern forceps	Fine Science Tools	11000-12	Forceps used to open the abdominal cavity.
Micro dissecting forceps	Fine Science Tools	11254-20	Dumont # 5 medical biology forcepts with fine, sharp tip.
Fine scissors	Fine Science Tools	14094-11	Straight blades.
Spring scissors	Fine Science Tools	15012-12	Noyes spring scissors with 14 mm blades for the dissection of uterus buds.
Microspoon	Carl Roth	AT18.1	5 mm Spoon diameter.
Microtiter plates	ibidi	81501	We use uncoated, sterile angiogenesis slides (internal volume 50 µL) with a hydrophobic surface that is not tissue-culture treated to reduce non-a4b1-mediated binding to plastic.
10 cm dish	Nunc	150350	Sterile tissue culture dishes.
3.5 cm dish	Nunc	150288	Sterile tissue culture dishes.
Large orifice pipette tips	Biozym	VT0140X	Low binding pipette tips, 200 µL.
a4b1 integrin	R&D Systems	6054-A4	Murine a4b1 integrin recombinantly expressed and purified from a Chinese hamster ovary cell line.
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma Aldrich	D8537	Without Ca2+ and Mg2+.
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	PAN Biotech	P04-03600	The formulation contains 4.5 g/L glucose, 110 mg/L sodium pyruvate and 3.7 g/L NaHCO3 but no L-glutamine, which is added separately.
Penicillin/Streptomycin	Gibco (ThermoFisher Scientific)	15140-122	100 x (10,000 U/mL Penicillin and 10,000 µg/mL streptomycin) stock solution. Prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw.
L-Glutamine	PAN Biotech	P04-80100	100 x (200 mM) Stock solution. Prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw.
Fetal bovine serum	Biochrom	S 0115	We use heat-inactivated FBS (heated to 56 °C for 30 min with mixing to inactivate complement).
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A7030	We use protease- and fatty acid-free albumin. Prepare a 0.1 % (w/v) solution in DMEM. Sterile filter the solution through a disposable cell culture filter with a 0.22 µm pore size and low protein-binding membrane, and store aliquots at -20 °C.
para-Formaldehyde	Carl Roth	0335.2	To make a formaldehyde solution in PBS, weigh para-formaldehyde powder in a ventilated hood, and add it to PBS preheated to ca. 60 °C in a beaker on a stir plate. Add 1 N NaOH dropwise until solution clears. Let solution cool to room temperature, and filter through 0.22 mm filter syringe. Adjust pH with diluted HCl to ca. 6.9, and adjust to final volume with PBS. We aliquot and freeze the solution, but it can also be stored at 4 °C for approximately four weeks.
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100	Use wide-orifice pipette tips to handle undiluted Triton X-100.
Normal goat serum	Sigma Aldrich	G9023	To block non-specific binding of antibodies in immunofluorescence analyses.
a-CD31 Antibodies	BD Biosciences	550274	Purified rat anti-mouse monoclonal antibodies, clone MEC 13.3.
Secondary goat anti-rat antibodies	Thermo Fisher	A-11006	Goat anti-rat IgG (heavy and light chains), cross-adsorbed, fluorescently labeled with Alexa Fluor 488. Other fluorescent labels are also possible.
Mowiol 4-88	Sigma Aldrich	81381	Mounting medium for cytochemistry. MW ~31,000
Labovert	Leitz	Labovert	Inverted phase contrast microscope equipped with a 4 x and 10 x objective for somite pair counting. Other phase contrast microscopes (such as those that are routinely used in tissue culture) are also suitable.
M80	Leica Microsystems	M80	Stereomicroscope with 8 : 1 zoom range (yielding a magnification between 7.5 x and 60 x) for embryo and allantois dissection.
DM4000B	Leica Microsystems	DM4000B	Microscope system for histology with LED illumination. We use HCX PL FLUOTAR 5 x/0.15 and HC PL FLUOTAR 10 x/0.30 objectives. Other microscopes equipped phase contrast and fluorescence optics can be used to score allantois attachment.
Digital camera	JVC	KY-F75U	3-CCD digital capture camera attached to the DM4000B LED microscope. We use Diskus software (Hilgers) to operate both the microscope and the camera.
Confocal microscope	Leica Microsystems	SP5	Confocal microscope for higher-resolution imaging of endothelia in the vascular plexus of allantois explants. Immunofluorescence images were taken with a 40 x objective.