विच्छेदन और Explant संस्कृति के लिए Murine Allantois के इन विट्रो विश्लेषण Allantoic लगाव के
Summary
हम का वर्णन एक इन विट्रो परख मॉडल chorioallantoic लगाव करने के लिए, अपरा गठन में पहला कदम । यह प्रोटोकॉल murine allantoides के विच्छेदन और explant कल्चर को मैटीरियल α4β1 integrin पर प्रदर्शित करता है । Allantois अनुलग्नक पूर्व निर्धारित समय बिंदुओं पर microscopically का मूल्यांकन किया जाता है.
Abstract
अपरा स्तनधारी भ्रूण की वृद्धि और विकास के लिए आवश्यक है । इस कारण से, कई आनुवंशिक परिवर्तन और संभावना भी पर्यावरणीय अपमान है कि अपरा विकास या समारोह परेशान चूहों और मनुष्यों में जल्दी गर्भावस्था हानि पैदा कर सकता है । फिर भी, अपरा गठन पर संभावित प्रभाव के लिए स्क्रीन करने के लिए इन विट्रो परख में सरल कमी कर रहे हैं । यहां, हम अपरा गठन में पहला और महत्वपूर्ण कदम मॉडलिंग पर ध्यान केंद्रित है, जो allantois के लगाव के होते है चोरियों के लिए । हम एक विधि का वर्णन तेजी से मैटीरियल α4β1 integrin, जो एक chorio-करनेवाला सब्सट्रेट के रूप में कार्य करता है पर allantoic explants के लगाव का आकलन करने के लिए । यह इन विट्रो दृष्टिकोण में सक्षम बनाता है एक गुणात्मक मूल्यांकन अनुलग्नक और विभिंन लगातार समय बिंदुओं पर एकाधिक allantois explants के व्यवहार के प्रसार । प्रोटोकॉल को लक्षित माउस उत्परिवर्तनों, दवाओं, या विभिंन पर्यावरणीय कारकों है कि गर्भावस्था जटिलताओं या allantois लगाव पर भ्रूण हानि के लिए जोड़ा गया है के प्रभाव की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है पूर्व vivo।
Introduction
अपरा गर्भाशय के वातावरण में भ्रूण विकास और विकास के लिए अपरिहार्य है । यह भ्रूण और मातृ संचलन के बीच ऑक्सीजन, metabolite, और पोषक तत्वों के आदान प्रदान के लिए इंटरफेस का गठन, और भी एक अंत-स्रावी और प्रतिरक्षा अंग के रूप में कार्य करता है. किसी भी अंतर्जात या exogenous अपमान है कि अपरा विकास बिगड़ा अंतर्गर्भाशयी विकास मंदता, भ्रूण हानि, या गर्भावस्था जटिलताओं, दोनों चूहों में और मनुष्यों में1के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । जबकि लक्षित माउस उत्परिवर्तनों कि असामांय अपरा शरीर क्रिया विज्ञान के कारण की संख्या को बढ़ाने के लिए जारी है2, २१९ पादी वर्तमान में माउस जीनोम सूचना विज्ञान (MGI) वेबसाइट पर सूचीबद्ध के साथ (http://www.informatics.jax.org/vocab/mp_ontology/ MP: 0010038), इन phenotypes के कई एक यंत्रवत दृष्टिकोण से अच्छी तरह से नहीं समझ रहे हैं । आनुवंशिक परिवर्तन के अलावा, छोटे अणु दवाओं, मोनोक्लोनल एंटीबॉडी, विषाक्त पदार्थों, रोगजनकों, अतिरिक्त चयापचयों, या विभिंन पर्यावरणीय एजेंटों अपरा विकास और समारोह को प्रभावित कर सकते है3,4,5 , ६ , 7. फिर भी, सरल इन विट्रो परख है कि अपरा विकास में महत्वपूर्ण कदम दुर्लभ हैं ।
Murine अपरा विकास जल्दी midgestation में शुरू की है, जब allantois (गर्भनाल के विकास के अग्रदूत) एक कली है कि चोरियों की ओर बढ़ता है के रूप में भ्रूण के पीछे अंत से उभर8। allantoic कली की बाहरी परत में Chorioadhesive कोशिकाएं (chorioallantoic “फ्यूजन”) चोरियों की सतह पर allantois के लगाव और प्रसार को मध्यस्थता । चोरियों के बाद विल्ली में जो allantois के vasculature के लिए भूलभुलैया फार्म, भीतरी अपरा परत जहां पोषक तत्वों और ऑक्सीजन बारीकी से झकझोरता मातृ रक्त sinusoids और भ्रूण वाहिकाओं 9 के बीच विमर्श कर रहे है बढ़ता में परतों ,10.
चोरियों के लिए allantois के लगाव भूलभुलैया गठन में प्रारंभिक और महत्वपूर्ण कदम है, और इस प्रक्रिया में दोष भ्रूण की मृत्यु के सबसे आम कारणों में से हैं midgestation1में । हालांकि माउस म्यूटेंट की संख्या वर्णित किया गया है जहां chorioallantoic अनुलग्नक10होने के लिए विफल रहता है, और MGI डेटाबेस वर्तमान में सूचियों १०८ माउस म्यूटेंट जो असामान्य chorioallantoic फ्यूजन द्वारा विशेषता है (http:// www.informatics.jax.org/vocab/mp_ontology/MP:0002824), संवहनी कोशिका आसंजन अणु के बीच पारस्परिक संपर्क-1 (VCAM-1, allantoic त्वक पर व्यक्त) और α4β1 integrin (chorionic mesothelium, जो है पर व्यक्त extraembryonic त्वक से व्युत्पंन) chorioallantoic लगाव और फ्यूजन11,12,13के लिए अपरिहार्य प्रतीत होता है । Immunohistochemical पूरे-माउंट जंगली प्रकार के भ्रूण के दाग से पता चला है कि VCAM-1 लगभग भ्रूण दिवस पर allantoic डंठल के बाहर के दो तिहाई के भीतर व्यक्त किया जाता है (E) ७.५13 (1-4 somite चरण), और है कि इसकी अभिव्यक्ति उच्च रहता है दौरान chorioallantoic लगाव व-फ्यूजन11,12. चोरियों के लिए allantoic लगाव की विफलता आमतौर पर गर्भाशय कलियों के ऊतकीय विश्लेषण से पता चला है । हालांकि, allantois आकार के बीच में शारीरिक रूप से अत्यधिक चर रहे है और यहां तक कि एक ही विकास के चरण14के कूड़े के भीतर, और allantois केवल चोरियों को संलग्न कर सकते है जब यह एक पर्याप्त आकार तक पहुंच गया है शारीरिक संपर्क बनाने के लिए । इस प्राकृतिक परिवर्तनशीलता को प्रतिबिंबित करता है, chorioallantoic लगाव जगह लेता है कुछ समय के बीच ~ e ८.० और ई ९.० utero में, और इस प्रक्रिया के एक सांख्यिकीय विश्वसनीय मूल्यांकन प्रोटोकॉल द्वारा इसलिए की एक बड़ी संख्या के विश्लेषण पर निर्भर है conceptuses उचित विकास के स्तर पर पर्याप्त नमूनों को प्राप्त करने के लिए ।
यहाँ, हम allantois आकार पर कम निर्भर है कि allantoic अनुलग्नक ex utero का आकलन करने के लिए एक विधि का वर्णन करें । हम चूहे भ्रूण के विच्छेदन और उनके allantoides गर्भवती चूहों के uteri से प्रदर्शित करता है ~ 8 दिन पोस्ट coitum (डीपीसी; डीपीसी ०.५ एक योनि प्लग का पता लगाने के लिए नियत), और allantois explants के बाद संस्कृति मैटीरियल α4β1 पर integrins । इस विधि में सक्षम बनाता है एक तेजी से, संलग्नक के कार्यात्मक मूल्यांकन और प्रसार के व्यवहार में एकाधिक allantois explants के समानांतर और लगातार समय अंक पर अलग है । प्रोटोकॉल के लिए लक्षित उत्परिवर्तनों, दवाओं, या allantois लगाव पूर्व vivoपर विभिंन पर्यावरणीय कारकों के प्रभाव के लिए स्क्रीन इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
सीरम की उपस्थिति है, जो समर्थक चिपकने वाला extracellular मैट्रिक्स अणुओं की एक समृद्ध स्रोत है जैसे fibronectin, allantois explants आसानी से विभिंन प्लास्टिक, कांच, या फिल्टर9,16सतहों को संलग्न करेगा । इस प्रक?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम ड्यूश Forschungsgemeinschaft SFB688 (A.G. के लिए) द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| C57BL/6J wildtype mice | The Jackson Laboratory | Stock No: 000664 | |
| 70 % (v/v) Ethanol | VWR International | 930031006 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | Forceps used to open the abdominal cavity. |
| Micro dissecting forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | Dumont # 5 medical biology forcepts with fine, sharp tip. |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14094-11 | Straight blades. |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15012-12 | Noyes spring scissors with 14 mm blades for the dissection of uterus buds. |
| Microspoon | Carl Roth | AT18.1 | 5 mm Spoon diameter. |
| Microtiter plates | ibidi | 81501 | We use uncoated, sterile angiogenesis slides (internal volume 50 µL) with a hydrophobic surface that is not tissue-culture treated to reduce non-a4b1-mediated binding to plastic. |
| 10 cm dish | Nunc | 150350 | Sterile tissue culture dishes. |
| 3.5 cm dish | Nunc | 150288 | Sterile tissue culture dishes. |
| Large orifice pipette tips | Biozym | VT0140X | Low binding pipette tips, 200 µL. |
| a4b1 integrin | R&D Systems | 6054-A4 | Murine a4b1 integrin recombinantly expressed and purified from a Chinese hamster ovary cell line. |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma Aldrich | D8537 | Without Ca2+ and Mg2+. |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | PAN Biotech | P04-03600 | The formulation contains 4.5 g/L glucose, 110 mg/L sodium pyruvate and 3.7 g/L NaHCO3 but no L-glutamine, which is added separately. |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 15140-122 | 100 x (10,000 U/mL Penicillin and 10,000 µg/mL streptomycin) stock solution. Prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw. |
| L-Glutamine | PAN Biotech | P04-80100 | 100 x (200 mM) Stock solution. Prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw. |
| Fetal bovine serum | Biochrom | S 0115 | We use heat-inactivated FBS (heated to 56 °C for 30 min with mixing to inactivate complement). |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A7030 | We use protease- and fatty acid-free albumin. Prepare a 0.1 % (w/v) solution in DMEM. Sterile filter the solution through a disposable cell culture filter with a 0.22 µm pore size and low protein-binding membrane, and store aliquots at -20 °C. |
| para-Formaldehyde | Carl Roth | 0335.2 | To make a formaldehyde solution in PBS, weigh para-formaldehyde powder in a ventilated hood, and add it to PBS preheated to ca. 60 °C in a beaker on a stir plate. Add 1 N NaOH dropwise until solution clears. Let solution cool to room temperature, and filter through 0.22 mm filter syringe. Adjust pH with diluted HCl to ca. 6.9, and adjust to final volume with PBS. We aliquot and freeze the solution, but it can also be stored at 4 °C for approximately four weeks. |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | Use wide-orifice pipette tips to handle undiluted Triton X-100. |
| Normal goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | To block non-specific binding of antibodies in immunofluorescence analyses. |
| a-CD31 Antibodies | BD Biosciences | 550274 | Purified rat anti-mouse monoclonal antibodies, clone MEC 13.3. |
| Secondary goat anti-rat antibodies | Thermo Fisher | A-11006 | Goat anti-rat IgG (heavy and light chains), cross-adsorbed, fluorescently labeled with Alexa Fluor 488. Other fluorescent labels are also possible. |
| Mowiol 4-88 | Sigma Aldrich | 81381 | Mounting medium for cytochemistry. MW ~31,000 |
| Labovert | Leitz | Labovert | Inverted phase contrast microscope equipped with a 4 x and 10 x objective for somite pair counting. Other phase contrast microscopes (such as those that are routinely used in tissue culture) are also suitable. |
| M80 | Leica Microsystems | M80 | Stereomicroscope with 8 : 1 zoom range (yielding a magnification between 7.5 x and 60 x) for embryo and allantois dissection. |
| DM4000B | Leica Microsystems | DM4000B | Microscope system for histology with LED illumination. We use HCX PL FLUOTAR 5 x/0.15 and HC PL FLUOTAR 10 x/0.30 objectives. Other microscopes equipped phase contrast and fluorescence optics can be used to score allantois attachment. |
| Digital camera | JVC | KY-F75U | 3-CCD digital capture camera attached to the DM4000B LED microscope. We use Diskus software (Hilgers) to operate both the microscope and the camera. |
| Confocal microscope | Leica Microsystems | SP5 | Confocal microscope for higher-resolution imaging of endothelia in the vascular plexus of allantois explants. Immunofluorescence images were taken with a 40 x objective. |
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