Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Microprobe kılcal Elektroforez kütle spektrometresi canlı Kurbağa (Xenopus laevis) embriyo tek hücreli Metabolomics için

Published: December 22, 2017 doi: 10.3791/56956
Automatic Translation
1, 1, 2, 1,3
1Department of Chemistry, George Washington University, 2Department of Anatomy & Regenerative Biology, George Washington University, 3Department of Chemistry & Biochemistry, University of Maryland, College Park

Summary

Biz hızlı içinde in situ örnekleme yüksek kesinlik ve en az işgal kılcal tabanlı mikro-örnekleme, kimyasal bir anlık görüntüsünü metabolik aktivite karakterizasyonu kolaylaştırmak için kullanarak tek bir hücre bulunan küçük bir bölümünün etkinleştirmek adımları tarif canlı embriyolar bir ölçüye göre tek hücre Kapiler Elektroforez ve kütle spektrometresi platformu kullanarak.

Abstract

Tek Kişilik hücrelerde küçük moleküllerin miktar embriyonik geliştirme altında yatan temel süreçleri daha iyi anlamak için yeni potansiyelleri yükseltir. Doğrudan içinde canlı embriyolar, yeni analitik yaklaşımlar ihtiyaç vardır, olanaklı kılmak tek hücreli araştırmalar özellikle de hassas, seçici, nicel, güçlü ve ölçeklenebilir farklı hücre boyutu için vardır için. Burada, serbestçe Güney Afrika pençeli kurbağası (Xenopus laevis), hücre ve gelişim biyolojisi güçlü bir model embriyoların gelişmekte olan tek hücre metabolizmasında situ analizini sağlayan bir iletişim kuralı mevcut. Bu yaklaşım bir kapiller microprobe daha sonraki analiz için komşu hücreleri dokunmadan embriyo, tek tanımlanan hücreleri tanımlanmış bir kısmı Aspire için kullanır. Toplanan hücre içeriğini yüksek çözünürlüklü tandem Kütle Spektrometre birleştiğinde bir microscale kılcal Elektroforez electrospray iyonlaşma (CE-ESI) arabirimi tarafından analiz edilir. Bu yaklaşım çeşitli hücre boyutları için ölçeklenebilir ve gelişmekte olan embriyo karmaşık üç boyutlu yapısı ile uyumlu. Örneğin, tek hücreli CE-ESI-Bayan progenitör hücre embriyo gelişimi sırasında torunlarına açmaktadır gibi izlerken metabolik hücre heterojenite aydınlatma sağlar bu microprobe göstermektedir. Hücre ve gelişim biyolojisi yanı sıra, burada açıklanan tek hücreli analiz protokolleri diğer hücre boyutları, hücre tipleri veya hayvan modelleri mükellef bulunmaktadır.

Introduction

Embriyonik geliştirme kapsamlı bir anlayış gelişmekte olan organizmanın her hücrede açılmak tüm moleküler değişiklikleri karakterizasyonu gerektirir. Yeni nesil Sekanslama moleküler güçlendirme ile sağlayan tek hücreli transcriptomes1 gelişmekte olan sistemleri2,3, önemli ölçüde daha az derin ölçüm daha küçük moleküller dizisi hakkında bilinir proteinler ve, özellikle, metabolitleri gibi tek embriyonik hücrelerinde üretilen (molekül ağırlığı < ~ 1500 Da). Bir hızlı ve dinamik ile olaylara yanıt olarak içsel ve dışsal, metabolome bir hücrenin moleküler devlet güçlü bir tanımlayıcısı olarak hizmet vermektedir. Tek hücreli metabolome, bu nedenle, potansiyel hücre heterojenite erken embriyo içinde kayma ve temporal gelişimini izlemek ve fonksiyonel çalışmalar için yeni moleküller tanımlamak için yükseltir. Ancak, moleküler amplifikasyon bu moleküller için kullanılabilir olağanüstü duyarlılık metaboliti analiz için tercih edilen teknoloji olan kütle spektrometresi (MS),'ı kullanarak metabolome tespiti talepleri.

Tek hücreli MS bir metabolitleri (bakın değerlendirmeden 4,5,6,7,8,9 Tek Kişilik hücrelerde ölçmek için yeterli hassasiyetle teknolojidir ,10,11,12,13,14,15). Hücre tekrarlanabilir örnekleme ve metabolitleri verimli çıkarma metabolitleri Tek Kişilik hücrelerde başarılı tespiti için gerekli. Bütün hücre diseksiyon Xenopus embriyo tanımlı hücre küçük moleküller ve peptidler16karakterizasyonu sağlamıştır. Diğer yaklaşımlar MİKROPİPETLER tek tek canlı hücreler tarafından algılamayı electrospray iyonlaşma (ESI) MS kullanarak takip örnek istihdam. Örneğin, metabolitleri bitki veya memeli hücreleri tek hücre video MS17, basınç sonda18, tek sonda19ve sıvı güç mikroskobu20, diğer teknikleri21arasında tarafından ölçüldü, 22,23,24. Ayrıca, önce iyonlaşma tek hücreli MS iş akışı içine kimyasal ayırma birleşme verimli bir şekilde böylece potansiyel etkileşimler hafifletmek için algılama önce iyon oluşturma sırasında metabolome kolaylaştırır. Önemlisi, ayrılık da moleküler tanımlamaları yardımcı olacak bileşik özgü bilgiler verilmiştir. Kapiler Elektroforez (CE) metabolitler nöron fenotipleri arasındaki farklar küçük molekül yakalayan tek disseke25,26 veya microsampled27nöronlar, tespit edebilir kullanılmaya başlanmıştır. Biz son zamanlarda ESI tandem MS metabolitleri Xenopus laevis16,28erken embriyo disseke tek tek hücreleri içinde yüzlerce izleme düzeyi algılamasını etkinleştirmek için CE uyarlanmış. Bu çalışmalar gelişiminin erken bir aşamada embriyonik hücreler arasında şaşırtıcı metabolik farklılıklar ortaya ve metabolitleri ile daha önce keşfi bilinmeyen gelişimsel etkileri16yol açtı.

Burada doğrudan bir canlı omurgalı embriyo microprobe tek hücreli CE-ESI-Bayan29,30kullanarak Tek Kişilik hücrelerde metabolitleri algılama etkin bir protokol sağlar. Seçilen model organizma 8-için-32-hücre X. laevis embriyo, olsa da yaklaşım geliştirme ve diğer türleri canlılar sonraki aşamalarını da geçerlidir. Bu iletişim kuralı bilenmiş kılcal çok eksenli translasyonel kontrolü altında yardım ile bir yüksek çözünürlüklü görüntü sistemi tarafından tanımlanan hücreleri situ morfolojik karmaşık gelişmekte olan embriyo bir ~ 10 nL bölümünü Aspire için kullanır. Bu microprobe daha küçük hücrelere ölçeklenebilir ve saniyeler içinde hangi hücre soy embriyonun içinde izlemek için yeterince hızlı çalışır. Kutup ayıklarken ya da apolar küçük moleküllerin, metabolitleri ve peptidler, ~ 4-5'te toplanan örnekten sonra µL ayıklama çözüm, bir ~ 10 nL elde edilen ekstresinin bir ESI Kütle Spektrometre anavatanına bağlı özel olarak oluşturulmuş bir CE platform analiz. İnşaat ve CE-ESI-MS platform oluşturur başka bir bölümünde protokollerinde. 31 , 32 koaksiyel CE-ESI arabirimin başka bir yerde açıklandığı gibi inşa edilmiştir. 31 bu platform bir 4-5 günlük sipariş dinamik aralığında (göreli28,29,30 bir yeteneği miktar için izleme düzey hassasiyet elde etmek için koni-jet püskürtme rejimi saklanır ya da mutlak16). CE-ESI-MS platform algılama %8 bağıl standart sapma (MSB) ile a 60-Ekrem alt limiti Nefelometri içinde test edilmiş 10 sunmaktadır nM 1 µM küçük moleküller16 X endojen metabolitleri karakterize etmek yeterlidir için için. laevis hücreleri. Microprobed hücreleri aracılığıyla geliştirme30hücresel metabolizma geçici ve dağınık şekilde çözülmüş analiz için izin, embriyo ilerledikçe bölmek devam edin. Nitekim, tek hücreli CE-ESI-Bayan ventral dorsal16,29, hayvan bitkisel16, sol-sağ28 gelişimsel eksenleri ve hücreleri işgal hücreler arasında metabolik farkları bulun için kullanılabilir Bu ortak progenitör hücre içinde X. laevis30kaderde dorsal soyundan sinir dokusu oluştururlar. X. laevis embriyo30farklı gelişim aşamalarında bireysel embriyonik hücreler arasında metabolik farklılıklar sorgulama yanı sıra, biz burada açıklanan protokoller biomolecules geniş bir dizi ilgili tahmin ve Embriyonik geliştirme gibi diğer hücreleri ve model organizmalar türleri farklı aşamalarında gelen tek hücreler microsampled. Ayrıca, farklı bir platform minik örnekleri ile uyumlu ayırma ve/veya biomolecules karakterizasyonu için kullanılabilir gibi görünse microprobe microsampling için kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm iletişim kuralları ile ilgili bakım ve Xenopus laevis işlenmesi kurumsal hayvan bakım ve George Washington Üniversitesi'nde kullanım Komitesi tarafından onaylanmış (IACUC yok. A311).

1. hazırlık örnekleme aletleri, medya, çözücüler ve yemekleri örnekleme

  1. 1 x Steinberg'ın çözüm (SS) ultrasaf su (~18.2 MΩ.cm 25 ° c) aşağıdaki tuzları çözülerek aşağıdaki sırayla hazırlamak ve bir standart aşağıdaki belirtilen konsantrasyonlarda33protokol: Sodyum Klorür (58.2 mM), Potasyum klorür () 0.67 mM), Kalsiyum nitrat (0,34 mM), Magnezyum sülfat (0,83 mM), Tris-hidroklorid (4.19 mM) ve Tris Bankası (0.66 mM). SS tarafından iki kat x 0.5 ve 0.1 x 1'in panolarında seyreltme tarafından SS SS ultrasaf su kullanarak x.
  2. Örnekleme yemekleri ilk yapım % 2 özel SS. otoklav 120 ° c x 1 için 20 dk çözülmeye hazırlayın. Ise hala sıvı, 60 mm Petri yemekler ve çözüm alt kat. Bir kez özel jel soğutmalı ve katılaşmış, bir top oluşturur ve hafifçe dokun 5-10 wells, ~ 1 mm derin, özel Künye için ısıtmalı sonuna kadar bir santimlik Pasteur pipet sonu alev.
    Not: Bu kuyu embriyo örnekleme sırasında hareketsiz için kullanılır.
  3. Metaboliti ayıklama solvent hazırlayın. Sınıflara çalışmaya ilgi vardır molekülleri çözücü (örneğin, polarizasyon ve pH) fizikokimyasal özellikleri terzi.
    Not: Örneğin, biz % 40 metanol ve % 40 Asetonitril LC-MS-grade suda bir keşif yaklaşımı esas olarak kutup metabolitleri ve birkaç apolar metabolitleri ve peptidler28hedeflemek için kullanın.
  4. Temiz saç ve başka bir yerde yavaşça Petri yemeklerinde çok az pertürbasyon ile embriyo hareket için33 açıklandığı gibi bir Pasteur pipet kullanarak saç döngüler yapmak.
  5. Konik uç MİKROPİPETLER Şekil 1a' gösterildiği gibi imal.
    1. İlk olarak, aşağıdaki ayarlarla bir yanan Brown tipi kapiller çektirmenin borosilikat kılcal damarlar (1000/500 µm dış/iç çapı) çekmek: ısı 355; = Çekme = 65, hız = 80; saat = 150.
    2. Sonra ara-~ 20 µm. dış çapı hassasiyet ve tekrarlanabilirlik yardım etmek için bir stereomicroscope altında bu adımı gerçekleştirmek kılcal bir ipucu elde etmek için bir çift iyi keskin forseps kullanarak çekti micropipette ucu kapalı.
      Not: Kılcal küçük bir ipucu ile viskoz sitoplazma aspirasyon sırasında tıkanma yatkındır. Daha büyük bir ipucu ile kılcal kesinlikle tıkanma önlemek ve hücresel içeriğin daha fazla Aspire edin yardımcı olsa da, büyük geçişli kılcal daha küçük hücreler örnekleme sırasında sorunlar teşkil ve muhtemelen sonraki örnekleme için hücre zarar. Dikkatli basınç ayarlama ve aspirasyon zaman kısmen bu sorunları hafifletmek. Biz burada sunulan iş için ideal MİKROPİPETLER ~ 20 µm dış çap ile bulmak.

2. Microsampling tek hücreleri ve metaboliti çıkarma

  1. Doğal yetişkin Xenopus laevis çiftleşme gonadotropin kaynaklı aracılığıyla (döllenmiş yumurta) embriyo elde etmek ya da açıklandığı gibi vitro fertilizasyon ile başka bir yerde33,34protokolleri.
    Not: Doğal çiftleşme vitro fertilizasyon tarafından elde edilen embriyolar arzında daha güvenilir olmakla birlikte embriyonik gelişim aşamalarında sendeleyerek sağlar. Ancak, vitro fertilizasyon yetişkin erkek kurbağa ödün gerektirir.
  2. Taze ultrasaf su 200 mL sistein 4 g çözülerek % 2 sistein dejellying çözüm hazırlamak ve dropwise çözüm pH 8 10 N sodyum hidroksit çözümü kullanmak için ayarlayın.
  3. 2-hücre sahne içine aşağıdaki gibi ayırmak başladığınızda embriyo çevreleyen jöle kat kaldırmak: embriyo dinlenmek için 2 dk dejellying çözümünde, sonra yavaşça onları koleksiyon yüzeye kalarak embriyo önlemek ek bir 2 min için girdap izin çanak.
  4. Yavaşça temiz bir ölçek çanak içeriği dökün ve hızlı bir şekilde kabı dejellying çözümden dikkatle boşaltmak. Hemen kapak yumurta ile 0.1 x SS kalan kapalı durulama için çözüm, dejellying hafifçe girdap ve çözüm dikkatle boşaltmak. Bu dört kez embriyoların iyice yıkamak için tekrarlayın.
    Not: embriyoların canlılığı sağlamak için 4 dk dejellying çözümü için maruz kalma sınırı. Jöle kat kaldırmak için kapsamlı iletişim kuralları bulunmaktadır, başka bir yerde33.
  5. 1'e dejellied embriyo transferi SS bir petri x. Tabak içinde kalabalık en aza indirmek için ~ 100 embriyo 100 mm çanak33başına yerleştirin.
    Not: embriyo içeren yemekler geliştirme yavaş ve embriyo kademeli gelişim dönemleri aynı ailesinden elde etmek için 14-18 ° C arasında saklanır. Büyüme ve gelişme sıcaklığı bağımlılığı daha da yönergeler Xenbase ve başka bir yerde Yayınlanan33,35,36,37.
  6. Embriyo 2-hücre aşamada hangi klişeleşmiş pigmentasyon içinde ayrı bir çanak içine güvenle fizyon sıralama referansla kurulan hücre kader haritalar38,39,40ventral dorsal eksen işaretler.
    1. Midsagittal uçak demarks, ilk bölünme karık bisects sağlayarak doğru sıyırmada embriyo tanımlamak koyu (ventral) ve hafifçe (dorsal) Pigmentli hayvan kutup iki yarım ayna görüntüleri41vardır öyle ki.
  7. Uydurma bir micropipette bir çok eksenli micromanipulator (el ile veya uzaktan kumandalı) bağlayın. Micropipette bir microinjector için bağlayın.
  8. 5 ~ 8 hücreli embriyo Aspire edin ve 0,5 içeren örnekleme çanak içine aktarmak için bir plastik transfer pipet kullanın x SS.
Saç döngüsü kullanarak, bireysel bir kuyuya tatmak ve ilgi doğru tespit hücre microprobe ~ 90 ° açıyla bakacak emin olmak için embriyo getirin.
Not: pigmentasyon ve embriyo hücre kader haritalar38,39,40referansla pozisyonda göre hücreleri tanımlamak.
  • Stereomicroscope (at 20-30 X büyütme) altında çalışırken, micropipette ucu saptanan tek hücre içinde canlı embriyo şekil 1 (bkz: hücreleri panelinde B ve C panelinde cihazları Puan örnekleme) gösterildiği gibi deliklere.
  • Hücre içeriğinin istenilen bir bölümünü microinjector ('dolgu modu') kullanarak microcapillary negatif basınç bakliyat uygulayarak geri alıyorum.
    Not: Örneğin, bizim rutin ~ 10-15 Aspire edin ~ 3 bakliyat-30 psi için kılcal uygulayarak hücre birimden nL. Bu tüm adım sürer ~ 5 s aspirasyon30.
  • Yavaşça microprobe hücreden geri çekmek ve ucu mikro ölçekli bir şişede soğutulmuş metaboliti ayıklama solvent (4 ° C) 4 µL aktarın. Daha sonra uygulamak için 1 + 80 psi basınç dalgalanma aspiratı kovmak için çözücü microinjector ('Açık modu') kullanarak kılcal s.
    1. Buharlaşma önlemek ve örnekleme tamamlanana kadar şişeyi geri 4 ° C buz kovasının yerleştirmek için şişe sıkıca kapatın. Kullanılan micropipette needlestick tehlike önlemek için "Sharps" konteyner içine atın.
      Not: emişli hücre içeriği belirlemek için madeni yağ nerede küresel bir şekil alır, aspiratı enjekte. Bu küre çapı bir mikroskop kullanarak ölçülebilir. Emişli güç hesaplamak: V = nerede V birimi ise r kürenin yarıçapı 4/3 π r3,.
  • Yine aynı hücreyi veya diğer hücrelere embriyo örnekleme yapmak için tamamlayana 2.7-2,11 (şekil 1 c). Arasında ardışık örnekleme üzerinde potansiyel taşıma önlemek için her farklı hücre analizi için taze bir micropipette kullanın.
  • Örnekleme tamamlandığında, girdap-~ 1 dk metabolitleri çıkarımı hızlandırmak, sonra 8.000 × g 4 ° C'de hücresel enkaz ve diğer parçacıklar cips için 5 min için de santrifüj kapasitesi için örnek içeren microcentrifuge şişeleri karışımı.
  • Hücre özleri ile birlikte hücre artıkları ve zarlarını malzemeleri-20 ° c için bir gün veya 1 ay kadar ölçüm CE-ESI-Bayan tarafından-80 ° C'de depolayın.

    • 3. CE-ESI-Bayan ölçüm

    1. CE-ESI-MS için standartlar ve çözümleri hazırlanması
      1. %1 formik asit LC-MS sınıf suda oluşan arka plan elektrolit (BGE) hazırlayın.
      2. LC-MS sınıf su ve %0,1 formik asit % 50 metanol içerecek şekilde kılıf çözüm hazırlamak.
      3. 50 nM asetilkolin çözüm kılıf çözümde CE-ESI-MS sistem performansını günlük değerlendirme için hazırlayın.
      4. 150 mM Sodyum Klorür çözüm kitle-kalibrasyon standart olarak pozitif iyon modunda düşük m/z aralığı için hazır olun. Bir kütle (m/z) doğruluğunu < 10 ppm tavsiye edilir. Bu adım taşımak için Kütle Spektrometre üreticisinin yönergelerini izleyin.
        Not: Alternatif olarak, bilinen m/z değerleri diğer standartlara Kütle Spektrometre kitle ayarlamak için kullanılabilir.
    2. CE-ESI Platform inşaatı
      1. Hızlı dikey BGE flakon ve microvial yükleme örnek tutan bir sahne tercümesi kabil bir CE enjeksiyon platform oluşturmak. İnşaat ve platform için başvuru31ayrıntılarda bakın.
      2. CE-ESI arabirimi (şekil 1 c) araya. Electrospray metal emitör (130/260 µm iç/dış çap ve ~ 35 mm Uzunluk) 3-port T-Birliği monte. Ayrılık CE kılcal damar (40/105 µm iç/dış çap ve ~ 100 cm uzunluk) ~ 40-100 çıkıntı için izin electrospray verici aracılığıyla yem µm Yayıcıyı ucu ötesinde. Doğruluk yardım etmek için stereomicroscope altında çalışır.
        1. Kılıf çözüm kılcal (75/360 µm iç/dış çap ve ~ 100 cm uzunluk) electrospray çözüm sağlamak için kalan bağlantı noktasına bağlayın. Uygun kollu kullanın ve parmak bağlantıları sızıntısı Alerjik çalışması CE-ESI arabirimi için sıkın. Önceki iletişim kuralları31,32 derleme ve bu arabirim sorun hakkında ayrıntılı bilgi için bakınız.
          Not: Kılcal boyutları sinyal-gürültü oranı (S/N) ve ayrılık süresini etkiler. Örneğin, dar Geçişli ve kısa kılcal damarlar daha yüksek ayırma gerilimleri42,43kullanarak hızlı renk ayrımları kolaylaştırmak. Ayrıca, ilgilendikleri bir çalışmada molekülleri türlerine bağlı olarak, ayrılık kılcal istenmeyen molekül-kapiller duvarı etkileşimleri44en aza indirmek/önlemek için kaplı olması.
      3. Bir plaka sahibi kullanarak, CE-ESI arabirimi üç eksenli çeviri sahneye dağ ve electrospray verici ipucu Kütle Spektrometre orifis (şekil 1 c) ~ 2 mm'den getirin.
      4. Arayüzü temiz bileşenleri için electrospray verici 1 µL/dk ile electrospray kılıf çözüme ve CE ayrılık kılcal damar yoluyla BGE sağlayarak durulayın. Şırınga pompalar çözücüler sabit hızda beslemek için kullanın.
      5. CE ayrılık kılcal her ölçü önce kılcal damar giriş sonuna kadar bir şırınga bağlanarak floş. Dolum ve solvent tedarik hatları priming en aza indirmek için yeterli büyüklükte şırınga kullanın.
        Not: Deneyler genellikle 1 mL gaz geçirmez şırınga electrospray kılıf solvent ve ayrılık kılcal temizlemek için bir 500 µL şırınga sağlamak için kullanın.
    3. CE-ESI-MS Platform ve metabolitleri ölçümü doğrulama
      Not: Bu adımın amacı her gün tek hücre özleri analiz daha önce CE-ESI-Bayan enstrüman analitik duyarlılığını emin olmaktır.
    Burada açıklanan CE-ESI platformu kullanarak, bir alt limit 60 Ekrem quadrupole ivme ortogonal uçuş zaman Kütle Spektrometre16kullanarak, algılama yerine getirebilirsiniz.
    1. Ayrılık kılcal ~ 5 min için durulama sonra onun giriş paslanmaz çelik şişede bulunan BGE çözüm içine aktarın.
    2. Electrospray verici ipucu Kütle Spektrometre orifis ~ 2 mm'den getirin ve güzel-bu mesafe electrospray istikrarlı koni-jet rejiminde süre bir stereomicroscope kullanarak sprey izleme üretmek için bir çeviri sahne kullanarak ayarlayın (bkz. Referanslar 31,45). Toplam iyon geçerli (TIC) kararlılığını izlemek için ~ 30-45 dk kararlı çalışmasını sağlamak için.
    3. ~ 20 uygulamak için yavaş yavaş potansiyeli üzerinde ~ 15 kadar ramping tarafından BGE şişe kV s, genellikle %1 formik asit BGE kullanarak ayırma kılcal arasında ~7.5 µA geçerli oluşturma. Her ölçü önce ~ 5-10dk TIC profil izleyerek sistem istikrarı sağlamak ve sonra step-wise alt ayırma (CE) potansiyel (toprak) 0 V.
      Not: yarı otomatikleştirmek için bu işlemi, biz özel olarak yazılmış bir yazılım CE yüksek voltajlı güç kaynağı31uzaktan denetlemek için kullanın. CE-ESI-MS platform kararsız ise dikkatle istikrarsızlık kaynağı CE-ESI-MS platform ilk yalnızca ESI modunda test ederek değerlendirmek ve sonra başka bir yerde CE-ESI çalışma modunda31önerilir. Kısaca, platform salt ESI modunda sınamak için CE yüksek gerilim açmak ve TIC ~ 30 dk koni-jet püskürtme rejim için izlemek. Gerekirse, adres hataları için şu adımları izleyin: (i) Bağlantılar kaçakları; incelemek (ii) temiz su, isopropanol, su ve metanol ile electrospray verici; (iii) çözücüler de-gaz; (iv) emitör ~ 25 min için tekrar test etmeden önce sifonu çek. CE-ESI platformu yalnızca ESI modunda istikrarlı bulunur ama CE ayırma sırasında kararsız hale gelir, sistem Joule Isıtma ve/veya elektroliz inceleyin: (i) BGE ile ayırma kılcal ~ 25 min için temizleme ve tekrar deneme; (ii) bir doğrusal içinden yanıt (Yani, doğrusal CE ayrılık gerilim eğrisi geçerli); korumak için Alt ayırma potansiyelleri kullanın (iii) CE kılcal çatlaklar gibi olası zararlardan incelemek ve kılcal gerekirse değiştirin.
    4. ~ 6 analiz nL örneği aşağıdaki gibi:
      1. Asetilkolin standart çözüm 1 µL enjeksiyon şişe pipet.
      2. Ayrılık kılcal BGE şişeyi enjeksiyon şişe aktarın.
      3. CE enjeksiyon sahne 15 cm 1s içinde kaldır.
      4. Sahne alanı 60 için yükseltilmiş tutun hydrodynamically ~ 6 enjekte için s nL örnek ayırma kılcal damar içine.
      5. Daha sonra geri düzeyleri (doğrultusunda kapiller çıkış) başlangıç için sahne çevirmek.
      6. Yavaşça hareket ettirmek BGE kılcal damar giriş son.
      7. Hemen sonra rampa yukarı elektroforetik ayrımı başlatmak için CE gerilim.
      8. Başlangıç MS veri toplama.
        Not: Herhangi bir kimyasal standardını kullanarak sistem performansını karakterize. Tek hücreli CE-ESI-Bayan sunar sınırları algılama ~ 10 alt nM (~ 60 Ekrem) asetilkolin, metionin ve histidin16. Enjekte birimi (VINJ), nL, kılcal içine boy farkı (H, cm) enjeksiyon, yoğunluğu (ρ, g cm-3) ve viskozite (η, kg m-1s-1) sırasında BGE uzunluğu (L, m) ve RADIUS (r, µm) CE bağlıdır kılcal damar ve enjeksiyon süresi (tINJ, s). Bu ilişki g (m s-2) yer çekimi ivmesi nerede aşağıdaki formülle ifade edilir:
        Equation
    5. Kez standart algılandı, veri toplama, ayrılık gerilim 0 V kademeli (toprak) alt ve ardından emitör için 2 cm delik almak. Ayrılık kılcal 5 min için hücre özü analiz daha önce sifonu çek.
    6. Tek hücreli ölçü 10 nL ayıklamak adımları 3.3.1-3.3.5 tekrar ederek 90 kullanarak s hydrodynamically örnek enjekte etmek.
  • Veri işleme
    Not: Veri işleme amacı belirlemek ve bileşikleri tek hücreler arasında ölçmek etmektir. Tek hücreli CE-ESI-MS iletişim kuralı birkaç saniyelik tipik taban genişliği olan dar electropherographic tepeler oluşturur. Yarı el ile veri analizi gerçekleştirerek, bu moleküler özellikleri (benzersiz m/z değerleri benzersiz geçiş kez) bulmak mümkündür aşağıdaki adımları kullanarak. Temsilcisi ayırma şekil 2aselect tanımlanan metabolitleri için gösterilir.
    1. Kitle kalibre ham veri dosyalarını veri toplama göndermek.
      Not: Yerel olarak hücreleri mevcut veya embriyo kültür ortamından ayıklanan olan örnek, bol miktarda sodyum iyonları ayrılması sırasında oluşturulan sodyum formiat kümelerin sinyalleri kullanır. Bu adımın amacı yüksek kütlesi (m/z) doğruluğu, tercihen sağlayarak sonraki adımda metaboliti kimliği artırmaktır < 5 mDa, veya < m/z 50-1, 000 arasında 10 ppm. Burada, post veri edinme kalibrasyon rutin kitle doğruluğu elde etmek mümkün kılan < 1 mDa, veya < 2 ppm m/z 50-500 için.
    2. Bir işleme komut dosyasını kullanarak, moleküler özellikleri için tespit edilen kitle aralığında arar. Kitle spectra doğru kitle belirleme ve onların karşılık gelen geçiş kere yere not her tepe üzerinde ortalama. Düşük-kütle metabolitleri m/z 50-500 aralığında tanımlanması için moleküler özellikleri ile S/N izlemek için bir 500 mDa adım pencere kullanın > 3.
    3. Pik alanı-altında--eğri moleküler her özellik için el ile veya otomatik olarak entegre. Sonuç alan değerlerini metaboliti bereket bir önlem olarak kullanılır.
    4. Aşağıdaki (Res. görmek gibi yüksek güven ile ilgi moleküler özelliklerini tanımlama
    • 2B).
    1. İlk olarak, bir metaboliti veritabanında (örneğin, Metlin46 ve HMDB47) moleküler özelliklerinin doğru kitle sözde kitle eşleşmelerin listesini elde etmek için 10 ppm doğruluk ile karşılaştırın.
    2. Ardından, bu kitle maçlar hücreden elde onların tandem kütle spektrumu karşılaştırarak değerlendirmek özleri metaboliti veritabanları veya tandem kütle spektrumu kullanılabilir veri ile ölçülen karşılık gelen kimyasal madde için standart.
    3. Son olarak, hücre özleri aynı CE-ESI-Bayan enstrüman tarafından analiz ilgili kimyasal standartları ile kaydedilen moleküler özelliklerinin geçiş zaman karşılaştırarak bu atamaların sağlam temele oturtulmuş.
      Not: deneysel üretilen işi artırmak için biz genellikle sadece deneysel koşullar veya hücre tipleri arasında istatistiksel olarak önemli ölçüde farklı moleküler özellikleri tanımlayın. Temsilcisi tanımlamaları Şekil 2' de gösterilmiştir. Kitle yüksek doğrulukta metabolitleri tanımlamak için biz dışarıdan günlük, Kütle Spektrometre kalibre bir iç standart kullanarak ve/veya harici her ölçüm kitle ayarlama her ölçüm sırasında gerçek zamanlı ayarlamayı yapmak tavsiye dosya sonrası veri toplama (örneğin, sodyum formiat kümeleri burada için) tavsiye edilir.
  • Küçük molekül üretim tek hücreler arasında karşılaştırmak için en yüksek alan-altında--curve seçili iyon electropherograms (3.4.3. adımdaki) bileşik bereket göreli ölçü olarak kullanın.
    Not: bizim deneyler, online yazılım platformları47 kullanılmıştır, sonraki veri analiz, aşağıdaki adımları da dahil olmak üzere tüm adımları gerçekleştirmek için: Ben) moleküler özelliklerinin en az % 50'her örnek-set (örneğin, hücre oluşumu ile filtre uygulama türü); II) veri normalleştirme; III) istatistiksel (örneğin, t-test) ve çok değişkenli veri analizi, asıl bileşen analizi (PCA) ve hiyerarşik küme analizi (HCA) gibi. P kullandığımız < 0,05 (öğrenci t-test) istatistiksel anlamlılık işaretlemek ve kat-≥ 1,5 biyolojik önemi Not Değiştir.
  • Tek bir hücrede bağlanabilecek küçük bir moleküldür mutlak konsantrasyonu belirlemek için kalibrasyon (örneğin, dış kalibrasyon veya standart ek) klasik yöntemleri uygulamak en yüksek alan-altında--curve bahçedeki faiz16kullanarak.

    • Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Son zamanlarda microprobe tek hücreli istihdam metabolitleri serbestçe Xenopus laevis embriyo29,30gelişmekte olan bireysel tespit hücrelerdeki karakterize etmek için CE-ESI-Bayan. Microprobe hızlı sağlar (~ 5 sn/hücre), in situ aspirasyon ~ 10 nL tek bir hücre, aynı hücre birden fazla beklentileri veya canlı embriyo (Şekil 1b) geliştirilmesi aynı veya daha sonraki aşamalarında birkaç farklı hücrelerde. Emişli hücresel içerik uygun bir çözücü kullanarak elde edilir ve metabolitleri sonra ayrılır ve ölçüye göre CE-ESI arabirimini kullanarak iyonize ve yaklaşım (çıkardıktan sonra ~ 300 nonredundant metaboliti sinyalleri verir MS. Typically tarafından tespit izotopik ve küme tepeler) her hücreden. Ayrılık 2a rakamseçin molekülleri için örneklenir. Biz küçük kutup metabolitleri, geçiş zamana dayalı olarak yüksek güven ile 70 farklı sinyalleri tespit ve MS/MS parçalanma desenleri, hücrenin sinyalleri, bu bir standart veya tandem mass spektral kitaplıkları karşılaştırıldığında ayıklayın. Örneğin, şekil 2b ortogonal bu bilgi parçalarını kombinasyonuna göre histidin emin kimliğini gösterir.

    Microprobe CE-ESI-Bayan tek hücreler arasında metabolik farklılıklar miktar sağlar. CE-ESI-MS bir nicel tekrarlanabilirlik %8 RSD seçili iyon electropherograms16,30eğrisi altında en yüksek alanlarda temel vardır. Microprobe ile bu teknik tekrarlanabilirlik %14 RSD30, istatistik ve biyolojik önemi hücrelere arasındaki sorgu metabolik aktivite farkları için yeterli olduğu örnektir. Örneğin, şekil 3 o mikrop CE-ESI-MS in situ mikro-örnekleme üç dorsal hücre tiplerinin (şekil 3a) etkin gösterir. Ayrıca, PCA nicel meta veriler 8 hücreli embriyo bir tespit progenitör hücre metabolik değişiklikler ortaya çıkardı (bkz: 1ök hücre) bölünmüş bir hücre klon 16-hücre oluşturmak için (bkz: D11R hücre) ve 32-hücre (D111R hücre) embriyo (şekil 3b). Temsilcisi eğilimleri için select metabolitleri şekil 3 colarak gösterilir. Hücre türleri trolamine ve bunlar Ser-Arg gösterdi karşıt eğilimleri ise metabolitleri asetilkolin gibi bereket ile hücre bölünmesi, azalmıştır. Trolamine bolca üzerinden 8 - 16 hücreli embriyo için azalmış ve Ser-Arg 32 hücreli embriyo azalan önce 16 hücreli embriyo artırarak karşı bir eğilim tasvir ederken o zaman 32 hücreli embriyo zenginleştirilmiş oldu. Arginin, bolca bu hücre aşamalar arasında önemli ölçüde değişmedi. Bu eğilimleri X. laeviserken gelişim dönemlerinde altında yatan temel süreçleri daha fazla ışık bekleniyor.

    Figure 1
    Resim 1: Deneysel iş akışı içinde in situ microprobe tek hücreli Kapiler Elektroforez (CE) kütle spektrometresi (MS) için. (A)fabrikasyon MİKROPİPETLER (üst) önce ve (alt) microsampling içinde 20 µm dış çap kullanılmak için belgili tanımlık uç fizyon sonra. (B) Microsampled 8 hücreli embriyo bölmek için devam etti hücreleri geliştirilen in vivo çalışmalar için sahne açılış 16 hücreli aşamaya. (C) belirlenen tek hücreleri örneklenmiş bir microprobe (µP) 8-hücre Xenopus laevis embriyo (bkz: V1R ve 1ök hücreleri) kullanarak, hücre metabolitleri çıkarılan ve CE-Bayan ölçek çubukları kullanılarak analiz = 250 µm (koyu/gri); 10 mm (beyaz). Anahtar: SP, şırınga pompa. (Rakamlar başvurular29,30izniyle uyarlanmıştır.) Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

    Figure 2
    Resim 2: Microprobe tek hücreli CE-MS sağlar emin metabolitleri tanımlaması. Seçme tanımlanan metabolitleri için(a)temsilcisi electropherogram. Histidin tanımlaması (B) veri (ayrılma çarpışma kaynaklı) standart metaboliti karşı doğru kitle, göç zaman ve parçalanma bir karşılaştırma üzerine dayalı. Anahtar: 1, metil histidin; 2, homolysine; SAM, S-adenosylmethionine; Orn, Ornitin; ÇAY, trietilamin; Araba, karnitin; AcCho, asetilkolin; AcCar, acetylcarnitine; HPX, hypoxanthine; GSH, glutatyon. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

    Figure 3
    Şekil 3: Nicel metabolik farklılıklar dorsal bir soy X. laevisiçinde formu tek hücreler arasında. (A)optik görüntüleri 1ök progenitör hücre 8 hücreli embriyo ve bunun alt ögeleri, 16 hücreli embriyo D11R hücrede ve 32 hücreli embriyo D111R hücreye. (B) anapara bileşen analizi (PCA) metabolitleri farklı metabolik profilleri ortaya çıkararak bu üç hücre tiplerinde sayılabilir. Her veri noktası farklı bir hücre gösterir (numaralarını görmek) bu ölçülen teknik çoğaltır (bağlı puan). Elips % 95 güven işareti. Varyans (ANOVA) (C) analizi ve post-hoc Fisher'ın en az önemli diskriminant analizi karmaşık metabolik eğilimleri hücre etap üzerinden ortaya koymaktadır. Kutu araziler için kare demek oluyor, kutusu 1 × standart hata ortalamaya (SEM) ise bıyık 1.5 × SEM anahtar: *p < 0,05; NS, anlamlı bir fark. Ölçek çubukları 250 µm. (rakamlar başvuru30izniyle uyarlanmıştır.) = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Microprobe CE-ESI-Bayan metabolitleri canlı, serbestçe embriyo gelişmekte olan tek hücrelere doğrudan karakterizasyonu sağlar. Yaklaşım kalbinde iki teknik alt bileşenleri, yani in situ kapiller microsampling ve yüksek-duyarlı CE-ESI-Bayan ile karşılaştırıldığında bütün hücreli diseksiyon, kapiller microsampling hızlı işlem (birkaç saniye 5 dk vs. avantajına sahiptir / hücre diseksiyon tarafından), embriyo ve ölçeklenebilirlik üstü yaşlardaki formu daha küçük hücrelere karmaşık üç boyutlu morfolojisi ile uyumluluk. Diseksiyon, microprobe örnekleme embriyo diğer hücrelere daha sonraki analiz için olduğu gibi bırakır. Çoğu intriguingly konularda, microsampled hücreleri bölmek, hücre farklılaşma. uzun vadeli çalışmalar için olasılık yükselterek devam edebilirsiniz Microprobe ucu boyutunu denetleme olanağınız da microprobe hücreleri ve gelişimsel süreci Zebra balığı ve fare de dahil olmak üzere diğer model organizmalar kullanmak metabolizmasında rolü eğitim için çok yönlü bir araç olarak hizmet için CE-ESI-Bayan sağlar. Güvenilir sonuçlar sağlamak için bu hücreleri ilgi tam, doğru ve tutarlı bir şekilde tespit örneklenmiş ve önemlidir. Aspirasyon (örneğin, kapiller boyutları, basınç ve zaman) deneysel parametreleri bir hücreyi istediğiniz bir bölümünü örnekleme yapmak için uygun olabilir. Ayrıca, hücre ilgi hangi sırayla embriyo zarar en aza indirgemek hedefleme yüksek hassasiyet elde etmek geliştirmek için embriyo hareketsiz için önemlidir. Bu protokol için kuyu içinde embriyonlarla örnekleme sırasında hareketsiz için Petri yemekler özel kaplamalı yarattık. Deneyim, kılcal eğimli ipuçları ile hücrenin künt keyif-e doğru karşılaştırmak için en az zarar emin olun. Daha fazla daha fazla işlem hacmi gelişmeler örnekleme ve kimyasal analiz böylece hücre ve gelişim süreçleri altında yatan önemli metabolitleri belirlemek için istatistiksel analiz güçlendirici büyük popülasyonlarda hücre, karakterizasyonu sağlayacaktır.

    CE-ESI-Bayan amacı izleme düzey hassasiyet metabolome karakterizasyonu sağlamaktır. CE nano-akış sıvı Kromatografi veya Gaz Kromatografi gibi diğer popüler ayırma teknikleri tek hücre çalışmaları için tamamlayıcı avantaj sunar. Karmaşık metabolome adrese enfes ayrılık verimliliği sağlar. CE fiziksel boyutları tek hücreler neden cilt-sınırlı örnekleri ile uyumludur. Ayrıca, çeşitli zenginleştirme teknikleri örnek sütun, böylece algılama hassasiyeti artırılması üzerinde preconcentrate (örneğin, örnek alan güçlendirilmiş yığın veya dinamik pH junction) CE bulunmaktadır. Başarılı çalışmalar için CE-ESI-Bayan enstrüman ile karakterize olan ve her gün geçerliliği gerekir. Örneğin, asetilkolin standart 60 Ekrem için S/N en az 3 gerektirir (6 nL enjekte 50 nM standart) ve tekrarlanabilirlik, < %5 RSD ayrılık (geçiş) zamanında ve < %25 RSD miktar içinde pik alanı-altında--eğri dayalı Standart için seçili iyon electropherograms. İzleme duyarlı algılama ve dinamik miktar ölçüm metabolitleri (ve peptidler) kapsayan geniş bir konsantrasyon CE-ESI-MS6,16,25 kullanarak Tek Kişilik hücrelerde farklı türde kolaylaştırmak , 31. rutin ~ 300 farklı olumlu tahsil metaboliti sinyalleri tespit ederken, CE-MS da böylece tek hücreli metabolome tespit bölümünü derinliğini arttırmak negatif iyonlaşma modu48ile uyumludur.

    X. laevis geliştirme eğitim için bu teknolojiyi oluşturulmasında çeşitli yararları sunulan rağmen microprobe CE-ESI-Bayan model organizmalar, diğer türleri için uyarlanabilir de kullanabilirsiniz. Hücreleri ile birlikte tekrarlanabilir hücre kader haritalar49 arasındaki farklar Xenopus, pigmentasyon ve boyut olarak bilinen doku kaderi ile belirli hücreleri tanımlamak olanak sağlar. Bu, sırayla, keşif için kapıyı açar veya hücrelere farklılaşma doğru farklı gelişim programları kuvvetlendirmek gibi tüm hücre soy metabolik deneyler hedef. Değişen hücre döngüsü nedeniyle doğan farklar ortadan kaldırmak için embriyo tamamen başka bir yerde50gibi daha önce örnekleme, sonraki aşamaya bölmek için izin verilmelidir. Microprobe CE-ESI-Bayan seçin hücre veya hücre tipleri arasında önemli bozukluk ile küçük moleküller gelişimsel önemi test klasik embriyoda manipülasyonlar veya moleküler araçları (örneğin, gen knock out/aşağı) adapte etmektir . Örneğin, tek hücreli metabolomics yeşil flüoresan protein ifadesi ile hücre kaderini izlemeli kombinasyonu ile daha önce metabolitleri keşfi bilinmeyen gelişimsel etkileri16yol açtı.

    Tek hücreli metabolomics çalışmalar özellikle miktar söz konusu olduğunda analitik detaylara dikkat çağrısında; bizim teknoloji bir istisna değildir. İdeal olarak, örnek hazırlama iş akışı her adımında potansiyel bozulma ve/veya endojen metabolitleri veya kirlenme örnekleri kaybı en aza indirmek için dikkatli bir şekilde değerlendirilmelidir. Enzim aktivitesinin gidermek ve hafifletmek/örnekleri enstrümantal analiz6 önce metabolik değişiklikleri önlemek için önerilen kullanımı yüksek saflıkta denaturing çözücüler (örneğin, LC/MS grade), asit veya üsleri ve düşük sıcaklıklarda (~ 4 ° C) , 51. metanol ve Asetonitril dayalı basit organik çözümleri sağlar verimli küçük kutup metabolitleri28çıkarılması. Tabii ki, metabolitleri (örneğin, apolar bileşiklerin, lipidler) belirli sınıfları için hedeflenen deneyler ayıklama solvent bileşimi önceden terzilik yarar. Örneğin, biz son zamanlarda ayıklama çözücüler birden çok türde kullanımı tek hücreli metabolome28kapsamını artırır gösterdi. Bu metabolitler miktar özleri metaboliti ayıklama sırasında çivili isotopically etiketli metabolitleri gibi kendi standartlarına tarafından kolaylaştırılabilir. Kendi standartlarına da kalite güvencesi böylece teknik ve sistem tekrarlanabilirlik değerlendirilmesi ve örnek analitler kurtarılması kolaylaştıran çıkarma ve ölçüm adımları için yararlıdır. Biyolojik analiz teknik çoğaltır (ölçülen birden çok kez aynı özü) her hücre ile (farklı hücrelere farklı embriyo emişli) çoğaltır için son, biz savunucusu istatistiksel güç ve sonuçları yorumlama yardım etmek için.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Yazarlar ifşa gerek yok.

    Acknowledgments

    Bu eser Ulusal kurumları GM114854 sağlık hibe (için P.N.) tarafından desteklenen ve CA211635 (P.N. için) Arnold ve Mabel Beckman Vakfı Beckman Genç Araştırmacı (P.N. için), hibe DuPont genç Profesör Ödülü (için P.N.), kitle için American Society Spektrometresi Araştırma Ödülü (için P.N.) ve COSMOS Club Vakfı Bursu (için R.M.O. ve E.P.P.). Görüş ve sonuçlar bu yayında ifade sadece yazarların bulunmaktadır ve mutlaka finansman kaynakları resmi görüşlerini temsil etmemektedir.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Reagents for Embryo Culture Media
    Potasium chloride Fisher Scientific BP 366-1
    Magnesium sulfate Fisher Scientific M 65-3
    Calcium nitrate Sigma Aldrich C1396
    Cysteine MP Biomedicals 101444
    Trizma hydrochloride Sigma Aldrich T3253
    Trizma base Sigma Aldrich T1503
    Sodium chloride Fisher Scientific 5641-212
    Name Company Catalog Number Comments
    Metabolite Extraction Solvents
    Acetonitrile (LC-MS-grade) Fisher Scientific A955
    Methanol (LC-MS-grade) Fisher Scientific A456
    Water (LC-MS-grade) Fisher Scientific W6
    Name Company Catalog Number Comments
    Solvents and Standards for CE-ESI-MS
    Formic acid (LC-MS-grade) Fisher Scientific A11710X1-AMP
    Methanol (LC-MS-grade) Fisher Scientific A456-4
    Water (LC-MS-grade) Fisher Scientific W6
    Sodium chloride Fisher Scientific 5641-212
    Acetylcholine chloride Acros Organics 159170050
    Name Company Catalog Number Comments
    Microprobe Fabrication Setup
    Micropippette puller Sutter Instrument Co. P-1000
    Borosilicate capillaries Sutter Instrument Co. B100-50-10
    Fine sharp forceps: Dumont #5, Biologie/Dumoxel Fine Science Tools (USA) Inc 11252-30 Corrosion resitant and autoclavable.
    Name Company Catalog Number Comments
    Microprobe Sampling Setup
    Micromanipulator Eppendorf, Hauppauge, NY TransferMan 4r
    Stereomicroscope Nikon SMZ18 Should be vibrationally isolated.
    Illuminator e.g. Goosenecks Nikon C-FLED2
    Microinjector Warner Instrument, Handem, CT PLI-100A
    Transfer pipettes (Plastic, disposable) Fisher Scientific 13-711-7M
    Petri dish 60 mm and 80 mm Fisher Scientific S08184
    Glass Pasteur Pipets ( Borosilicate, disposable) Fisher Scientific 13-678-20A
    Centrifuge Thermo Scientific Sorvall Legend X1R
    Name Company Catalog Number Comments
    CE-ESI-MS Setup
    High voltage power supply Spellman CZE1000R The HVPS may be controlled remotely using a low-voltage program generated by a personal computer. Caution: High voltage presents electrical shock hazard; all connective parts must be grounded or carefully shielded to prevent users from accidental exposure.
    Syringe pumps (2) Harvard Apparatus 704506
    Stereomicroscope Amscope SM-3BZZ Stereomicroscope capable of 4.5× magnification, equipped with an illuminator to monitor the spraying mode of the CE-ESI interface.
    XYZ translation stage Thorlabs PT3
    XYZ translation stage Custom-built This platform is capable of loading nanoliter-amounts of sample into the separation capillary via hydrodynamic injection and supplying the BGE for CE. Both interfaces described in this work were able to inject 6–10 nL of sample within 1 min into a 1 m separation capillary
    Stainless steel sample vials Custom-built
    Stainless steel BGE vial Custom-built
    Fused silica capillary (40 µm/105 µm ID/OD; 100 cm) Polymicro technologies TSP040105
    Fused silica capillary (75 µm/360 µm ID/OD; 100 cm) Polymicro technologies TSP075375
    Stainless steel emitter with blunt tips (130/260 µm ID/OD) Hamilton Co. 21031A For better performance, laser-cleave and fine-polish the emitter tip.
    Syringes (gas-tight): 500 - 1000 µL Hamilton Co. 1750TTL
    Digital multimeter Fluke Fluke 117
    High-resolution Mass Spectrometer Bruker Daltonics Maxis Impact HD High-resolution tandem mass spectrometer equipped with an atmospheric-pressure interface configured for ESI
    Tunning mixture for mass spectrometer calibration Agilent technologies ESI-L G1969-85000
    Data Analysis ver. 4.3 software Bruker Daltonics
    Name Company Catalog Number Comments
    Ancillary Equipment
    Vacuum concentrator capable of operation at 4–10°C Labconco 7310022
    Analytical microbalance (XSE105DU) Fisher Scientific 01911005
    Freezer (-20 °C) Fisher Scientific 97-926-1
    Freezer (-80 °C) Fisher Scientific 88300ASP
    Refrigerated Incubator Fisher Scientific 11475126
    Vortex-mixer Benchmark BS-VM-1000

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Tang, F. C., Lao, K. Q., Surani, M. A. Development and applications of single-cell transcriptome analysis. Nat. Methods. 8 (4), S6-S11 (2011).
    2. Veselovska, L., et al. Deep sequencing and de novo assembly of the mouse oocyte transcriptome define the contribution of transcription to the DNA methylation landscape. Genome Biol. 16 (209), (2015).
    3. Tran, D. A., Bai, A. Y., Singh, P., Wu, X. W., Szabo, P. E. Characterization of the imprinting signature of mouse embryo fibroblasts by RNA deep sequencing. Nucleic Acids Res. 42 (3), 1772-1783 (2014).
    4. Wang, D. J., Bodovitz, S. Single cell analysis: the new frontier in 'omics'. Trends Biotechnol. 28 (6), 281-290 (2010).
    5. Svatos, A. Single-cell metabolomics comes of age: new developments in mass spectrometry profiling and imaging. Anal. Chem. 83 (13), 5037-5044 (2011).
    6. Rubakhin, S. S., Romanova, E. V., Nemes, P., Sweedler, J. V. Profiling metabolites and peptides in single cells. Nat. Methods. 8 (4), S20-S29 (2011).
    7. Bodenmiller, B., et al. Multiplexed mass cytometry profiling of cellular states perturbed by small-molecule regulators. Nat. Biotechnol. 30 (9), 858-889 (2012).
    8. Rubakhin, S. S., Lanni, E. J., Sweedler, J. V. Progress toward single cell metabolomics. Curr. Opin. Biotechnol. 24 (1), 95-104 (2013).
    9. Kleparnik, K., Foret, F. Recent advances in the development of single cell analysis: A review. Anal. Chim. Acta. 800, 12-21 (2013).
    10. Zenobi, R. Single-cell metabolomics: Analytical and biological perspectives. Science. 342 (6163), 1243259 (2013).
    11. Gholipour, Y., Erra-Balsells, R., Nonami, H. In situ pressure probe sampling and UV-MALDI MS for profiling metabolites in living single cells. Mass Spectrom (Tokyo). 1 (1), A0003 (2012).
    12. Comi, T. J., Do, T. D., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Categorizing cells on the basis of their chemical profiles: progress in single-cell mass spectrometry. J. Am. Chem. Soc. 139 (11), 3920-3929 (2017).
    13. Lombard-Banek, C., Portero, E. P., Onjiko, R. M., Nemes, P. New-generation mass spectrometry expands the toolbox of cell and developmental biology. Genesis. 55, e23012 (2017).
    14. Yang, Y. Y., et al. Single-cell analysis by ambient mass spectrometry. Trac-Trends Anal. Chem. 90, 14-26 (2017).
    15. Lanni, E. J., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Mass spectrometry imaging and profiling of single cells. J. Proteomics. 75 (16), 5036-5051 (2012).
    16. Onjiko, R. M., Moody, S. A., Nemes, P. Single-cell mass spectrometry reveals small molecules that affect cell fates in the 16-cell embryo. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112 (21), 6545-6550 (2015).
    17. Mizuno, H., Tsuyama, N., Harada, T., Masujima, T. Live single-cell video-mass spectrometry for cellular and subcellular molecular detection and cell classification. J. Mass Spectrom. 43 (12), 1692-1700 (2008).
    18. Nakashima, T., et al. Single-cell metabolite profiling of stalk and glandular cells of intact trichomes with internal electrode capillary pressure probe electrospray ionization mass spectrometry. Anal. Chem. 88 (6), 3049-3057 (2016).
    19. Pan, N., et al. The single-probe: A miniaturized multifunctional device for single cell mass spectrometry analysis. Anal. Chem. 86 (19), 9376-9380 (2014).
    20. Guillaume-Gentil, O., et al. Single-cell mass spectrometry of metabolites extracted from live cells by fluidic force microscopy. Anal. Chem. 89 (9), 5017-5023 (2017).
    21. Saha-Shah, A., Green, C. M., Abraham, D. H., Baker, L. A. Segmented flow sampling with push-pull theta pipettes. Analyst. 141 (6), 1958-1965 (2016).
    22. Hu, J., et al. Synchronized polarization induced electrospray: Comprehensively profiling biomolecules in single cells by combining both positive-ion and negative-ion mass spectra. Anal. Chem. 88 (14), 7245-7251 (2016).
    23. Zhang, L. W., Vertes, A. Energy charge, redox state, and metabolite turnover in single human hepatocytes revealed by capillary microsampling mass spectrometry. Anal. Chem. 87 (20), 10397-10405 (2015).
    24. Zhang, L. W., et al. In Situ metabolic analysis of single plant cells by capillary microsampling and electrospray ionization mass spectrometry with ion mobility separation. Analyst. 139 (20), 5079-5085 (2014).
    25. Lapainis, T., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Capillary electrophoresis with electrospray ionization mass spectrometric detection for single-cell metabolomics. Anal. Chem. 81 (14), 5858-5864 (2009).
    26. Nemes, P., Knolhoff, A. M., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Metabolic differentiation of neuronal phenotypes by single-cell capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry. Anal. Chem. 83 (17), 6810-6817 (2011).
    27. Aerts, J. T., et al. Patch clamp electrophysiology and capillary electrophoresis mass spectrometry metabolomics for single cell characterization. Anal. Chem. 86 (6), 3203-3208 (2014).
    28. Onjiko, R. M., Morris, S. E., Moody, S. A., Nemes, P. Single-cell mass spectrometry with multi-solvent extraction identifies metabolic differences between left and right blastomeres in the 8-cell frog (Xenopus) embryo. Analyst. 141 (12), 3648-3656 (2016).
    29. Onjiko, R. M., Plotnick, D. O., Moody, S. A., Nemes, P. Metabolic comparison of dorsal versus ventral cells directly in the live 8-cell frog embryo by microprobe single-cell CE-ESI-MS. Anal. Methods. , (2017).
    30. Onjiko, R. M., Portero, E. P., Moody, S. A., Nemes, P. In situ microprobe single-cell capillary electrophoresis mass spectrometry: Metabolic reorganization in single differentiating cells in the live vertebrate (Xenopus laevis) embryo. Anal. Chem. 89, 7069-7076 (2017).
    31. Nemes, P., Rubakhin, S. S., Aerts, J. T., Sweedler, J. V. Qualitative and quantitative metabolomic investigation of single neurons by capillary electrophoresis electrospray ionization mass spectrometry. Nat. Protoc. 8 (4), 783-799 (2013).
    32. Knolhoff, A. M., Nemes, P., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Methodologies for Metabolomics. Wevers, R., Lutz, N., Sweedler, J. V. , 119-139 (2013).
    33. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early development of Xenopus laevis: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
    34. Moody, S. A. Cell lineage analysis in Xenopus embryos. Methods Mol Biol. 135, 331-347 (2000).
    35. Bowes, J. B., et al. Xenbase: a Xenopus biology and genomics resource. Nucleic Acids Res. 36, D761-D767 (2008).
    36. Karpinka, J. B., et al. Xenbase, the Xenopus model organism database; new virtualized system, data types and genomes. Nucleic Acids Res. 43 (D1), D756-D763 (2015).
    37. James-Zorn, C., et al. Xenbase: expansion and updates of the Xenopus model organism database. Nucleic Acids Res. 41 (D1), D865-D870 (2013).
    38. Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 16-cell stage Xenopus embryo. Dev. Biol. 119 (2), 560-578 (1987).
    39. Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell-stage Xenopus embryo. Dev. Biol. 122 (2), 300-319 (1987).
    40. Dale, L., Slack, J. M. W. Fate map for the 32-cell stage of Xenopus laevis. Development. 99 (4), 527-551 (1987).
    41. Klein, S. L. The first cleavage furrow demarcates the dorsal-ventral axis in Xenopus embryos. Dev. Biol. 120 (1), 299-304 (1987).
    42. Rollman, C. M., Moini, M. Ultrafast capillary electrophoresis/mass spectrometry of controlled substances with optical isomer separation in about a minute. Rapid Commun. Mass Spectrom. 30 (18), 2070-2076 (2016).
    43. Moini, M., Martinez, B. Ultrafast capillary electrophoresis/mass spectrometry with adjustable porous tip for a rapid analysis of protein digest in about a minute. Rapid Commun. Mass Spectrom. 28 (3), 305-310 (2014).
    44. Huhn, C., Ramautar, R., Wuhrer, M., Somsen, G. W. Relevance and use of capillary coatings in capillary electrophoresis-mass spectrometry. Anal. Bioanal. Chem. 396 (1), 297-314 (2010).
    45. Nemes, P., Marginean, I., Vertes, A. Spraying mode effect on droplet formation and ion chemistry in electrosprays. Anal. Chem. 79 (8), 3105-3116 (2007).
    46. Zhu, Z. J., et al. Liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry characterization of metabolites guided by the METLIN database. Nat. Protoc. 8 (3), 451-460 (2013).
    47. Wishart, D. S., et al. HMDB 3.0 The Human Metabolome Database in 2013. Nucleic Acids Res. 41 (D1), D801-D807 (2013).
    48. Liu, J. X., Aerts, J. T., Rubakhin, S. S., Zhang, X. X., Sweedler, J. V. Analysis of endogenous nucleotides by single cell capillary electrophoresis-mass spectrometry. Analyst. 139 (22), 5835-5842 (2014).
    49. Hubrecht, L., Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal table of Xenopus laevis (Daudin). A systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , North-Holland Pub. Co. (1967).
    50. Grant, P. A., Herold, M. B., Moody, S. A. Blastomere explants to test for cell fate commitment during embryonic development. J. Vis. Exp. (71), (2013).
    51. Sellick, C. A., Hansen, R., Stephens, G. M., Goodacre, R., Dickson, A. J. Metabolite extraction from suspension-cultured mammalian cells for global metabolite profiling. Nat. Protoc. 6 (8), 1241-1249 (2011).

    Tags

    Kimya sayı: 130 kılcal Elektroforez electrospray iyonlaşma kütle spektrometresi microsampling metabolomics tek hücre Xenopus kurbağa embriyo
    Microprobe kılcal Elektroforez kütle spektrometresi canlı Kurbağa (<em>Xenopus laevis</em>) embriyo tek hücreli Metabolomics için
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Onjiko, R. M., Portero, E. P.,… More

    Onjiko, R. M., Portero, E. P., Moody, S. A., Nemes, P. Microprobe Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry for Single-cell Metabolomics in Live Frog (Xenopus laevis) Embryos. J. Vis. Exp. (130), e56956, doi:10.3791/56956 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter