Summary
Het doel van deze paper is te presenteren een stapsgewijze procedure voor het verzamelen van verschillende witte vetweefsel van muizen, de vet monsters te verwerken en extraheren van RNA.
Abstract
Vergeleken met andere weefsels, heeft witte vetweefsel een aanzienlijk minder RNA en eiwit gehalte voor downstream toepassingen zoals real-time PCR en Western Blot, omdat het meestal lipiden bevat. RNA isolatie van adipeus weefselmonsters is ook een uitdaging zoals er extra stappen vereist zijn om te voorkomen dat deze lipiden. Hier presenteren we een procedure voor het verzamelen van drie anatomisch verschillende witte vetweefsel van muizen, voor het verwerken van deze monsters en uitvoeren van RNA isolatie. Verder beschrijven we de synthese van cDNA en gen expressie experimenten met behulp van PCR in real time. De hierbij beschreven protocol staat toe de vermindering van de verontreiniging van de haren en bloed op vet pads evenals kruisbesmetting tussen de verschillende dikke pads tijdens weefsel collectie van het dier. Het is ook geoptimaliseerd om ervoor te zorgen voldoende kwantiteit en kwaliteit van het RNA gehaald. Dit protocol kan worden alom toegepast op elk muismodel waar adipeus weefselmonsters nodig voor routinematige experimenten zoals PCR in real time zijn, maar is niet bedoeld voor de isolatie van de cultuur van de cel van de primaire adipocytes.
Introduction
Obesitas is een wereldwijde epidemie die tot complicaties, zoals type 2 diabetes1 leiden kan. Zwaarlijvig en genetisch gemodificeerde voeding-geïnduceerde dierlijke modellen worden vaak gebruikt voor onderzoek in de obesitas en zijn bijbehorende complicaties. Traditioneel, witte vetweefsel is bekend als een opbergvak voor overtollige energie en bestaat meestal uit lipiden terwijl bruin vetweefsel energie in warmte2,3 omzet. Vetweefsel zal is dynamisch en uitbreiden en verkleinen afhankelijk van vele factoren zoals de voedselinname en lichaamsbeweging. Vandaar, om te bepalen bijdragende factoren aan deze veranderingen, voldoende adipeus weefsel collectie en behandeling zijn vereist4.
Onder witte vetweefsel, is het algemeen aanvaard dat onderhuids en viscerale vet depots verschillende eigenschappen zoals anatomische lokalisatie hebben en functie van2,5. Dus, om te voorkomen dat tegenstrijdige resultaten of grote variabiliteit, aandacht zouden worden genomen om te voorkomen van kruisbesmetting tussen deze verschillende vet depots bij het verzamelen van vet pads.
Bovendien zijn er drie grote uitdagingen bij het isoleren van RNA of eiwit uit muizen witte adipeus weefsel. Ten eerste is verzamelen vet pads in zwaarlijvige muizen niet een gemakkelijke taak als de grens die scheidt van verschillende wit vet depots niet altijd duidelijk, in tegenstelling tot andere organen zoals de nieren en hart6 is. Ten tweede, vanwege het hoge vetgehalte van vetweefsel, tijdens RNA of eiwit isolatie, een laag van lipiden boven en directe toegang tot het monster verhindert. Ten derde, in tegenstelling tot bruin vetweefsel of andere weefsels, witte vetweefsel heeft aanzienlijk lager RNA en eiwit gehalte en dit is van groot belang bij het gebruik van de jonge muizen, muizen gevoed een normale (N) dieet en muizen die naar verwachting hebben lage vet massa (d.w.z. KO modellen, behandeling met geneesmiddelen, oefening, opleiding, enz.) 7 , 8.
Dus, het kiezen van de juiste methode om te isoleren van RNA van vetweefsel is essentieel. Alternatieve methoden voor de winning van fenol/chloroform zijn commerciële kits. Ze zijn meestal gebaseerd op een eerste fenol extractie stap, gevolgd door RNA zuivering op een kolom9. Echter, deze kits zijn meestal duurder en geven van monsters van lagere opbrengst, terwijl de RNA-kwaliteit zou variabele maar zijn minder tijdrovend. Een van de grootste voordelen van fenol oplossing/chloroform extractie hier beschreven is echter de mogelijkheid van het isoleren van RNA, DNA en eiwit uit een monster10. Omdat muizen vet pads meestal klein zijn en kleine hoeveelheid RNA en eiwitten (vooral in mager Muismodellen geven), maximaliseren deze protocollen de gegevens die men uit een kleine steekproef krijgen kan.
Het doel van deze paper is om te beschrijven in detail een methode om te zorgen voor adequaat monster collectie van drie muizen witte vetweefsel depots evenals de hoeveelheid en de kwaliteit van RNA isolatie. RNA verkregen door het volgen van dit protocol kan worden gebruikt om uit te voeren real-time PCR-testen. Dit protocol is niet bedoeld voor RNA isolatie van gekweekte primaire adipocytes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Verzorging van de muizen gebruikt in de procedures in acht genomen met normen voor de zorg en het gebruik van proefdieren die door de Canadese Raad voor de bescherming van dieren. Alle procedures werden goedgekeurd door de Universiteit Animal Care en gebruik Comité bij de CHUM Research Center.
1. de necropsie en vetweefsel collectie van mannelijke muizen
- Experimentele groepen volgens studie doelstellingen maken In deze studie werden monsters verzameld uit twee groepen van mannelijke muizen op een achtergrond van C57Bl/6 (n = 12-14/groep). Zorgen dat muizen gebruikt hier 12-15 weken oud zijn en worden bijgehouden op 12-h licht/donker cyclus met toegang tot de normale (N) of hoog-vet (HF) dieet en water ad libitum voor een periode van 10 weken11.
- Euthanaseren een muis door het plaatsen van de muis in een gesloten kamer waar het wordt blootgesteld aan 6% CO2 gedurende 10 min.
- Uitvoeren cardiale punctie door langzaam het invoegen van een 1 mL injectiespuit met een naald 1/2po 26G enkel aan de linkerkant van het dier borstbeen gemonteerd en langzaam de zuiger om te verwijderen van de meeste van het dier bloed trekken. Zorg ervoor dat de spuit evenwijdig aan het lichaam van het dier is. De spuit langzaam roteren terwijl het trekken van de zuiger als bloed niet in de spuit komt.
Opmerking: Succesvolle cardiale punctie (tussen 0,8 en 1 mL bloed volume) zal besmetting van adipeus weefsel met bloed afnemen. - De muizen op zijn rug leggen en elke poot pin op de pad 22G naalden te gebruiken, zoals in Figuur 1.
- Met een gaas, wrijf de huid van de muis met alcohol meerdere malen vanaf de nek helemaal tot aan de geslachtsorganen door het volgen van een unidirectionele resolutie zoals dit zorgt ervoor dat haar vlak blijft en de verontreiniging van de haren van adipeus weefselmonsters vermindert zonder verwijdering van het haar.
- Gebruik schoon maar niet steriel pincet en chirurgische scharen, verheffen van de centrale huid in de buurt van de geslachtsorganen en een kleine 0.3 mm incisie.
- Steek de schaar horizontaal in het geopende gat en losmaken van de buikhuid van de buikwand.
Opmerking: Dit wordt gedaan door botte dissectie in de ruimte tussen de huid en de buikwand en niet door het snijden van de membranen gevonden in deze ruimte. - Met behulp van de verlostang, verheffen van de centrale huid in de buurt van het geopende gat en knip de huid de linea alba totdat u in de buurt van de ribbenkast (~ 4 cm afhankelijk van de grootte van de muis).
Opmerking: Vermijd het snijden van de buikspier als dit kan de viscerale adipeus weefsel aan de lucht blootstellen en leiden tot het drogen van de dikke pads die de integriteit van het weefsel en de inhoud ervan kunnen veranderen. - Vanaf het midden van de ribbenkast, de huid naar de rechterarm op ~ 2 cm snijden. Uit snijd in de buurt van de geslachtsorganen, de huid boven de juiste hind-limb op ~ 2 cm.
- Een van de hoeken van de geopende huid strek en pin het neer op het pad met behulp van een naald 22G. Herhaal met de andere hoek.
Opmerking: Het vetweefsel blootgesteld op de huid is het buikvet onderhuids (SCF)(Figuur 1). - Het SCF verzamelen door bot ontleden en snijden van de huid met behulp van chirurgische schaar zo plat mogelijk tegen de huid geplaatst. Zodra verzameld, zet het SCF op de vooraf bepaalde aluminiumfolie.
Opmerking: Verzamelen of besmetten obesitas weefsel met huid of haar zal veranderen genieten van kwaliteit en RNA opbrengst als gevolg van RNases. Teveel tijd wordt besteed aan het verzamelen van het vetweefsel, dan kan die ook de kwaliteit van het monster kan veranderen ook droog door het monster. - Herhaal stap 1.9 naar 1.11 aan de linkerzijde van het dier. Bundelen van zowel links als rechts vet kussentjes in de aluminiumfolie en bevriezen van het monster in vloeibare stikstof.
- Om toegang te krijgen tot de viscerale vetweefsel, snijd de buikspier met schoon maar niet steriele chirurgische schaar en pincet langs de linea alba, op ~ 4 cm, afhankelijk van de grootte van de muis, van de geslachtsdelen aan de ribbenkast. Breng een insnijding in de buikspieren aan te spannen van de geslachtsdelen naar de achterkant van de muis op ~2.5 cm toegang hebben tot de kant van de buikorganen.
- Het vet rond de voortplantingsorganen is het peri-gonadale vet (PGF) (Figuur 1B). Zoals PGF is gekoppeld aan de testis, de bijbal en de ductus deferens, loskoppelen zorgvuldig de linker vet pad van die structuren en zetten de tevoren aangewezen aluminiumfolie. Herhaal voor de rechterkant. Zodra beide PGFs worden verzameld, bevriezing van het monster in vloeibare stikstof.
- Beginnend met de linker zijde, bloot de nieren door de darm afgestapt van de buikholte naar de rechterkant. Het vetweefsel rond de nieren is het peri-renale vet (PRF) (Figuur 1C). PRF omringt ook de bijnieren (Figuur 1D).
- Isoleren en verwijder de bijnieren voordat PRF verzamelen. Dit kan vervelend zijn zoals ze net een beetje pinker dan het vetweefsel zijn.
Opmerking: Nieren moeten tijdens deze stap niet worden verwijderd zoals bloed kan de adipeus weefsel besmetten en het identificeren van de bijnieren binnen dit vet pad bemoeilijken. - Isoleren van de PRF uit de terug gespierde muur, eindigt door het snijden van de urineleider, de renale slagader en ader die de PRF en nier van de rest van het lichaam gescheiden. Isoleren van de PRF van de nier door snijden en te verwijderen van de renale capsule. De PRF blijft verbonden met de capsule.
- Herhaal stap 1.15 en 1.17 voor de rechterkant. Zet beide PRF in de aluminiumfolie en bevriezen van het monster in vloeibare stikstof.
- Herhaal de procedure vanaf stap 1.2 aan 1.18 voor alle muizen te verzamelen.
- Op dit punt voortzetten adipeus weefsel slijpen of monsters opslaan in een vriezer-80 ° C voor later extractie. Monsters kunnen stabiel bij-80 ° C gedurende verschillende jaren4worden opgeslagen.
2. voorbereiding van de grond witte adipeus weefsel voor RNA isolatie
Opmerking: Draag handschoenen voor elke stap aangezien huid bevat RNases die de aantasting van het RNA kan bevorderen en als zodanig verandert monster kwaliteit en RNA opbrengst na isolatie.
- Bereiden en identificeren drie RNase-vrije 1,5 mL schroef kegelGLB buizen per muis, één voor elk type van witte vetweefsel, en leg ze op een rek.
Opmerking: Zwaarlijvige dieren mogelijk extra buizen zoals ze vet massa's zijn toegenomen. Dit is vooral waar voor SCF waarvoor tot 7 buizen voor een muis was verkregen. - Reinigen van de Bank met 70% ethanol en een schone en nieuwe bank papier zetten het oppervlak.
- Of vetweefsel vers verzameld is uit muizen waren of vooraf in een vriezer-80 ° C opgeslagen, verzamelen alle monsters in een vloeibare stikstof gevulde container tot het begin van de procedure.
- Het bevriezen van de mortier, de stamper en de spatel door ze te plaatsen in de vloeibare stikstof-container. Wanneer de vloeibare stikstof stopt aan de '' kook '', kan slijpen van vetweefsel worden gestart.
Opmerking: Van deze stap, de mortel, spatel moeten conische buis en adipeus weefsel verblijven gekoeld tijdens het hele proces. De warmte zal smelten het vetweefsel en maken het moeilijker om op te halen van het RNA. Ook, als een keramische mortier en een stamper gebruikt, men kan gebruiken droogijs en/of vloeibare stikstof te houden koude. - Plaats alle RNase-vrije 1,5 mL schroef kegelGLB buizen voorbereid op stap 2.2 op droog ijs hen om af te koelen.
- Om te voorkomen dat frostbites op de handen, gebruik een paar lagen van bruin papier om te heffen van de mortel uit de vloeibare stikstof en zet het op een werkbank.
- Gebruik de verlostang om te verzamelen van een monster adipeus weefsel uit de vloeibare stikstof en zet het in de mortel. Snel uitpakken van de aluminiumfolie en neerzetten van het monster in het midden van de mortel.
Opmerking: Als het monster adipeus weefsel te groot, is zoals het geval met zwaarlijvige muizen, de monsters breken in kleinere delen in de aluminiumfolie met behulp van uw duimen en elk deel afzonderlijk te verpulveren. - Gebruik een paar lagen van bruin papier om te heffen van de stamper van de vloeibare stikstof en passen in de mortel. Houd de stamper met bruine papieren en gebruik de hamer te raken de top van de stamper of twee keer. Druk de stamper naar beneden tegen de mortel met roterende bewegingen om het monster te vermalen tot een fijn poeder wordt verkregen.
Opmerking: Deze stap is cruciaal voor het verkrijgen van voldoende isolatie van RNA. Inderdaad, de aanwezigheid van grotere fragmenten zal belemmeren RNA isolatie en vermindering van de opbrengst. - Zodra een fijn poeder wordt verkregen, verwijderen van de stamper en de spatel van de vloeibare stikstof halen en gebruiken voor het overdragen van het monster in de corresponderende vooraf gekoeld 1,5 mL conische buis.
Opmerking: Dompel de spatel terug in vloeibare stikstof van tijd tot tijd om te voorkomen dat het monster smelten. Houd ook de conische buis in droog ijs altijd om te voorkomen dat het monster ontdooien. Een conische buis gevuld met gemalen monster tot ongeveer 2/3-capaciteit (~ 1 mL) is vereist voor adequate RNA opbrengst en hoeveelheid. - Eenmaal gevuld tot ongeveer 1 mL, sluit u de buis en zet het in de andere vloeibare stikstof gevulde container.
Opmerking: Overtollige monsters kunnen worden gebracht in aparte vooraf gekoeld RNase-vrije 1,5 mL conische buisjes en opgeslagen in een vriezer-80 ° C voor later gebruik. - Reinig de vijzel, stamper en spatel met bruine papieren te vermijden "Carry-over" in de volgende adipeus weefsel monster. Zet stamper en spatel terug in de vloeibare stikstof om te relaxen. Hoewel het bruine papier is niet RNase-vrij, we gebruiken een vers geopende verpakking van bruin papier voor elke dag van RNA isolatie.
- Herhaal stap 2.4 tot en met 2.11 met het volgende voorbeeld.
- Zodra alle monsters zijn verwerkt, start RNA isolatie of monsters opslaan in een vriezer-80 ° C voor later gebruik.
Opmerking: Om te verhinderen dat de buizen barsten, een monster doos te bevriezen door het volledig ondergedompeld in de vloeibare stikstof-container. Wanneer koel genoeg verwijderen het teveel aan stikstof uit de doos en laat het drijven op de top van de vloeibare stikstof. De monsters in het vak Sorteren en zet het in een vriezer-80 ° C.
3. RNA los van de grond adipeus weefsel
Let op: Fenol oplossing is schadelijk voor de huid. Draag een laboratoriumjas, handschoenen, veiligheidsbril en voert u de procedure onder een chemische motorkap. Een stapsgewijze stroomdiagram is afgebeeld in Figuur 2.
- Bereiden en identificeren van twee sets van RNase-vrije 1,5 mL conische tubes en leg ze in een rek.
- Of vetweefsel waren vers gemalen of vooraf in een vriezer-80 ° C opgeslagen, verzamelen alle monsters in een vloeibare stikstof gevulde container tot de start van de procedure die wordt meestal gedaan bij kamertemperatuur.
- Met pincet kunt selecteren een gemalen adipeus weefsel monster uit de vloeibare stikstof en zet het in een buis-rack. De buizen moeten ~ 1 mL poeder, dat komt met ongeveer 100 mg weefsel poeder overeen bevatten.
- Langzaam open de tube.
Opmerking: Een gesloten buis verlaten bij kamertemperatuur of het openen van de deksel van de buis te snel kan leiden tot monster verlies of letsel zoals druk van de stikstof heeft de neiging om te ontsnappen aan de buis. - Voeg 500 µL van fenol oplossing aan het monster (1:2-verhouding van fenol oplossing: weefsel poeder).
- Sluit het deksel van de buis en de vortex bij maximumsnelheid voor ongeveer 5 s. langzaam en voorzichtig open de buis om de druk van de stikstof (een geluid van lucht uit de buis kan worden gehoord) vrij te geven.
- Herhaal stap 3.5 en 3.6. Het laatste fenol oplossing volume toegevoegd aan het monster is 1 mL.
- Herhaal stap 3.6 totdat het monster volledig is opgelost.
Opmerking: Het is belangrijk om alle druk uit de buis vrij voordat u verder om te voorkomen dat de buis barsten. - Laat het monster staan bij kamertemperatuur terwijl herhaalt u stap 3.4 tot 3,8 voor de volgende monsters.
- Zodra alle monsters zijn verwerkt, kort vortex op maximale snelheid en alle monsters 5 min bij kamertemperatuur incuberen.
- Centrifugeer 10 min bij ten hoogste 12 000 x g bij 4 ° C. Breng de buizen terug op kamertemperatuur.
Opmerking: Na het centrifugeren, 3 fasen aanwezig zoals afgebeeld in Figuur 2zijn: vet (boven), RNA (midden) en pellet (onder). - Voor elk monster, breng zoveel RNA (roze middenlaag) mogelijk in de eerste set overeenkomstige buizen P1000 Pipetteer met behulp van een gefilterde tip. Tips tussen monsters wijzigen
- Om te verzekeren minimale besmetting van RNA (middelste laag) door de lipide (toplaag), doorboren de bovenste fase met de tip in de buurt van de kant van de buis. Afzien van het RNA in de nieuwe conische buisjes zonder te raken de zijkanten van de nieuwe buis om te voorkomen dat het overbrengen van lipiden die mogelijk aan de buitenkant van de tip.
- 200 µL van pure chloroform toevoegen aan elk monster en meng door inversie gedurende 15 s. Incubeer 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Centrifugeer 15 min bij ten hoogste 12 000 x g bij 4 ° C en breng de buizen terug naar kamertemperatuur.
Opmerking: 3 fasen na het centrifugeren, aanwezig zijn: RNA (boven), interfase waarin DNA (midden) en rode fenol-chloroform waarin eiwitten (onder). - Voor elk monster, overdragen als veel transparante RNA-bevattende waterfase (bovenste fase) mogelijk in de tweede set met corresponderende conische buizen P1000 Pipetteer met behulp van gefilterd-tips. Tips tussen elk monster wijzigen
Opmerking: De interfase is broos en de bovenste fase kan besmetten als aspiratie te snel gebeurt. Gebruik een pipet P200 te verminderen de kans op verstoring van de interfase als alternatief. - 500 µL van 100% isopropanol toevoegen aan elk monster en meng door inversie voor 15 sec.
- 10 minuten bij kamertemperatuur incuberen
- Centrifugeer 10 min bij ten hoogste 12 000 x g bij 4 ° C en breng de buizen terug naar kamertemperatuur. Gooi het isopropanol en door het omkeren van elke buis.
Opmerking: Een kleine witte RNA pellet kan meestal worden gezien maar soms niet. - 1 mL van 75% ethanol (bereid uit 100% ethanol en RNase-gratis water) toevoegen aan elk monster en kort vortex elke buis op maximale snelheid.
- Centrifugeer 5 min bij 7 500 x g bij 4 ° C en breng de buizen terug naar kamertemperatuur.
- Negeren van de 75%-ethanol door het omkeren van elke buis en licht tik tegen een bruin papier te verwijderen alle overgebleven.
Opmerking: Indien nodig, gebruik een gefilterd-tip voor het verwijderen van alcohol in de buurt van de RNA-pellet. De tip van de verandering tussen de monsters. - Laat het deksel open en lucht drogen de RNA-pellet voor ongeveer 15-20 min.
Opmerking: RNA pellets kunnen tijdens deze stap doorschijnend geworden. - Als RNA solubilisatie uit de pellet is afhankelijk van de grootte, het evalueren van de grootte van de pellet te bepalen van de hoeveelheid water RNase-vrij worden gebruikt om te solubilize van het RNA. Noteer het volume (10 tot 25 µL) voor elk monster.
Opmerking: Deze stap is alleen kwalitatieve. Als RNA pellet kan niet gezien worden, voeg 10 µL van RNA-vrij water aan het monster. - 10-25 µL RNase-gratis water toevoegen aan elk monster (vooraf bepaald volume bij stap 3.24).
- Incubeer het monster 5 min in een blok van de warmte vastgesteld op 60 ° C. Kort vortex de buizen.
- Incubeer het monster voor een extra 5 min in de dezelfde warmte blok bij 60 ° C.
- Quick-spin alle monsters in een mini spin centrifuge en onmiddellijk op ijs zet.
- Bepaal de concentratie van RNA en de zuiverheid. Uitvoeren van omgekeerde transcriptie (RT) te verkrijgen van cDNA of monsters opslaan in een vriezer-80 ° C voor later gebruik.
Opmerking: Vermijd meerdere vorst/dooi cycli als dit RNA monsters degradeert.
4. bepaling van vetweefsel RNA concentratie en zuiverheid
- Of adipeus weefsel RNA monsters werden vers uitgepakt en ontbindend vooraf opgeslagen in een vriezer-80 ° C, verzamelen van alle monsters en laten ontdooien op het ijs tot het begin van de procedure. Dit moet gebeuren vlak voor het begin van de volgende stap of aan het einde van de isolatie om te voorkomen dat meerdere vorst/dooi cycli.
- Bereiden en identificeren van twee sets van RNase-vrije 1,5 mL conische tubes en leg ze in een rek van de buis.
- Wanneer alle de RNA-monsters zijn volledig ontdooid, vortex een monster voor 1 s en zet terug op het ijs.
- Vul uw RNA 100-fold in 1 x TE oplossing in de eerste set van RNase-vrije 1,5 mL conische tubes met gefilterd RNase-gratis tips (zette 99 µL van 1 x TE oplossing en 1 µL van RNA aan de buis).
- Herhaal voor elk monster.
Opmerking: De volumes macht zitten verschillend voor elke spectrofotometer afhankelijk van de Cuvet gebruikt. - Zodra alle monsters zijn verwerkt, verdund vortex elk monster.
- Volg het protocol van de spectrofotometer kalibreren van het instrument door het gebruik van een blanco (1 x TE) voordat de verdunde RNA monsters wordt verwerkt.
- De verdunde RNA monsters overbrengen in de kwarts cuvette en bepaal de concentratie van elk monster op 260 nm.
Opmerking: Als de spectrofotometer niet in de eindconcentratie van RNA voorziet deze formule gebruiken om te berekenen: RNA (µg/µL) = OD260 x verdunningsfactor x (40 µg RNA/1 000 µL). - Het bepalen van de zuiverheid van de RNA van elk monster door berekening van de verhouding tussen OD260/OD280.
Opmerking: Een verhouding OD260/OD280 rond 2.0 wordt algemeen beschouwd als zo zuiver voor RNA12. Het is sterk aanbevolen dat de RNA-kwaliteit wordt gecontroleerd. Om dit te doen, zet 1 µg RNA op een 1% agarose bleekmiddel gel gemaakt met 1 x TBE buffer (89 mM Tris base, boorzuur 89 mM en 2 mM EDTA, pH 8,0) en 1% bleekwater oplossing13 (Figuur 3). RNA van zeer goede kwaliteit toont zowel 28 en 18S rRNA bands en de 28-band moet intenser dan het 18S. RNA kwaliteit is aanvaardbaar wanneer beide bands rRNA zichtbaar bij een soortgelijke intensiteit zijn. RNA kwaliteit wordt het moment dat de band 18S intenser dan de 28-band, en is wanneer een uitstrijkje is zichtbaar, indicatieve RNA aantasting van het tekort. - Voor elk monster, 10 µL van 0,5 µg/µL van RNA, uit de voorraad in de tweede set van RNase-vrije 1,5 mL conische tubes met behulp van water RNase-vrij om te verdunnen van de monsters zo nodig voor te bereiden. Deze monsters worden gebruikt voor RT cDNA verkrijgen.
- Zodra alle monsters zijn verwerkt, start RT of monsters opslaan in een vriezer-80 ° C voor later gebruik.
5. omgekeerde-transcriptie (RT)
- Of adipeus weefsel RNA monsters werden vers verdund tot 0,5 µg/µL of vooraf in een vriezer-80 ° C opgeslagen, verzamelen van alle monsters, en reagentia en laten ontdooien op het ijs tot het begin van de procedure.
- Zet het PCR rek voor de strip van de buis op ijs. Zodra het koud genoeg voor te bereiden en identificeren één set van PCR RNase-gratis buis parkeerstroken en leg ze op het rek. Omvatten een leeg.
- Voorbereiden van de reactie voor DNase behandeling van RNA: maken van een master mix (voor de benodigde hoeveelheid monster + 1 monster) van de volgende handelingen uit (hoeveelheden voor 1 monster): 1 µL van 10 X reactie buffer met MgCl2, 0,5 µL van DNase ik (1 U/µl) en 7,5 µL van RNase-vrij water met behulp van gefilterd-tips. Afzien 9 µL in elke buis.
- Voeg 1 µL van 0,5 µg/µL van RNA van elk monster aan de overeenkomstige buis, leg de doppen op elke strip en quick-spin alle stroken in een mini spin Centrifugeer om het monster naar de onderkant van de buis. Voeg 1 µL van RNA-gratis water voor de blanco.
- Incubeer alle stroken van de buis in een thermische cycler of een blok van de verwarming bij 37 ° C gedurende 30 min. de buis strip terug zetten in het rek op ijs.
- Voeg 1 µL van EDTA (50 mM) aan elke buis en alle stroken van de buis in een thermische cycler of een blok van de verwarming bij 65 ° C gedurende 10 min. de buis strip terug zetten in het rek op ijs uit te broeden.
- Maken van een master mix (voor het vereiste aantal monsters plus 1 monster) van de volgende handelingen uit (hoeveelheden voor 1 monster): 1 µL van willekeurige hexamers (0,2 µg/µL) en 1 µL van dNTP mix (bevat elk van de vier deoxynucleotides op een concentratie van 10 mM). Afzien 2 µL van de master mix in elke buis met behulp van gefilterd-tips. De tip van de verandering tussen de monsters.
- Incubeer alle stroken van de buis in een thermische cycler of een blok van de verwarming bij 65 ° C gedurende 5 min. Zet de buis strip terug in het rek op ijs.
- Maken van een master mix (voor het vereiste aantal monsters plus 1 monster) van de volgende handelingen uit (hoeveelheden voor 1 monster): 4 µL van 5 x RT buffer, 1 µL van RNase remmer (20 U/µL), 0,25 µL van reverse-transcriptase (200 U/µL) en 1,75 µL van nuclease-gratis water. Afzien 7 µL in elke buis met behulp van gefilterde tips. De tip van de verandering tussen de monsters.
- RT in een thermische cycler uitvoeren door het volgende programma van Windows instellen: 10 min bij 25 ° C, 30 min bij 50 ° C, 5 min op 85 ° C. Zet de buis-strips terug op het rek op ijs.
- Bereiden en identificeren van een set van PCR RNase-gratis buis strips en leg ze op het rek.
- Voor elk monster, het gewenste volume van de verdunde cDNA 1:5 uit de voorraad in de nieuwe buis strips met behulp van ultrazuiver water te bereiden. De 1:5 verdunde cDNA monsters zal worden gebruikt voor PCR in real time.
- Zodra alle monsters zijn verwerkt, real-time PCR van het begin of monsters (voorraad en verdunde monsters) opslaan in een vriezer van-20 ° C voor later gebruik.
6. real-time PCR voor de expressie van genen in adipeus weefsel
Opmerking: Vermijd blootstelling van de fluorescente kleurstof aan het licht. Het protocol hieronder beschrijft de versterking van de verwijzing gene s1614. De inleidingen en de PCR voorwaarden moeten worden gewijzigd volgens het gen van belang.
- 1:5 of cDNA monsters vers waren verdund of vooraf opgeslagen in een vriezer van-20 ° C, verzamelen van alle monsters en reagentia en laten ontdooien op het ijs tot het begin van de procedure.
- Het rek voor real-time PCR buis op ijs gezet. Zodra het koud genoeg bereiden en identificeren van een set van real-time PCR buis parkeerstroken en leg ze op het rek. Elk monster en de blanco in tweevoud voorbereiden.
- Maken van een master mix (voor het vereiste aantal monsters plus 1 monster) van de volgende handelingen uit (hoeveelheden voor 1 monster): 1.9 µL van ultrazuiver water, 5 µL van fluorescente kleurstof (bijvoorbeeld SYBR groene) en 0,3 µL van een voorwaartse primer en 0,3 µL van de omgekeerde primer. Afzien van 7,5 µL in elke buis.
- 2.5 µL van 1:5 verdunde cDNA uit elk monster toevoegen aan de bijbehorende buis. Voeg 2.5 µL ultrazuiver water voor de blanco. Zet de doppen op elke strip.
- Volg de instructies van de fabrikant te richten aan het volgende programma op de PCR in real time: 10 min bij 95 ° C en 40 cycli van 15 s bij 50 ° C, 30 bij 60 ° C, 30 s s bij 70 ° C. Zet de monster-strips in de rotor van de real-time PCR-machine en start het programma.
Opmerking: Thermische cycler voorwaarden kunnen variëren afhankelijk van de gebruikte apparatuur en het gen van belang. mRNA uitdrukking resultaten gepresenteerd in Figuur 3 Toon leptin mRNA amplificatie genormaliseerd door de referentie-gen S16 mRNA amplificatie14,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Volgens de procedure van de necropsie, drie witte vetweefsel wordt ingezameld en gewogen van de twee groepen muizen (N en HF dieet-gevoed muizen). Zoals verwacht, toegenomen muizen op het HF dieet definitieve lichaamsgewicht en gewichtstoename ten opzichte van nestgenoten op N dieet (tabel 1). Deze observaties werden begeleid door meer dan een 2-fold verhoging van het gewicht van de PGF, PRF en SCF in zwaarlijvige muizen vergeleken met die op N dieet.
Voordat u alle experimenten met de geïsoleerde RNA, werd haar zuiverheid zoals beschreven in stap 4.9 geëvalueerd. Voor elke witte vetweefsel, RNA isolatie door fenol oplossing geproduceerd monsters met voldoende kwaliteit als de verhouding OD260/OD280 was ongeveer 2.0, dat wordt beschouwd als pure voor RNA (tabel 2). Real-time PCR gegevens bleek dat leptin mRNA uitdrukking werd aanzienlijk verhoogd in PGF, PRF en SCF van zwaarlijvige muizen vergeleken met die op N dieet (Figuur 4A). Inderdaad, de verschillen in mRNA uitdrukking van leptin waargenomen waren niet te wijten aan een variatie van s16, het gen van de referentie gebruikt te normaliseren van de resultaten, tussen de twee groepen muizen zoals Ct-waarden werden niet veranderd (Figuur 4B). Dus, s16 betrouwbaar bruikbaar als een referentie-gen voor mRNA uitdrukking in PGF, PRF en SCF wanneer HF dieet een parameter in een studie-protocol is.
Figuur 1 . Anatomische lokalisatie van witte vetweefsel in muizen. Een mannelijke muis op N dieet heeft om aan te tonen van de lokalisatie van elke depot van vetweefsel en bijnieren zijn ontleed. SCF (A), PGF (B), PRF (C) en bijnier (D). PGF, peri-gonadale vet; PRF, peri-renale vet; SCF, buikvet onderhuids. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 . RNA-isolatie protocol stroomschema met behulp van fenol oplossing. Schematische weergave van de stappen die nodig zijn om te isoleren van RNA van geaard witte vetweefsel. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 . De kwaliteitsbeoordeling van RNA op bleekmiddel gel. 1 mg van RNA van onderhuids vet (SCF) en peri-gonadale vet (PGF) geïsoleerd wordt afgescheiden in een 1% agarose bleekmiddel gel door elektroforese. 28s en 18s rRNA worden gevisualiseerd door UV-transillumination. Op gel worden RNA geïsoleerd van PGF van een muis en Financieringsmiddelen gevoed een normaal dieet. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 . Effect van HF dieet op leptine en s16 mRNA uitdrukking in witte vetweefsel. Leptin (A) en s16 (B) mRNA uitdrukking. Gegevens voor leptin zijn genormaliseerd naar s16 mRNA niveaus terwijl gegevens voor s16 worden weergegeven als de waarde van de Ct en beide worden gepresenteerd als gemiddelde ± SE met n = 12-13 per groep. * p < 0.05 in vergelijking met N dieet. N, normaal; HF, hoog-vet; PGF, peri-gonadale vet; PRF, peri-renale vet; SCF, buikvet onderhuids. Dit cijfer is gewijzigd van Tan, P. et al., obesitas (2014) 22, 2201-2209. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| N dieet | HF dieet | |
| Definitieve lichaamsgewicht (g) | 37,5 ± 1,3 | 46.7 ± 1.7* |
| De aanwinst van het gewicht (g) | 6.6 ± 0,7 | 16.7 ± 1.0* |
| PGF (g) | 1,08 ± 0,17 | 2.19 ± 0.15* |
| PRF (g) | 0,79 ± 0,15 | 1,71 ± 0.06* |
| SCF (g) | 1.62 ± 0.35 | 3.55 ± 0.20* |
Tabel 1. Effect van HF dieet op lichaam en wit vetweefsel gewichten. Waarden worden uitgedrukt als middel van ± SE met n = 14-15 per groep. * p < 0.05 in vergelijking met N dieet. N, normaal; HF, hoog-vet; PGF, peri-gonadale vet; PRF, peri-renale vet; SCF, buikvet onderhuids. Dit cijfer is gewijzigd van Tan, P. et al., obesitas (2014) 22, 2201-2209.
| Monsters | Verhouding OD260/OD280 |
| PGF 1 | 2.04 |
| PGF 2 | 2.04 |
| PGF 3 | 2.02 |
| PRF 1 | 1.95 |
| PRF 2 | 2.08 |
| PRF 3 | 2.08 |
| SCF 1 | 2.04 |
| SCF 2 | 2.02 |
| SCF 3 | 2.06 |
Tabel 2. De zuiverheid van het RNA na isolatie van witte vetweefsel. n = 3 per adipeus weefsel. PGF, peri-gonadale vet; PRF, peri-renale vet; SCF, buikvet onderhuids.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Volgende HF-dieet voeding, zwaarlijvig muizen bleken te zijn toegenomen lichaam en wit vetweefsel gewichten in vergelijking met muizen gevoed een N-dieet. RNA geëxtraheerd met behulp van fenol oplossing leverde monsters met goede zuiverheid. Leptine is een adipokine dat voornamelijk geproduceerd door vetweefsel en te correleren positief met vet massa16is bekend. Zoals verwacht, leptine mRNA uitdrukking toename in obesitas muizen samengaan met hun dikke massa.
Deze methode heeft verschillende kritische stappen. De grote is besmetting van een witte vetweefsel depot met elkaar zoals het is bekend dat verschillende adipeus weefsel depots verschillende functies2,5 hebben. Besmetting kan misleidende resultaten opleveren in downstream toepassingen. Bovendien, zoals vet heeft de neiging om te drogen eenmaal in contact met lucht, witte vetweefsel in een tempo van het regelmatige en consistente tussen muizen verzamelen wordt aanbevolen als het gewicht moet worden gehouden. Anders is het totale gewicht van een vet pad mogelijk onjuist. Om RNA van goede kwaliteit en rendement, na de onlangs gepubliceerde MIQE richtsnoeren is een duidelijke actief17. In het bijzonder de zeer fijne monster poeder maken tijdens het slijpen kan helpen maximaliseren van de opbrengst. Dit wordt het contact tussen de weefsel poeder en fenol oplossing tijdens RNA isolatie gemaximaliseerd. Laatste maar is niet minste het isolement van de RNA-bevattende laag tijdens de RNA-isolatie (stap 3.12). Als het vet is minder dicht dan water, wordt deze geplaatst op de top van de fase van belang. Minimaliseren van "Carry-over" vet is nodig om interferentie met downstream toepassingen.
Een beperking van deze methode is de vaardigheid vereist voor het uitvoeren van de verschillende stappen in de procedure, alsmede de noodzaak om te werken met schadelijke reagentia tijdens RNA isolatie. Bovendien is het hele proces is arbeidsintensief.
Er zijn niet veel alternatieven voor de methode van vetweefsel collectie en monster verwerking vóór RNA isolatie afgezien van kleine details die meestal door elke gebruiker worden aangepast. In het geval van RNA isolatie zijn vele opties beschikbaar, zoals de fenol/chloroform extractie of RNA isolatie kits. Er zijn voordelen en nadelen van elke optie en het is aan de gebruiker om de beste methode gebaseerd op downstream-toepassingen te selecteren. Fenol/chloroform extractie is minder duur, maar vereist het gebruik van schadelijke reagentia en moeizaam. De uitrustingen van de isolatie van het RNA zijn over het algemeen duurder, maar de procedure is sneller en levert doorgaans monsters met een goede kwaliteit en zuiverheid. Het is belangrijk dat het rendement en de zuiverheid van RNA, aangezien het materiaal beperkt is in witte adipeus weefsel die voornamelijk bestaat vet. Het grote voordeel bij het gebruik van fenol oplossing voor isolatie (fenol/chloroform extractie) is de mogelijkheid van het isoleren van RNA, DNA en eiwit uit een monster18. Dit is kosten - en tijd-effectief als het vermindert het aantal muizen vereist voldoende materiaal aan te schaffen. Zoals eerder vermeld, is vet massa beperkt in sommige Muismodellen. Voor deze muizen, wordt grond adipeus weefsel opsplitsen in drie delen afzonderlijk verkrijgen van RNA, DNA en proteïne niet aanbevolen omdat dit tot onvoldoende materiaal voor downstream toepassingen leiden kan. Om te omzeilen van dit probleem, is het ook mogelijk om te bundelen samen soortgelijke adipeus weefsel depot van verschillende muizen op basis van gebruiker gedefinieerde criteria, die tot een groter aantal dieren nodig leidt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door Diabetes Canada.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL seringes | |||
| 1X TE solution (10 mM Tris-HCl and 1 mM EDTA•Na2. pH 8.0) | |||
| 22 G needles | |||
| 26 G needles | |||
| 75% Ethanol | |||
| Block heater (dry bath) | |||
| Chloroform | Sigma | C2432-500mL | |
| dATP | Thermo scientific | R0141 | |
| dCTP | Thermo scientific | R0151 | |
| dGTP | Thermo scientific | R0161 | |
| DNase I (1 U/µl) | Thermo scientific | EN0521 | |
| dTTP | Thermo scientific | R0171 | |
| Faststart Universal SYBR green Master (Rox) | Roche | 4913922001 | |
| Faststart universal SYBR green master (Rox) fluorescent dye | Roche | 4913914001 | |
| Filtered tips | |||
| Forceps | Instrumentarium | HB275 | |
| Gauze | |||
| Hammer | |||
| High fat rodent diet | Bio-Serv, Frenchtown, NJ | F3282 | |
| Isopropanol | Laboratoire MAT | IH-0101 | |
| Leptin forward PCR primer (5’-GGGCTTCACCCCATTCTGA-3’) 10 uM | |||
| Leptin reverse PCR primer (5’-GGCTATCTGCAGCACATTTTG-3’) 10 uM | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Maxima Reverse Transcriptase (enzyme and 5x buffer) | Thermo scientific | EP0742 | |
| Nanopure water (referred as ultrapure water) | |||
| Nitrile examination gloves | |||
| Nitrile gloves | |||
| Normal rodent diet | Harlan Laboratories, Madison, WI | Harlan 2018 | |
| P1000 pipetman | |||
| P2 pipetman | |||
| P20 pipetman | |||
| P200 pipetman | |||
| Phenol solution (TRIzol) | Ambion Life Technologies | 15598018 | |
| Pre-identified aluminium foil | |||
| Quartz spectrophotometer cuvette | |||
| Rack for PCR tube strips | |||
| Racks for RT-PCR tube strips | |||
| Random hexamers | Invitrogen | 58875 | |
| Real-time PCR Rotor Gene system | Corbett research | RG-3000 Rotor-Gene thermal cycler | |
| Refrigerated bench-top centrifuge | |||
| RiboLock RNase Inhibitor | Thermo scientific | EO0381 | |
| RNase-free 1.5 mL eppendorf tubes | |||
| RNase-free 1.5 mL screw cap tubes | |||
| RNase-free PCR tube strips (0.2 mL) and caps | |||
| RNase-free water | Hyclone | SH30538.02 | |
| RT-PCR machine | Qiagen | Rotor-Gene Corbett 3000 | |
| RT-PCR tube strips (0.1 mL) and caps | |||
| S16 forward PCR primer (5’-ATCTCAAAGGCCCTGGTAGC-3’) 10 uM | |||
| S16 reverse PCR primer (5’ ACAAAGGTAAACCCCGATCG-3’) 10 uM | |||
| Spectrophotometer | Biochrom | Ultrospec 3100 pro | |
| Stainless steel mortar and pestle | |||
| Surgical pads | Home made a foam board wrapped in a disposable absorbent underpad | ||
| Surgical scissors | Intrumentarium | 130.450.11 | |
| Thermal cycler | |||
| Thermal cycler | Biometra | Thermocycler | |
| Vortex mixer | |||
| Weighing spatula |
References
- Guh, D. P., et al. The incidence of co-morbidities related to obesity and overweight: a systematic review and meta-analysis. BMC. Public Health. 9, 88 (2009).
- Wronska, A., Kmiec, Z. Structural and biochemical characteristics of various white adipose tissue depots. Acta Physiol (Oxf). 205 (2), 194-208 (2012).
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiol Rev. 84 (1), 277-359 (2004).
- Holland, N. T., Smith, M. T., Eskenazi, B., Bastaki, M. Biological sample collection and processing for molecular epidemiological studies. Mutat Res. 543 (3), 217-234 (2003).
- Ibrahim, M. M. Subcutaneous and visceral adipose tissue: structural and functional differences. Obes Rev. 11 (1), 11-18 (2010).
- Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. Localization, identification, and excision of murine adipose depots. J Vis Exp. (94), (2014).
- Hemmrich, K., Denecke, B., Paul, N. E., Hoffmeister, D., Pallua, N. RNA Isolation from Adipose Tissue: An Optimized Procedure for High RNA Yield and Integrity. Laboratory Medicine. 41 (2), 104-106 (2010).
- Cirera, S. Highly efficient method for isolation of total RNA from adipose tissue. BMC Res Notes. 6, 472 (2013).
- Tan, S. C., Yiap, B. C. DNA, RNA, and protein extraction: the past and the present. J Biomed Biotechnol. 2009, 574398 (2009).
- Sellin Jeffries, M. K., Kiss, A. J., Smith, A. W., Oris, J. T. A comparison of commercially-available automated and manual extraction kits for the isolation of total RNA from small tissue samples. BMC Biotechnol. 14, 94 (2014).
- Tan, P., et al. Impact of the prorenin/renin receptor on the development of obesity and associated cardiometabolic risk factors. Obesity (Silver. Spring). 22 (10), 2201-2209 (2014).
- Taylor, S., Wakem, M., Dijkman, G., Alsarraj, M., Nguyen, M. A practical approach to RT-qPCR-Publishing data that conform to the MIQE guidelines. Methods. 50 (4), 1-5 (2010).
- Aranda, P. S., LaJoie, D. M., Jorcyk, C. L. Bleach gel: a simple agarose gel for analyzing RNA quality. Electrophoresis. 33 (2), 366-369 (2012).
- Mercure, C., Prescott, G., Lacombe, M. J., Silversides, D. W., Reudelhuber, T. L. Chronic increases in circulating prorenin are not associated with renal or cardiac pathologies. Hypertension. 53 (6), 1062-1069 (2009).
- Dusaulcy, R., et al. Adipose-specific disruption of autotaxin enhances nutritional fattening and reduces plasma lysophosphatidic acid. J. Lipid Res. 52 (6), 1247-1255 (2011).
- Nakamura, K., Fuster, J. J., Walsh, K. Adipokines: a link between obesity and cardiovascular disease. J Cardiol. 63 (4), 250-259 (2014).
- Taylor, S. C., Mrkusich, E. M. The state of RT-quantitative PCR: firsthand observations of implementation of minimum information for the publication of quantitative real-time PCR experiments (MIQE). J Mol Microbiol Biotechnol. 24 (1), 46-52 (2014).
- Hummon, A. B., Lim, S. R., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Isolation and solubilization of proteins after TRIzol extraction of RNA and DNA from patient material following prolonged storage. Biotechniques. 42 (4), 467-470 (2007).
