الجمع بين تلطيخ Histochemical وتحليل الصور تحديد كمية النشا في Primordia المبيض من الكرز الحلو خلال فصل الشتاء السكون
Summary
نقدم منهجية لتقدير محتوى النشا في بريمورديا المبيض في الكرز الحلو (خوخ بالمتفطره L.) خلال فصل الشتاء السكون باستخدام نظام تحليل صورة جنبا إلى جنب مع تقنيات histochemical.
Abstract
التغييرات في النشا في الهياكل الصغيرة المرتبطة بالأحداث الرئيسية خلال عدة عمليات إنمائية النباتية، بما في ذلك المرحلة الإنجابية من التلقيح للاخصاب وبداية الاثمار. بيد الاختلافات في النشا خلال التمايز زهرة ليست تماما معروفة، أساسا بسبب صعوبة تقدير محتوى النشا في هياكل primordia زهرة صغيرة خاصة. هنا، يمكننا وصف طريقة للتحديد الكمي للنشا في primordia المبيض من الكرز الحلو (خوخ بالمتفطره L.) باستخدام نظام تحليل صورة المرفقة بالمجهر، مما يسمح المتعلقة بالتغييرات في محتوى النشا مع المراحل المختلفة من السكون من الخريف إلى الربيع. لهذا الغرض، تتحدد حالة السكون من براعم الزهور بتقييم نمو برعم البراعم نقلت إلى ظروف خاضعة للرقابة في أوقات مختلفة في وقت الشتاء. للتحديد الكمي للنشا في primordia المبيض، براعم الزهور تسلسلياً جمعت وثابتة، وجزءاً لا يتجزأ من شمع البارافين، مقطوع وملطخة بانا2-كوالا لمبور (يوديد البوتاسيوم-اليود). لاحظ تحت المجهر الأعمال التحضيرية وتحليلها بواسطة محلل صورة وضوح يميز النشا من الخلفية. يتم الحصول على قيم محتوى النشا بقياس الكثافة الضوئية للصورة التي تناظر النشا الملون، النظر في مجموع الكثافة البصرية لكل بكسل كتقدير محتوى النشا إطار درس.
Introduction
المعتدلة والجنيبات تتكيف مع المواسم بتحوير على النمو والتنمية. في حين أن تتطور خلال فصلي الربيع والصيف، أنها تتوقف عن النمو خلال فصل الخريف للانتقال الخاملة في فصل الشتاء1. تقشعر لها اﻷبدان على الرغم من السكون يسمح لهم بالبقاء على قيد الحياة في درجات الحرارة في فصل الشتاء منخفضة، شرط أساسي للبراعم سليم في الربيع2. آثار هامة من السكون في إنتاج فاكهة المناطق المعتدلة والغابات أدت إلى جهود متنوعة لتحديد وتوقع فترة السكون3. في أنواع أشجار الفاكهة، هي تجارب التجريبية تحويل البراعم إلى فرض شروط والتنبؤات الإحصائية استناداً إلى بيانات المزهرة النهج الحالية لتحديد التاريخ لكسر السكون، مما يسمح للباحثين لتقدير تقشعر لها اﻷبدان الاحتياجات لكل الأصناف المستنبطة. ومع ذلك، تظل كيفية تحديد حالة السكون استناداً إلى العمليات البيولوجية غير واضحة3.
الأزهار في أشجار فاكهة المناطق المعتدلة، مثل الكرز الحلو (خوخ بالمتفطره L.)، تحدث مرة واحدة في سنة، ويستمر عن أسبوعين. ومع ذلك، بدء الزهور التفريق ووضع حوالي 10 أشهر، وخلال الصيف الماضي4. زهرة primordia تتوقف عن النمو خلال فصل الخريف تظل نائمة داخل البراعم خلال فصل الشتاء. وفي هذه الفترة، يحتاج كل الأصناف المستنبطة تتراكم شرطا تقشعر لها اﻷبدان خاصة المزهرة السليم4. وعلى الرغم من عدم وجود تغييرات phenological في براعم خلال فصل الشتاء، زهرة primordia فسيولوجيا نشطة أثناء السكون وتراكم تقشعر لها اﻷبدان درجات الحرارة ارتبط مؤخرا مع دينامية تراكم النشا أو إنقاصها داخل خلايا primordium المبيض، تقدم نهجاً جديداً للسكون تصميم5. غير أن صغر حجم وموقع بريمورديوم المبيض يتطلب منهجية خاصة.
النشا من الكربوهيدرات مخزن كبير في أنواع النباتات الخشبية6. وهكذا، تم المتصلة بالتغيرات في النشا بالنشاط الفسيولوجية لانسجة الزهرة، التي تحتاج إلى الكربوهيدرات لدعم هذه التنمية7،8. أحداث رئيسية مختلفة أثناء عملية الإنجاب تتصل أيضا بالتغيرات في محتوى النشا في هياكل الأزهار مختلفة، مثل العضو الذكرى الانقسام الاختزالي9، نمو أنابيب اللقاح عن طريق التسميد نمط أو أوفولي10. تسمح التقنيات histochemical الكشف عن النشا في كل الأنسجة خاصة من بريمورديا زهرة أثناء السكون. ومع ذلك، يظل الصعوبة في التحديد الكمي لأن النشا للسماح في أعقاب النمط لتقليل تراكم على مر الزمن أو مقارنة النشا المحتوى بين الأنسجة، والأصناف، أو سنوات. وهذا نظراً لكمية ضئيلة من أنسجة للتقنيات التحليلية11. وكبديل لذلك، يسمح تحليل الصور المرتبطة بالفحص المجهري12 التحديد الكمي للنشا في عينات صغيرة جداً من الأنسجة النباتية13.
وقد استخدمت نهج الجمع بين التحليل المجهري والصورة التحديد الكمي لمحتوى مكونات مختلفة في الأنسجة النباتية، مثل كلوس14،15من microtubes، أو النشا16، بقياس حجم منطقة مصبوغ بخاصة البقع. للنشويات، فإنه يمكن بسهولة الكشف عن استخدام اليود في يوديد البوتاسيوم (أنا2كي) رد فعل17. هذا الأسلوب محددة للغاية؛ أنا2كي إينتيركالاتيس داخل بنية طبقية من الحبوب النشا وأشكال داكنة لون الأزرق أو البنى المحمر، اعتماداً على محتوى اميلوز النشاء18. أقسام ملطخة بانا2كي وصمة عار إظهار التباين كافية بين النشا والأنسجة الخلفية، مما يسمح الكشف عن نشأ لا لبس فيه والتقدير الكمي لاحقاً ب نظام تحليل الصورة19. على الرغم من أن هذه الصبغة غير المقايسة، تراكم اليود يتناسب مع طول جزيء النشا، التي يمكن أن تختلف الغاية17. وهكذا، حجم المنطقة الملون معبراً عنها بعدد البكسل قد لا تعكس بدقة محتوى النشا، حيث يمكن إيجاد فروق عالية في محتوى النشا بين الحقول باستخدام المناطق الملون من حجم مماثل. وكبديل لذلك، يمكن تقييم محتوى النشا بقياس الكثافة البصرية من الحبيبات الملون على الصور بالأبيض والأسود التي تم الحصول عليها من المجهر، كما أفيد في أنسجة مختلفة في المشمش8،13 , 19،20من اﻷفوكادو10،، و الزيتون21.
هنا، يمكننا وصف منهجية تجمع بين تصميم تجريبي من حالة السكون بالتحديد الكمي لمحتوى النشا في أنسجة المبيض بريمورديوم من الخريف إلى الربيع في الكرز الحلو، يوفر أداة جديدة للفهم والتنبؤ من السكون استناداً إلى دراسة الآليات البيولوجية المرتبطة بالسكون.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويعرض السكون في والجنيبات آثار واضحة في إنتاج الفاكهة والغابات في تغير مناخ، على الرغم من أن هذه العملية البيولوجية وراء السكون لا يزال غير واضح. دراسات السكون يمكن تناولها من وجهات نظر مختلفة، ولكن البحث ابحث عن علامة بيولوجية للسكون الشتوية كثفت خلال السنوات الماضية. ومع ذلك، كانت معظم …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون امتنان هيريرو ماريا وريفاس ايليسيو على المناقشة المفيدة والمشورة. هذا العمل كان يدعمها ص دي وزارة الاقتصاد كومبيتيتيفيداد-“الصندوق الأوروبي للتنمية الإقليمية”، الاتحاد الأوروبي منحة العدد [بس–2010–037992 واو هاء]؛ نعم المعهد الوطني لبحوث التكنولوجيا الزراعي y اليمنتيريا [منح أرقام RFP2015-00015-00، RTA2014-00085-00، RTA2017-00003-00]؛ والحكومة دي أراغون – “الصندوق الاجتماعي الأوروبي”، والاتحاد الأوروبي [Grupo تسبب A12-17R].
Materials
| Precision scale | Sartorius | CP225D | |
| Stereoscopic microscope | Leica Microsystems | MZ-16 | |
| Drying-stove | Memmert | U15 | |
| Paraffin Embedding station | Leica Microsystems | EG1140H | |
| Rotatory microtome | Reichert-Jung | 1130/Biocut | |
| Microtome blade | Feather | S35 | Stainless steel |
| Bright field microscope | Leica Microsystems | DM2500 | |
| Digital Camera | Leica Microsystems | DC-300 | |
| Image Analysis System | Leica Microsystems | Quantiment Q550 |
Riferimenti
- Kurokura, T., Mimida, N., Battey, N. H., Hytönen, T. The regulation of seasonal flowering in the Rosaceae. Journal of Experimental Botany. 64 (14), 4131-4141 (2013).
- Rohde, A., Bhalerao, R. P. Plant dormancy in the perennial context. Trends in Plant Science. 12 (5), 217-223 (2007).
- Fadón, E., Rodrigo, J. Unveiling winter dormancy through empirical experiments. Environmental and Experimental Botany. 152, 28-36 (2018).
- Fadón, E., Rodrigo, J., Herrero, M. Is there a specific stage to rest? Morphological changes in flower primordia in relation to endodormancy in sweet cherry (Prunus avium L.). Trees – Structure and Function. , (2018).
- Fadón, E., Herrero, M., Rodrigo, J. Dormant flower buds actively accumulate starch over winter in sweet cherry. Frontiers in Plant Science. 9 (171), (2018).
- Loescher, W. H., Mccamant, T., Keller, J. D. Carbohydrate reserves, translocation and storage in woody plant roots. HortScience. 25 (3), 274-281 (1990).
- Hedhly, A., et al. Starch turnover and metabolism during flower and early embryo development. Plant Physiology. , (2016).
- Rodrigo, J., Hormaza, J. I., Herrero, M. Ovary starch reserves and flower development in apricot (Prunus armeniaca). Physiologia Plantarum. 108 (1), 35-41 (2000).
- Julian, C., Rodrigo, J., Herrero, M. Stamen development and winter dormancy in apricot (Prunus armeniaca). Annals of Botany. 108 (4), 617-625 (2011).
- Alcaraz, M. L., Hormaza, J. I., Rodrigo, J. Pistil starch reserves at anthesis correlate with final flower fate in avocado (Persea americana). PLoS One. 8 (10), e78467 (2013).
- Smith, A. M., Zeeman, S. C. Quantification of starch in plant tissues. Nature Protocols. 1 (3), 1342-1345 (2006).
- Eliceiri, K. W., et al. Biological Imaging Software Tools. Nature Methods. 9 (7), (2013).
- Rodrigo, J., Herrero, M. Influence of intraovular reserves on ovule fate in apricot (Prunus armeniaca L.). Sexual Plant Reproduction. 11, 86-93 (1998).
- Zhou, J., Spallek, T., Faulkner, C., Robatzek, S. CalloseMeasurer: A novel software solution to measure callose deposition and recognise spreading callose patterns. Plant Methods. 8 (1), (2012).
- Faulkner, C., et al. An automated quantitative image analysis tool for the identification of microtubule patterns in plants. Traffic. 18 (10), 683-693 (2017).
- Kuhn, B. F. Determination of starch in ovules of the sour cherry cv. "Stevnsbaer.". European Journal of Horticultural Science. 71 (3), 120-124 (2006).
- Johansen, D. A. . Plant microtechnique. , (1940).
- Ruzin, S. E. . Plant microtechnique and microscopy. , (1999).
- Rodrigo, J., Rivas, E., Herrero, M. Starch determination in plant tissues using a computerized image analysis system. Physiologia Plantarum. 99 (1), 105-110 (1997).
- Alcaraz, M. L., Hormaza, J. I., Rodrigo, J. Ovary starch reserves and pistil development in avocado (Persea americana). Physiologia Plantarum. 140 (4), 395-404 (2010).
- Suarez, C., Castro, A. J., Rapoport, H. F., Rodriguez-García, M. I. Morphological, histological and ultrastructural changes in the olive pistil during flowering. Sexual Plant Reproduction. 25, 133-146 (2012).
- Lang, G. A., Early, J. D., Martin, G. C., Darnell, R. L. Endodormancy, paradormancy, and ecodormancy – Physiological terminology and classification for dormancy research. HortScience. 22 (3), 371-377 (1987).
- Hedhly, A., Vogler, H., Eichenberger, C., Grossniklaus, U. Whole-mount clearing and staining of arabidopsis flower organs and siliques. Journal of Visualized Experiments. 2018 (134), 1-10 (2018).
- Kaufmann, H., Blanke, M. Changes in carbohydrate levels and relative water content (RWC) to distinguish dormancy phases in sweet cherry. Journal of Plant Physiology. 218 (July), 1-5 (2017).
- Herrero, M., Dickinson, H. G. Pollen-pistil incompatibility in Petunia hybrida: changes in the pistil following compatible and incompatible intraspecific crosses. Journal of Cell Science. 36, 1-18 (1979).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7 (10), R100 (2006).
