Сочетая гистохимические окрашивание и анализа изображений для количественного определения крахмала в яичнике Примордия черешни во время зимней спячки
Summary
Мы представляем методологии для количественного определения содержания крахмала в яичнике Примордия в черешня (Prunus avium L.) во время зимней спячки с помощью системы анализа изображений в сочетании с гистохимические методы.
Abstract
Изменения в крахмал в небольших структур связаны с ключевыми событиями во время нескольких процессов развития растений, включая репродуктивной фазы от опыления для оплодотворения и наступлением плодоношения. Однако вариации в крахмала во время дифференциация цветок не известны полностью, главным образом ввиду трудности количественного содержания крахмала в особенно малые структуры Примордия цветок. Здесь мы описываем метод количественного определения крахмала в яичнике Примордия черешни (Prunus avium L.) с помощью системы анализа изображений прилагается к Микроскоп, который позволяет, касающиеся изменений в содержание крахмала с различными фазами покоя с осени до весны. Для этой цели состояние покоя бутоны определяется путем оценки почка роста побегов, переведен в контролируемых условиях в различные моменты в зимнее время. Для количественной оценки крахмала в яичнике Примордия, бутоны последовательно собираются, фиксированной, встроенные в парафин, секционного и витражи с я2КЛ (калия йодида йод). Подготовка наблюдается под микроскопом и анализируются анализатором изображения, что отличает крахмала от фона. Содержание крахмала значения получаются путем измерения оптической плотности изображения, которое соответствует окрашенных крахмала, учитывая сумму оптической плотности каждого пикселя как оценки содержание крахмала изучал кадра.
Introduction
Умеренный древесных многолетних растений адаптироваться к сезоны, модулируя их роста и развития. В то время как они развиваются весной и летом, они перестают расти в течение осени пойти спящие в зимний1. Хотя состояние покоя позволяет им выжить в низких зимних температур, охлаждения является необходимым условием для надлежащего budburst в весной2. Важные последствия покоя в умеренных фруктов производства и лесного хозяйства привели к разнообразные усилия для определения и прогнозирования периода покоя3. В фруктовых деревьев, эмпирических экспериментов, передачи побеги заставляя условий и статистические прогнозы, основанные на данных цветения являются нынешние подходы к определить дату нарушение покоя, которая позволяет исследователям оценить охлаждение требования для каждого сорта. Однако как определить состояние покоя, основанные на биологических процессов остается неясным3.
Цветение в умеренных фруктовые деревья, такие как черешня (Prunus avium L.), происходит один раз в год и длится около недели. Однако цветы начинают различать и развивать около 10 месяцев назад, во время предыдущих летних4. Цветок Примордия остановить рост в течение осени оставаться спящие внутри почки в зимний период. В этот период каждый сорт необходимо накапливать конкретное требование охлаждения для надлежащего цветения4. Несмотря на отсутствие фенологическими изменениями в почки зимой цветок Примордия физиологически активны во время покоя, и накопление охлаждения температуры был недавно связан с динамика накопления крахмала или уменьшить в рамках клеток зачаток яичника предлагая новый подход для определения покоя5. Однако малый размер и расположение яичников зачаток требуют специальной методологии.
Крахмал является основным хранения углеводов в видов древесных растений6. Таким образом изменения в крахмал были связаны с физиологической активности цветок ткани, которые нужно углеводов для поддержки их развития7,8. Также различные ключевые события в ходе репродуктивного процесса связаны с вариациями в содержание крахмала в разных цветочной структур, таких как пыльников мейоз9, рост пыльцы трубы через стиль или яйцеклетку оплодотворение10. Гистохимические методы позволяют выявлять крахмала в каждой конкретной ткани цветок Примордия во время покоя. Однако трудность остается в количественном определении что крахмала, чтобы после его шаблон накопления/уменьшение времени или сравнения крахмала контента среди тканей, сортов или лет. Это объясняется небольшое количество ткани для аналитических методов11. В качестве альтернативы анализ изображений, связанных с микроскопии12 позволяет количественная оценка крахмала в очень малых образцов тканей растений13.
Подходы, сочетающие анализ микроскопии и изображения были использованы для количественного определения содержания различных компонентов в тканях растений, например, callose14,15пробирок, или крахмала16, измеряя размер области, окрашенные конкретными пятна. Для крахмала, это могут быть легко обнаружены, используя иодид калия йод (I2KI) реакции17. Этот метод является весьма специфический; Я2ки встраивается в рамках слоистые структуры крахмала зерна и образует темно синий или красновато коричневый цвет, в зависимости от амилоза содержание крахмала18. Разделы, окрашенных с я пятно ки2Показать адекватные контраст между крахмала и фон ткани, позволяя недвусмысленное крахмала обнаружения и последующего количественной системы анализа изображений19. Хотя эта краска не является стехиометрическим, накопление йода пропорциональна длина молекулы крахмала, которые могут весьма различаться17. Таким образом размер окрашенные области, выраженный в виде количество пикселей не может точно отражать содержание крахмала, поскольку высокая различия в содержание крахмала можно найти между полями с окрашенных областей аналогичного размера. В качестве альтернативы содержание крахмала может оцениваться путем измерения оптической плотности окрашенных гранул на черно-белых изображений, полученных с микроскопом, как сообщалось в различных тканях абрикосовое8,13 , 19,20авокадо10,и оливковых21.
Здесь мы описываем методологии, которая сочетает в себе экспериментального определения состояния покоя с количественного определения содержания крахмала в зачаток ткани яичника с осени до весны в вишни, предлагая новый инструмент для понимания и прогнозирования покоя, основанный на изучении биологических механизмов связана с покоя.
Protocol
Representative Results
Discussion
Покоя в древесных многолетних растений представляет четкие последствия в производство фруктов и лесного хозяйства в условиях изменения климата, хотя остается неясным, биологический процесс позади покоя. Покоя исследования можно подойти с различных точек зрения, но исследования, ищет…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят с благодарностью Мария Эрреро и Eliseo Ривас за их полезные обсуждения и консультации. Эта работа была поддержана Ministerio де Economía y развитию — Европейский фонд регионального развития, Европейский союз [Грант число BES-2010-037992 е. ф.]; Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria [номера грантов RFP2015-00015-00, RTA2014-00085-00, RTA2017-00003-00]; и городского управления-де-Арагон — Европейский Социальный фонд, Европейский союз [Grupo Консолидадо A12-17R].
Materials
| Precision scale | Sartorius | CP225D | |
| Stereoscopic microscope | Leica Microsystems | MZ-16 | |
| Drying-stove | Memmert | U15 | |
| Paraffin Embedding station | Leica Microsystems | EG1140H | |
| Rotatory microtome | Reichert-Jung | 1130/Biocut | |
| Microtome blade | Feather | S35 | Stainless steel |
| Bright field microscope | Leica Microsystems | DM2500 | |
| Digital Camera | Leica Microsystems | DC-300 | |
| Image Analysis System | Leica Microsystems | Quantiment Q550 |
Riferimenti
- Kurokura, T., Mimida, N., Battey, N. H., Hytönen, T. The regulation of seasonal flowering in the Rosaceae. Journal of Experimental Botany. 64 (14), 4131-4141 (2013).
- Rohde, A., Bhalerao, R. P. Plant dormancy in the perennial context. Trends in Plant Science. 12 (5), 217-223 (2007).
- Fadón, E., Rodrigo, J. Unveiling winter dormancy through empirical experiments. Environmental and Experimental Botany. 152, 28-36 (2018).
- Fadón, E., Rodrigo, J., Herrero, M. Is there a specific stage to rest? Morphological changes in flower primordia in relation to endodormancy in sweet cherry (Prunus avium L.). Trees – Structure and Function. , (2018).
- Fadón, E., Herrero, M., Rodrigo, J. Dormant flower buds actively accumulate starch over winter in sweet cherry. Frontiers in Plant Science. 9 (171), (2018).
- Loescher, W. H., Mccamant, T., Keller, J. D. Carbohydrate reserves, translocation and storage in woody plant roots. HortScience. 25 (3), 274-281 (1990).
- Hedhly, A., et al. Starch turnover and metabolism during flower and early embryo development. Plant Physiology. , (2016).
- Rodrigo, J., Hormaza, J. I., Herrero, M. Ovary starch reserves and flower development in apricot (Prunus armeniaca). Physiologia Plantarum. 108 (1), 35-41 (2000).
- Julian, C., Rodrigo, J., Herrero, M. Stamen development and winter dormancy in apricot (Prunus armeniaca). Annals of Botany. 108 (4), 617-625 (2011).
- Alcaraz, M. L., Hormaza, J. I., Rodrigo, J. Pistil starch reserves at anthesis correlate with final flower fate in avocado (Persea americana). PLoS One. 8 (10), e78467 (2013).
- Smith, A. M., Zeeman, S. C. Quantification of starch in plant tissues. Nature Protocols. 1 (3), 1342-1345 (2006).
- Eliceiri, K. W., et al. Biological Imaging Software Tools. Nature Methods. 9 (7), (2013).
- Rodrigo, J., Herrero, M. Influence of intraovular reserves on ovule fate in apricot (Prunus armeniaca L.). Sexual Plant Reproduction. 11, 86-93 (1998).
- Zhou, J., Spallek, T., Faulkner, C., Robatzek, S. CalloseMeasurer: A novel software solution to measure callose deposition and recognise spreading callose patterns. Plant Methods. 8 (1), (2012).
- Faulkner, C., et al. An automated quantitative image analysis tool for the identification of microtubule patterns in plants. Traffic. 18 (10), 683-693 (2017).
- Kuhn, B. F. Determination of starch in ovules of the sour cherry cv. "Stevnsbaer.". European Journal of Horticultural Science. 71 (3), 120-124 (2006).
- Johansen, D. A. . Plant microtechnique. , (1940).
- Ruzin, S. E. . Plant microtechnique and microscopy. , (1999).
- Rodrigo, J., Rivas, E., Herrero, M. Starch determination in plant tissues using a computerized image analysis system. Physiologia Plantarum. 99 (1), 105-110 (1997).
- Alcaraz, M. L., Hormaza, J. I., Rodrigo, J. Ovary starch reserves and pistil development in avocado (Persea americana). Physiologia Plantarum. 140 (4), 395-404 (2010).
- Suarez, C., Castro, A. J., Rapoport, H. F., Rodriguez-García, M. I. Morphological, histological and ultrastructural changes in the olive pistil during flowering. Sexual Plant Reproduction. 25, 133-146 (2012).
- Lang, G. A., Early, J. D., Martin, G. C., Darnell, R. L. Endodormancy, paradormancy, and ecodormancy – Physiological terminology and classification for dormancy research. HortScience. 22 (3), 371-377 (1987).
- Hedhly, A., Vogler, H., Eichenberger, C., Grossniklaus, U. Whole-mount clearing and staining of arabidopsis flower organs and siliques. Journal of Visualized Experiments. 2018 (134), 1-10 (2018).
- Kaufmann, H., Blanke, M. Changes in carbohydrate levels and relative water content (RWC) to distinguish dormancy phases in sweet cherry. Journal of Plant Physiology. 218 (July), 1-5 (2017).
- Herrero, M., Dickinson, H. G. Pollen-pistil incompatibility in Petunia hybrida: changes in the pistil following compatible and incompatible intraspecific crosses. Journal of Cell Science. 36, 1-18 (1979).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7 (10), R100 (2006).
