结合组织化学染色与图像分析对甜樱桃子房冬冬期淀粉的定量
Summary
我们提出了一种方法, 以量化淀粉含量的卵巢原基在冬季休眠期间使用图像分析系统结合组织化学技术。
Abstract
在几个植物发育过程中, 淀粉的变化与关键事件有关, 包括从授粉到受精的生殖阶段和果实的开始。然而, 淀粉在花分化过程中的变化尚不完全清楚, 主要是由于难以量化淀粉含量的特别小的结构的花原体。在这里, 我们描述了一种方法, 以定量淀粉在卵巢原基甜樱桃 (金银花) 使用图像分析系统附加到显微镜, 允许将淀粉含量的变化与不同阶段的关系从秋天到春天的休眠状态。为此, 通过评价在冬季不同时刻转移到可控条件下的芽芽生长, 确定花蕾的休眠状态。为了定量卵巢原基中的淀粉, 花蕾按顺序收集、固定、嵌入石蜡、切片, 并用 i2kl (碘化钾) 染色。在显微镜下观察制剂, 并通过图像分析仪进行分析, 该分析仪可将淀粉与背景明确区分开来。淀粉含量值是通过测量与染色淀粉相对应的图像的光学密度得到的, 同时考虑到每个像素的光学密度之和作为对所研究框架淀粉含量的估计。
Introduction
温带多年生植物通过调节生长发育来适应季节。虽然它们在春季和夏季发育, 但在秋天停止生长, 在冬季处于休眠状态。虽然休眠使他们能够在较低的冬季温度下生存, 寒意是一个先决条件, 在春天适当的芽2。休眠对温带水果生产和林业的重要影响, 导致了确定和预测休眠期的各种努力。在果树物种中, 将芽转移到强迫条件下的经验实验和基于开花数据的统计预测是目前确定休眠打破日期的方法, 这使得研究人员能够估计每个品种的冷却要求。然而, 如何根据生物过程确定休眠状态仍不清楚3。
在温带果树上开花, 如甜樱桃, 每年开花一次 , 持续约两周。然而, 花开始分化和发展大约10个月前, 在前一个夏天4。花原基在秋天停止生长, 在冬季在芽内保持休眠状态。在此期间, 每个品种需要积累适当开花的特定冷却要求 4.尽管在冬季芽缺乏物候变化, 但在休眠期间, 花原体在生理上是活跃的, 最近, 寒冷温度的积累与淀粉积累或减少的动态有关在卵巢原基细胞内, 为休眠测定提供了一种新的方法 5.然而, 卵巢原基的小尺寸和位置需要一种特殊的方法。
淀粉是木本植物中主要的碳水化合物.因此, 淀粉的变化与花组织的生理活性有关, 花组织需要碳水化合物来支持它们的发育7,8。不同的关键事件在生殖过程中也与不同花系中淀粉含量的变化有关, 如花药减数分裂9、花粉管的生长通过花粉室受精 10.组织化学技术可以在休眠期检测花原基每个特定组织中的淀粉。然而, 在量化淀粉, 使其随着时间的推移减少的模式或比较组织, 品种或年份之间的淀粉含量仍然是困难的。这是因为可用于分析技术的组织数量很少11。作为一种替代方法, 与显微镜12 相关联的图像分析允许对植物组织13的非常小的样本中的淀粉进行定量。
显微镜和图像分析相结合的方法已被用来量化植物组织中不同成分的含量, 如钙质14、微管15或淀粉16, 方法是测量按特定染色面积的大小。污渍。对于淀粉, 它可以很容易地检测到它使用碘钾 (i2ki) 反应17。此方法是非常具体的;i2 ki 在淀粉颗粒的层流结构内进行夹层, 并根据淀粉18的直链淀粉含量形成深蓝色或红棕色。染色 i2ki 染色的切片显示淀粉和背景组织之间的充分对比度, 允许明确的淀粉检测和随后的量化图像分析系统19。虽然这种染料不是化学计量的, 但碘的积累与淀粉分子的长度成正比, 淀粉分子的长度变化很大,变化很大。因此, 以像像像像素数表示的染色面积的大小可能无法准确地反映淀粉的含量, 因为在染色面积相似的字段之间可以发现淀粉含量的高差异。作为一种替代方法, 可以通过测量从显微镜获得的黑白图像上的染色颗粒的光学密度来评估淀粉含量, 因为在杏子8,13的不同组织中都有报道。,19, 鳄梨10,20和橄榄21.
本文介绍了一种将休眠状态的实验测定与秋季至春季甜樱桃卵巢原基组织淀粉含量的定量相结合的方法, 为理解和预测提供了一种新的工具。休眠的基础上研究的生物机制与休眠。
Protocol
Representative Results
Discussion
在气候变化的情况下, 木本多年生植物的休眠对水果生产和林业产生了明显的影响, 尽管休眠背后的生物过程仍不清楚。休眠研究可以从不同的角度来探讨, 但在过去几年里, 寻找冬季休眠生物标记的研究有所加强。然而, 大多数试图找到一个明确的指标, 当一个芽已经打破休眠的失败 3.本文所描述的方法,将组织化学技术18与分析图像相结合, 对研究某一特定组织?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感激地感谢玛丽亚·赫雷罗和埃利塞奥·里瓦斯的有益讨论和建议。这项工作得到了欧洲联盟欧洲区域发展基金—-欧洲区域发展基金—-的支持 [赠款编号 bes-2010-037992 至 E. f.];国家调查研究所 [赠款编号 Rfp2015-00015-00, RTA全85-00, RTA2017-00003-00];和 Gobierno de Aragón—-欧洲社会基金, 欧洲联盟 [Grupo 格兰达·阿林塔多 a12-17r]。
Materials
| Precision scale | Sartorius | CP225D | |
| Stereoscopic microscope | Leica Microsystems | MZ-16 | |
| Drying-stove | Memmert | U15 | |
| Paraffin Embedding station | Leica Microsystems | EG1140H | |
| Rotatory microtome | Reichert-Jung | 1130/Biocut | |
| Microtome blade | Feather | S35 | Stainless steel |
| Bright field microscope | Leica Microsystems | DM2500 | |
| Digital Camera | Leica Microsystems | DC-300 | |
| Image Analysis System | Leica Microsystems | Quantiment Q550 |
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