שילוב של צביעת פתולוגיה וניתוח התמונה לכמת עמילן ב Primordia השחלה של דובדבן מתוק במהלך החורף תרדמה
Summary
אנו מציגים מתודולוגיה לכמת את תכולת עמילן primordia שחלה בדובדבן מתוק (שקד avium ל’) במהלך החורף תרדמה באמצעות מערכת ניתוח תמונה בשילוב עם טכניקות מעבדה הומנית.
Abstract
שינויים עמילן במבנים קטנים הם קשורים אירועי מפתח במהלך מספר תהליכים פיתוחיים צמח, כולל השלב הרבייה של האבקה הפריה, תחילת fruiting. עם זאת, בווריאציות עמילן במהלך התמיינות פרח לא לגמרי ידועים, בעיקר בשל הקושי לכמת את תכולת עמילן המבנים קטן במיוחד של primordia הפרחים. כאן, אנו מתארים שיטה כימות של עמילן ב primordia השחלה של דובדבן מתוק (שקד avium ל’) באמצעות מערכת ניתוח התמונה המצורפת המיקרוסקופ, אשר מאפשר הנוגעות לשינויים בתוכן עמילן עם השלבים השונים של תרדמה האביב. למטרה זו, המצב תרדמה של ניצני פרחים נקבעת לפי הערכת את הצמיחה ניצן של נצרי הועבר תנאים מבוקרים ברגעים שונים בזמן חורף. עבור כימות של עמילן ב primordia השחלה, ניצני פרחים ברצף שנאספו, קבוע, המוטבעות פרפין, למחלקה, מוכתם אני2Kl (אשלגן יודיד-יוד). ההכנות שנצפו תחת המיקרוסקופ, נותחו על ידי מנתח התמונה בבירור שיבדיל עמילן מהרקע. ערכי תוכן עמילן מתקבלים על ידי מדידת צפיפות אופטית של התמונה התואם העמילן מוכתם, בהתחשב סכום הצפיפות האופטית של כל פיקסל כמו אומדן של עמילן תוכן של מסגרת למד.
Introduction
צמחים רב שנתיים וודי ממוזג להסתגל העונות על ידי להתכוונן וההתפתחות שלהם. בעוד הם מפתחים במהלך האביב והקיץ, הם מפסיקים לגדול במהלך הסתיו ללכת רדום בחורף1. למרות תרדמה מאפשר להם לשרוד בטמפרטורות נמוכות בחורף, מצמרר הוא תנאי הכרחי budburst נאות אביב2. ההשלכות חשוב של תרדמה ייצור פירות ממוזג, יערנות הובילו מאמצים מגוונות כדי לקבוע ולחזות את תקופת תרדמה3. במינים עץ פרי, ניסויים אמפיריים העברת נצרי לכפות תנאים ותחזיות סטטיסטי המבוסס על נתונים של פריחה הם לגישות כדי לקבוע את התאריך של שבירת תרדמה, אשר מאפשר לחוקרים להעריך דרישות עבור כל לדבורי מצמרר. עם זאת, כיצד לקבוע את מצב תרדמה המבוססת על תהליכים ביולוגיים נשאר לא ברור3.
פורחים עצי פרי ממוזג, כגון דובדבן מתוק (שקד avium ל’), מתרחש פעם בשנה ונמשך שבועיים לערך. עם זאת, פרחים מתחיל להבדיל ולפתח כ 10 חודשים קודם לכן, במהלך הקיץ הקודם4. פרח primordia מפסיקים לגדול במהלך הסתיו להישאר רדום בתוך הניצנים בחורף. על תקופה זו, כל לדבורי צריך לצבור דרישה מצמררת במיוחד עבור פריחה נאותה4. למרות העדר phenological לשינויים הניצנים בחורף, פרח primordia פעילים מבחינה פיזיולוגית בתקופת תרדמה, ההצטברות של מצמרר טמפרטורות שויכה לאחרונה הדינמיקה של הצטברות עמילן או להקטין בתוך התאים של ראשית השחלה, מציעים גישה חדשה עבור תרדמה נחישות5. עם זאת, גודלו הקטן ואת המיקום של ראשית השחלה דורשים מתודולוגיה מיוחד.
עמילן הוא הפחמימות אחסון מרכזיים וודי צמח מינים6. לפיכך, שינויים עמילן קשורות לפעילות הפיזיולוגית של הרקמות פרח, אשר זקוקים לפחמימות לתמיכה שלהם פיתוח7,8. אירועים מרכזיים שונים במהלך תהליך הרבייה קשורים גם וריאציות בתוכן עמילן במבנים פרחים שונים, כגון מיוזה בצרכן9, הגידול של הצינורות אבקה דרך סגנון או ביצית הפריה10. טכניקות פתולוגיה לאפשר הגילוי של עמילן ברקמה מסוימת כל של primordia פרח בתקופת תרדמה. עם זאת, הקושי נשאר לכימות הזה עמילן כדי לאפשר בעקבות דפוס שלו הצטברות/ירידה לאורך זמן או השוואת העמילן תוכן בין רקמות, הזנים או שנים. זאת בשל הכמות הקטנה של רקמה זמין עבור שיטות אנליטיות11. כחלופה, ניתוח תמונות מקושר מיקרוסקופ12 מאפשר כימות של העמילן קטנה מאוד דגימות של רקמות הצמח13.
גישות שילוב מיקרוסקופ וניתוח התמונה שימשו כדי לכמת את התוכן של מרכיבים שונים ברקמות הצמח, כגון callose14, microtubes15, או עמילן16, על ידי מדידת הגודל של אזור צבוע על ידי ספציפי כתמים. עבור עמילן, זה ניתן בקלות להבחין באמצעות אשלגן יודיד-יוד (אני2קי) תגובה17. שיטה זו היא מאוד ספציפית; אני2קי intercalates בתוך המבנה למינריות של גרגרי עמילן וצורות כחול או חום-אדמדם בצבע כהה, בהתאם לתוכן עמילוז עמילן18. סעיפים מוכתמים אני2קי הכתם להציג ניגודיות הולמת בין עמילן הרקמה רקע, המאפשר זיהוי עמילן חד-משמעית של כימות עוקבות מערכת ניתוח תמונה19. למרות צבע זו אינה stoichiometric, ההצטברות של יוד הוא יחסי האורך של מולקולת עמילן, אשר יכול להשתנות מאוד17. לפיכך, גודל האזור המוכתם לבטא את מספר הפיקסלים אינן משקפות בהכרח במדויק את תכולת עמילן, מאז ההבדלים גבוהה בתוכן עמילן יכול להימצא בין שדות עם האזורים המוכתמים גודל דומה. כחלופה, תכולת עמילן יכול להיות מוערך על ידי מדידת צפיפות אופטית גרגרי מוכתם על תמונות בשחור-לבן המתקבל המיקרוסקופ, כפי שדווח ברקמות שונות משמש8,13 , 19, אבוקדו10,20וזית21.
כאן, אנו מתארים מתודולוגיה המשלבת הקביעה ניסיוני של תרדמה מצב עם כימות של עמילן בתוכן רקמת השחלה ראשית האביב, דובדבן מתוק, ומציע כלי חדש הבנה, חיזוי של תרדמה המבוסס על חקר המנגנונים הביולוגיים קשורות תרדמה.
Protocol
Representative Results
Discussion
תרדמה של וודי למלחמת ששת הימים מציג השלכות ברורות בייצור פירות, יערנות באקלים שינוי, למרות תהליך ביולוגי מאחורי תרדמה עדיין לא ברור. תרדמה מחקרים ניתן לצפות דרך נקודות מבט שונות, אך המחקר מחפש סמן ביולוגי החורף תרדמה החריפה בשנים האחרונות. עם זאת, רוב ניסיונות למצוא את מחוון חד-משמעית מראה …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים בתודה מריה Herrero, Eliseo ריבאס על דיון מועיל ועצות שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי y Ministerio דה Economía Competitividad — קרן פיתוח אזוריים אירופה, האיחוד האירופי [מספר גרנט ולבס-2010-037992 ל פ א]; y אינסטיטוטו נאסיונאל דה Investigación Tecnología Agraria y Alimentaria [גרנט מספרים RFP2015-00015-00, RTA2014-00085-00, RTA2017-00003-00]; ארמון דה שמאייש — קרן חברתית אירופה, האיחוד האירופי [Grupo Consolidado A12-17R].
Materials
| Precision scale | Sartorius | CP225D | |
| Stereoscopic microscope | Leica Microsystems | MZ-16 | |
| Drying-stove | Memmert | U15 | |
| Paraffin Embedding station | Leica Microsystems | EG1140H | |
| Rotatory microtome | Reichert-Jung | 1130/Biocut | |
| Microtome blade | Feather | S35 | Stainless steel |
| Bright field microscope | Leica Microsystems | DM2500 | |
| Digital Camera | Leica Microsystems | DC-300 | |
| Image Analysis System | Leica Microsystems | Quantiment Q550 |
Riferimenti
- Kurokura, T., Mimida, N., Battey, N. H., Hytönen, T. The regulation of seasonal flowering in the Rosaceae. Journal of Experimental Botany. 64 (14), 4131-4141 (2013).
- Rohde, A., Bhalerao, R. P. Plant dormancy in the perennial context. Trends in Plant Science. 12 (5), 217-223 (2007).
- Fadón, E., Rodrigo, J. Unveiling winter dormancy through empirical experiments. Environmental and Experimental Botany. 152, 28-36 (2018).
- Fadón, E., Rodrigo, J., Herrero, M. Is there a specific stage to rest? Morphological changes in flower primordia in relation to endodormancy in sweet cherry (Prunus avium L.). Trees – Structure and Function. , (2018).
- Fadón, E., Herrero, M., Rodrigo, J. Dormant flower buds actively accumulate starch over winter in sweet cherry. Frontiers in Plant Science. 9 (171), (2018).
- Loescher, W. H., Mccamant, T., Keller, J. D. Carbohydrate reserves, translocation and storage in woody plant roots. HortScience. 25 (3), 274-281 (1990).
- Hedhly, A., et al. Starch turnover and metabolism during flower and early embryo development. Plant Physiology. , (2016).
- Rodrigo, J., Hormaza, J. I., Herrero, M. Ovary starch reserves and flower development in apricot (Prunus armeniaca). Physiologia Plantarum. 108 (1), 35-41 (2000).
- Julian, C., Rodrigo, J., Herrero, M. Stamen development and winter dormancy in apricot (Prunus armeniaca). Annals of Botany. 108 (4), 617-625 (2011).
- Alcaraz, M. L., Hormaza, J. I., Rodrigo, J. Pistil starch reserves at anthesis correlate with final flower fate in avocado (Persea americana). PLoS One. 8 (10), e78467 (2013).
- Smith, A. M., Zeeman, S. C. Quantification of starch in plant tissues. Nature Protocols. 1 (3), 1342-1345 (2006).
- Eliceiri, K. W., et al. Biological Imaging Software Tools. Nature Methods. 9 (7), (2013).
- Rodrigo, J., Herrero, M. Influence of intraovular reserves on ovule fate in apricot (Prunus armeniaca L.). Sexual Plant Reproduction. 11, 86-93 (1998).
- Zhou, J., Spallek, T., Faulkner, C., Robatzek, S. CalloseMeasurer: A novel software solution to measure callose deposition and recognise spreading callose patterns. Plant Methods. 8 (1), (2012).
- Faulkner, C., et al. An automated quantitative image analysis tool for the identification of microtubule patterns in plants. Traffic. 18 (10), 683-693 (2017).
- Kuhn, B. F. Determination of starch in ovules of the sour cherry cv. "Stevnsbaer.". European Journal of Horticultural Science. 71 (3), 120-124 (2006).
- Johansen, D. A. . Plant microtechnique. , (1940).
- Ruzin, S. E. . Plant microtechnique and microscopy. , (1999).
- Rodrigo, J., Rivas, E., Herrero, M. Starch determination in plant tissues using a computerized image analysis system. Physiologia Plantarum. 99 (1), 105-110 (1997).
- Alcaraz, M. L., Hormaza, J. I., Rodrigo, J. Ovary starch reserves and pistil development in avocado (Persea americana). Physiologia Plantarum. 140 (4), 395-404 (2010).
- Suarez, C., Castro, A. J., Rapoport, H. F., Rodriguez-García, M. I. Morphological, histological and ultrastructural changes in the olive pistil during flowering. Sexual Plant Reproduction. 25, 133-146 (2012).
- Lang, G. A., Early, J. D., Martin, G. C., Darnell, R. L. Endodormancy, paradormancy, and ecodormancy – Physiological terminology and classification for dormancy research. HortScience. 22 (3), 371-377 (1987).
- Hedhly, A., Vogler, H., Eichenberger, C., Grossniklaus, U. Whole-mount clearing and staining of arabidopsis flower organs and siliques. Journal of Visualized Experiments. 2018 (134), 1-10 (2018).
- Kaufmann, H., Blanke, M. Changes in carbohydrate levels and relative water content (RWC) to distinguish dormancy phases in sweet cherry. Journal of Plant Physiology. 218 (July), 1-5 (2017).
- Herrero, M., Dickinson, H. G. Pollen-pistil incompatibility in Petunia hybrida: changes in the pistil following compatible and incompatible intraspecific crosses. Journal of Cell Science. 36, 1-18 (1979).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7 (10), R100 (2006).
