Combinando a coloração histoquímicos e análise de imagem para quantificar o amido no ovário Primordia de doce de cereja durante a letargia do inverno

Summary

Apresentamos uma metodologia para quantificar o teor de amido no primordia de ovário em doce de cereja (Prunus avium L.) durante a letargia do inverno por meio de um sistema de análise de imagem combinado com técnicas histoquímicas.

Abstract

Alterações em amido em pequenas estruturas estão associadas com eventos chaves durante vários processos de desenvolvimento da planta, incluindo a fase reprodutiva de polinização, a fecundação e o início da frutificação. No entanto, variações em amido durante a diferenciação de flor não são completamente conhecidas, principalmente devido à dificuldade de quantificar o teor de amido nas estruturas particularmente pequenos do primordia a flor. Aqui, descrevemos um método para a quantificação de amido no primordia de ovário de doce de cereja (Prunus avium L.), usando um sistema de análise de imagem anexado para o microscópio, que permite relativas as alterações no teor de amido com as diferentes fases de dormência do Outono à Primavera. Para essa finalidade, o estado de dormência dos botões florais é determinado pela avaliação o crescimento do broto de brotos transferidos para condições controladas em diferentes momentos no tempo de inverno. Para a quantificação de amido no primordia ovário, botões de flores são sequencialmente coletados, fixo, incorporados em cera de parafina, seccionados e manchados com I₂Kl (iodo-iodeto de potássio). As preparações são observadas ao microscópio e analisadas por um analisador de imagem que claramente distingue o amido do fundo. Valores de conteúdo de amido são obtidos através da medição da densidade óptica da imagem que corresponde com a do amido manchado, considerando a soma da densidade óptica de cada pixel como uma estimativa do teor de amido dos quadro estudado.

Introduction

Plantas perenes lenhosas temperadas adaptar-se às estações da ano, modulando seu crescimento e desenvolvimento. Enquanto eles desenvolvem durante a primavera e o verão, eles param de crescer durante o Outono para ir dormente no inverno¹. Apesar de letargia que lhes permite sobreviver a temperaturas de inverno baixa, refrigeração é um pré-requisito para uma adequada looks na primavera². As implicações importantes de dormência na produção de frutas temperadas e florestas têm levado a diversos esforços para determinar e prever o período de dormência³. Em espécies de árvores de fruto, experimentos empíricos transferir brotos para forçar as condições e previsões estatísticas com base em dados da floração são abordagens atuais para determinar a data da quebra de dormência, o que permite que os pesquisadores estimar o relaxando os requisitos para cada cultivar. No entanto, como determinar o estado de letargia, baseado em processos biológicos permanece incerto³.

Floração em árvores de fruto de clima temperado, como doce de cereja (Prunus avium L.), ocorre uma vez por ano e dura cerca de duas semanas. No entanto, as flores começam a diferenciar e desenvolver cerca de 10 meses antes, durante o verão anterior⁴. Primordia flor param de crescer durante o Outono para permanecer dormente dentro os botões durante o inverno. Neste período, cada cultivar precisa acumular um determinado requisito arrepiante para adequada floração⁴. Apesar da falta de mudanças fenológicas nos botões durante o inverno, primordia flor é fisiologicamente ativa durante a dormência, e a acumulação de temperaturas de refrigeração foi recentemente associada com a dinâmica da acumulação de amido ou diminuir dentro das células do primórdio ovário, oferecendo uma nova abordagem para determinação de letargia⁵. No entanto, o pequeno tamanho e a localização do primórdio ovário requerem uma metodologia especial.

O amido é o carboidrato de armazenamento principal em espécie de planta lenhosa⁶. Assim, alterações em amido têm sido relacionadas à atividade fisiológica dos tecidos da flor, que precisa de carboidratos para apoiar o seu desenvolvimento^7,8. Diferentes eventos-chave durante o processo reprodutivo também estão relacionados às variações no teor de amido em diferentes estruturas florais, como antera meiose⁹, o crescimento dos tubos de pólen através do estilo ou óvulo fecundação¹⁰. Histochemical técnicas permitem a detecção de amido em cada tecido específico do primordia flor durante a dormência. No entanto, a dificuldade permanece em quantificar esse amido para permitir que conteúdo entre os tecidos, cultivares ou anos seguindo seu padrão de acumulação/diminuir ao longo do tempo ou comparar o amido. Isto é devido à pequena quantidade de tecido disponível para as técnicas analíticas de¹¹. Como alternativa, análise de imagem ligada à microscopia¹² permite a quantificação do amido em muito pequenas amostras de tecido de planta¹³.

Abordagens combinando análise de microscopia e imagem têm sido utilizadas para quantificar o conteúdo dos diferentes componentes nos tecidos da planta, tais como callose¹⁴, microtubos¹⁵, ou¹⁶, medindo-se o tamanho da área tingida por específicos de amido manchas. Para o amido, pode ser facilmente detectada usando o iodo-iodeto de potássio (eu₂KI) reação¹⁷. Este método é altamente específico; Eu₂KI intercala dentro da estrutura laminar de grãos de amido e dá forma a uma cor azul escuro ou marrom-avermelhada, dependendo do conteúdo de amilose do amido¹⁸. Seções manchadas com I₂mancha KI mostrar o contraste adequado entre o amido e o tecido de fundo, permitindo uma deteção de amido inequívoca e posterior quantificação pelo de sistema de análise de imagem¹⁹. Embora este corante não é estequiométrica, o acúmulo de iodo é proporcional ao comprimento da molécula de amido, que altamente pode variar de¹⁷. Assim, o tamanho da área manchada, expressado como o número de pixels pode não refletir com precisão o teor de amido, desde altas diferenças no teor de amido podem ser encontradas entre os campos com áreas manchadas de tamanho similar. Como alternativa, o teor de amido pode ser avaliado através da medição da densidade óptica dos grânulos corados em preto e brancos imagens obtidas com o microscópio, como tem sido relatado em diferentes tecidos em Damasco^{8,13 , 19}, abacate^10,20e²¹de azeitona.

Aqui, descrevemos uma metodologia que combina a determinação experimental do estatuto de dormência com a quantificação do teor de amido no tecido do ovário Primórdio de Outono à Primavera em doce de cereja, oferecendo uma nova ferramenta para a compreensão e predição de dormência, baseada no estudo dos mecanismos biológicos ligados com letargia.

Protocol

1. dormência determinação e planta coleta de Material Os botões da flor no campo da amostra. Estudos de dormência são experiências a longo prazo e requerem adulto árvores grande o suficiente para coletar os botões e dispara todo o inverno sem comprometer o desenvolvimento das árvores durante a próxima primavera. Gestão de pomar especial pode ser necessária, dependendo do sistema de formação; assim, a poda pode ser menos grave do que para fins de produção de frutas. Cada semana, desde o …

Representative Results

Estudos de letargia exigem a determinação do momento quando forem satisfeitos os requisitos de refrigeração. Apesar da falta de mudanças fenológicas durante o inverno sob condições de campo (figura 1A), árvores de cereja não recuperar a capacidade de crescimento em condições adequadas até eles passam um determinado período sob baixas temperaturas. A transferência regular dos rebentos de uma câmara de condições controladas (<strong class="xfi…

Discussion

Dormência em plantas perenes lenhosas apresenta claras implicações na produção de frutas e florestais em mudanças climáticas, embora o processo biológico por trás de dormência permanece obscuro. Estudos de dormência podem ser abordados de diferentes pontos de vista, mas a pesquisa à procura de um marcador biológico para a letargia do inverno tem se intensificado nos últimos anos. No entanto, a maioria das tentativas de encontrar um inequívoco indicador mostrando quando um botão está quebrado letargia tem…

Materials

Precision scale	Sartorius	CP225D
Stereoscopic microscope	Leica Microsystems	MZ-16
Drying-stove	Memmert	U15
Paraffin Embedding station	Leica Microsystems	EG1140H
Rotatory microtome	Reichert-Jung	1130/Biocut
Microtome blade	Feather	S35	Stainless steel
Bright field microscope	Leica Microsystems	DM2500
Digital Camera	Leica Microsystems	DC-300
Image Analysis System	Leica Microsystems	Quantiment Q550