Summary
Her præsenterer vi en time-lapse morfometrisk protokol for at følge intensiteten af blastocyst svind og re-udvidelse under previtrification interventioner og efter opvarmning opsving. Anvendelsen af protokollen er muligt i in vitro- befrugtning laboratorier udstyret med time-lapse mikroskoper og anbefales i udviklingen af en optimal blastocyst vitrifikation metode.
Abstract
I denne artikel beskrives metoden noninvasive af blastocyst morfometri baseret på time-lapse microphotography for nøjagtig overvågning af en blastocyst volumen ændre under enkelte faser før og efter vitrifikation. Metoden kan være nyttige i at søge efter den mest optimale timing af blastocyst eksponering for forskellige koncentrationer af cryoprotectants ved at observere blastocyst svind og re-ekspansion i forskellige pre og post vitrifikation faser. Med denne metode, kan blastocyst vitrifikation protokol optimeres. For et bedre bevis på nytten af denne morfometrisk metode sammenlignes to forskellige blastocyst forberedelse protokoller for forglasning; én med ved hjælp af en kunstig blastocoel kollapse og én uden denne intervention før vitrifikation. Både blastocyster volumen forandringer er efterfulgt af time-lapse microphotography og målt af fotoredigering softwareværktøjer. Målingerne er taget hver 20 sekunder i previtrification faser, og hver 5 minutter i perioden efter opvarmning. Ændringer af dimensionerne blastocyst pr. tidsenhed præsenteres grafisk i linje diagrammer. Resultaterne viser en lang ækvilibrering previtrification fase hvor intakt blastocyst først krymper og derefter langsomt påfyldninger blastocoel, indtastning vitrifikation med et væskefyldt blastocoel. Kunstigt kollapsede blastocyst forbliver i sin indskrumpet fase gennem hele ækvilibrering fase. Fasen vitrifikation ændrer det også ikke dens volumen. Da blastocyst morfometri viser et konstant volumen af de kunstigt kollapsede blastocyster under trinnet previtrification, synes det, at denne fase kunne være kortere. Den beskrevne protokol indeholder mange ekstra sammenlignende parametre af blastocyst adfærd under og efter kryopræservering på grundlag af den hastighed og intensitet af volumen ændringer, antallet af delvise blastocoel sammentrækninger eller samlede blastocyst kollapser, og tid til en total blastocoel re-udvidelse eller tid til at ruge.
Introduction
Kryopræservering af præimplantations menneskefostre fra in vitro- befrugtning programmet (IVF) er i dag en rutinemæssig praksis i de fleste IVF laboratorier. Langsom embryoet nedfrysning metode begyndte at være klinisk bruges i 1985, med indførelsen af særlige cryoprotectants og computer-kontrollerede frysere, som aktiveret de kontrolleret afkøling af embryoner ned til-7 ° C, når isen Nukleering (såning) blev induceret i den omkringliggende cryoprotective medium1. Ved kontinuerlig køling, iskrystallerne ville vokse, forårsager hyperosmolality af den resterende flydende fraktion og dermed dehydrering og svind af embryonale celler. På 30 ° C eller-80 ° C, embryoner vil blive kastet ud i de flydende kvælstof til længere opbevaring. Hvad der skete med embryoner eller oocyter under afkøling kunne overholdes kun af specielt tilpasset cryomicroscopes, som bidrog til at forbedre kryopræservering protokoller2. Indefrysning af blastocyster, en højere volumen og mere væske-indeholdt embryonale fase, gav mindre lovende kliniske resultater i disse dage3.
Gennembrud i kryopræservering af blastocyst var indførelsen af metoden vitrifikation, hvor dehydrering af cellerne fandt sted inden køling ved hjælp af høje koncentrationer af cryoprotectants4. Fjernelse af væske fra blastocoel før vitrifikation kan også opnås ved at gøre en mekanisk åbning mellem to trophectoderm celler5. Selv om den umiddelbare blastocyst overlevelsesrate efter vitrifikation og opvarmning er over 90%, og de kliniske resultater efter er overførsel af forglasset/varmet blastocyst i livmoderhulen næsten sammenlignes med resultater efter overførsel af frisk embryoner, kryopræservering metoden er endnu ikke blevet standardiseret6,7. Vitrifikation protokoller varierer efter a type og koncentration af cryoprotectants, (b) antallet af trin, previtrification, (c) varigheden af enkelte trin, (d) anvendelse af en kunstig blastocoel kollapse før vitrifikation eller ej, (e). kollapse metoder, (f) blastocyst ekspansion fase og (g) ækvilibrering/vitrifikation temperatur på som embryonerne skal være forglasset8. Da cryoprotectants kan være giftigt for celler, må blastocyst eksponeringstid til disse løsninger være veldefinerede. Men nogle kryopræservering medier producenter tillade meget fleksibel protokoller.
Interesse af forskere er normalt fokuseret på at studere blastocyst re-ekspansion evne med henblik på at finde nye biomarkører med en bedre forudsigelse af implantation6,9,10. Hvordan menneskelige blastocyster dehydrere på forskellige trin for at tilføje cryoprotectants før vitrifikation og hvad sker der med blastocyster efter vitrifikation og opvarmning, når cryoprotectants har at blive fjernet fra cellerne, og hvordan blastocyster rehydrere og re-udvide efter opvarmning, er ikke godt beskrevet eller forstået. Udvikling af en metodologi til målet og kvantificerede overvågning af blastocyst opførsel under forskellige kryopræservering trin er således rationale.
Med time-lapse mikroskoper af forskellige producenter er det nu muligt at overvåge adfærd i blastocyst i pre og post vitrifikation faser. Ved at inkludere yderligere edb-værktøjer, kan der også udføres målinger af deres størrelse (morfometri). Ved måling af fald eller en stigning i embryo størrelse på et givet tidspunkt, er det muligt at objektivere evaluering af morphodynamics af embryoner under dehydrering og rehydrering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder beskrevet her er blevet godkendt af den nationale medicinske etiske komité på 19 April 2016 (No. 0120-204/2016-2).
1. opsætning af mikroskop optagelse System
- Slukke den varme plade af mikroskopet.
- Før nogen behandling, tage et snapshot af en blastocyst under en kamera-udstyret inverteret mikroskop. Husk at bemærke den forstørrelse, hvormed blastocyst blev indspillet.
2. udvælgelse og Prepreparation af blastocyster for forglasning
- Vælg kun fuldt udbygget dag-5 eller dag-6 blastocyster for kryopræservering med mindst et par indre celle masse (ICM) celler og sammenhængende trophectoderm.
- For laser-behandlede blastocyster med en skjult blastocoel, emne en blastocyst til en kort laser puls (0,4 - 0,7 ms) med en huldiameter spænder fra 4,3 til 9,4 µm, tangentielt instrueret på zona pellucida og et knudepunkt for to tilstødende trophectodermal celler. Tillad blastocyst til helt eller delvist sammenbrud i 5 min.
- Ubehandlet blastocyster med en intakt blastocoel, udføre nogen særlig behandling inden vitrifikation.
Bemærk: Disse blastocyster betragtes intakt.
3. forberedelse af kryoprotektant og en petriskål for ækvilibrering fase
- Brug pithe pipette for oocyt denudation (diameter 135 µm) til aseptisk fylde ækvilibrering media (M-199 HEPES-buffered medium med 7,5% DMSO, 7,5% ethylenglycol, 20% DSS) i hullerne i området microdroplet i en 9-godt petriskål specielt designet til time-lapse mikroskopi og optagelse.
Bemærk: Oocyt denudation er en proces med at fjerne cumulus celler omkring oocyt. Brug af en pipette til oocyt denudation vil bidrage til at undgå oprettelsen af luftbobler. - Overlay området microdroplet med 30 µL af ækvilibrering medier.
4. overførsel af Blastocyst i ækvilibrering løsning
- Nedsænkes en laser-behandlet eller intakt blastocyst i ækvilibrering medium til bunden af microdroplet inden for microdroplet skålen i 10 min. ved stuetemperatur (ækvilibrering fase).
- Starte en 10-min nedtælling, så snart blastocyst er overført til ækvilibrering medium.
5. registrering af Blastocyst på ækvilibrering fase
- Overfør microdroplet skål med blastocyst til et kamera-udstyret mikroskop. Bruge samme forstørrelse som tidligere for at tage et øjebliksbillede af den samme blastocyst. Position i microdroplet parabol så at blastocyst er placeret cirka i midten af optagelsen.
- Starte optagelsen med mikroskop optagelse software. Bemærk den nedtællingstid hvor optagelsen startes.
Bemærk: Se repræsentative resultater af optagelser af en intakt (figur 1, Video 1) og en skjult blastocyst (figur 2, Video 2) under 10-min eksponering til en ækvilibrering løsning.
6. forglasning af Blastocyst
- Aseptisk undvære en 50 µL dråbe vitrifikation løsning (M-199 HEPES-buffered medium med 15% DMSO, 15% ethylenglycol, 20% DSS, 0,5 M saccharose) i en petriskål 2 min før nedtællingen slutter.
- Stoppe optagelsen når 10-min nedtællingen slutter og hurtigt overføre blastocyst til forglasning løsning til 30 s ved stuetemperatur.
- Forsigtigt afpipetteres blastocyst mindst 1 x inden for forglasning løsning.
- Bruge en vitrifikation halm til lastning blastocyst. Indlæse, forsegle og styrte forglasning halm i flydende kvælstof (LN) inden for 80 s, ikke overskrider 110 s efter den første eksponering til forglasning løsning.
7. video redigering af indspillede Blastocyst fasen ækvilibrering
- Importere en indspillet video fil til video redigeringssoftware.
- Flyt skyderen tidslinjen til 20 s. Note stelnummeret på dette tidspunkt.
Bemærk: Dette tal vil blive brugt til decimere unødvendige videobilleder. Kun rammer hver 20 s vil blive brugt. - Klik på fanen Video , derefter framerate.... Under indramme sats omdannelse, Kontroller Decimate af feltet og Angiv tidligere bemærket stelnummeret. Bekræft ved at klikke på OK. Klik på filer → Eksporter → billedsekvens.
- Vælge JPEG som outputformat, sætte mappe til at holde den gemte sekvens af billeder, og klik på OK.
Bemærk: Dette vil oprette en mappe med op til 30 billeder af indspillede blastocyst i sekvens i vitrifikation ækvilibrering fase.
8. målinger af den Blastocyst tværsnitsareal fra billeder skabt fasen ækvilibrering
- Åbn video analyse software. Klik på fanen vindue og vælg tidslinje.
- I ruden tidslinje skal du klikke på tegnet film strip og vælge Tilføj medier... til at føje et billede af blastocyst før ækvilibrering fase af vitrifikation — og før laser indgreb, hvis der var nogen.
Bemærk: Dette billede vil vise blastocyst på den mest udvidede tilstand og dens tværsnitsareal vil tjene som en reference. - Tilføje billedsekvens af tilsvarende blastocyst genereret tidligere med video redigeringssoftware (af ækvilibrering fase af vitrifikation).
- Gå til Image → analyse → Vælg datapunkter → Brugerdefineret for at åbne vinduet Vælg datapunkter .
- Fravælg alle datapunkter, så vælg kun område, og Bekræft ved at klikke på OK.
- Flyt skyderen tidslinjen i vinduet tidslinjen til det første billede.
- Klik på fanen vindue og vælg værktøjer.
Bemærk: Dette vil aktivere panelet værktøjer på venstre side. - Vælg værktøjet hurtig markering.
- Placer værktøjet markør inde blastocyst at røre ved kanten af blastocyst. Skitsere blastocyst ved at placere værktøjet markør på den blastocyst yderkant, klikke på og holde venstre museknap og trække værktøjet markør langs den blastocyst ydre kant indtil hele blastocyst tværsnitsareal er valgt.
Bemærk: Zona pellucida er ikke en del af målingen, så det skal være udelukket (figur 5). - Klik på Målingsloggen i vinduet tidslinjen, og tryk på knappen Indspil målinger .
Bemærk: Dette vil optage det markerede område. - Vende tilbage til tidslinjen, Højreklik på billedet og vælge Fravælg.
- Flyt skyderen tidslinjen til det næste billede og klik på den tilsvarende flise under den.
- Skitsere blastocyst i det nye billede med værktøjet hurtig markering. Gentag målingen.
- Gentag denne procedure (trin 8,9-8.13) billede ved billede, indtil alle billeder tværsnitsareal måles og registreres.
- I sidste ende gå til målinger Log, Vælg alle målinger under variablen område , og eksportere dem i en .txt-fil.
Bemærk: Enheder af tværsnitsareal er kvadratiske pixel.
9. redigering af datafilen med den registrerede Blastocyst tværsnitsareal fra billeder lavet fasen ækvilibrering
- Overføre data fra den registrerede blastocyst tværsnitsareal fra .txt-filen til et regneark editor.
- Bruge den første tværsnitsareal-værdi som reference 1 og express (transform) der alle andre værdier, at være en brøkdel af denne referenceværdi.
- Opret en ny variabel Area_r og indsætte omkodet området værdier (undtagen referenceværdi) under det.
- Ved siden af variablen Area_r oprette en gang variabel og tilføje den første gang værdi.
Bemærk: Første gang værdien repræsenterer den tid, der gik fra det øjeblik blastocyst blev udsat til ækvilibrering løsning til udbrud af optagelsen under et mikroskop for kamera-udstyret. - Beregne hver næste gang i træk værdi ved at tilføje 20 s til den forrige værdi.
Bemærk: Dette er det tidsinterval, der er brugt på decimering unødvendige videobilleder oprettet under optagelsen.
10. opvarmning af Blastocyst
- Forberede medier til opvarmning.
- En dag før opvarmning blastocyst, dispensere aseptisk tre 150 µL dråber opsving medium i en 4-godt parabol. Også, aseptisk dispensere opsving medium i en microdroplet 9-godt parabol specielt designet for time-lapse mikroskopi og optagelse. Dække opsving medium med paraffinolie og preincubate det ved 37 ° C med 6% CO2 og 5% O2.
Bemærk: Recovery medium er en dyrkning medium til blastocyststadiet embryoner med tilføjet human serum albumin (HSA). HSA i recovery medium skal være 12 mg/mL. At udfylde hullerne i 9-godt parabol, bruge en pipette for oocyt denudation for at undgå oprettelsen af luftbobler, så overlay området microdroplet med 30 µL af recovery medium. - På dagen for opvarmning blastocyst, aseptisk undvære 500 µL af optøning løsning (TS) i et enkelt godt af en 4-godt skål og lad det varme til 37 ° C i en inkubator uden CO2.
- Ved stuetemperatur, aseptisk undvære en 50 µL dråbe fortynding løsning (DS) og to 50 µL dråber vask løsning (WS) i en steril petriskål. Dække DS og WS1 og WS2 dråberne med paraffinolie.
Bemærk: I stedet for en petriskål, en 4-godt parabol kan også bruges.
- En dag før opvarmning blastocyst, dispensere aseptisk tre 150 µL dråber opsving medium i en 4-godt parabol. Også, aseptisk dispensere opsving medium i en microdroplet 9-godt parabol specielt designet for time-lapse mikroskopi og optagelse. Dække opsving medium med paraffinolie og preincubate det ved 37 ° C med 6% CO2 og 5% O2.
- Varm blastocyst.
- Identificere HSV strå med forglasset blastocyst fjernes fra LN opbevaring og hurtigt overføre halmen til en LN-fyldt bærbare reservoir i forberedelse til den opvarmning procedure.
- Løfte halmen med pincet, lige nok til at udsætte den farvede håndtering stang. Brug en selvjusterende wire stripper til at skære strået på højden af den farvede håndtering stang.
- Grab håndtering stang og uddrag den fra halm med en hurtig, men kontrolleret bevægelse, og straks styrte den buede spatel af håndtering stangen i den 37 ° C TS.
- Forsigtigt swirl håndtering stang for at frigøre blastocyst og overlade det til en samlet beløb på 1 min i TS.
- Ved stuetemperatur, overføre blastocyst fortløbende til DS, WS1 og WS2 i 4 min i hvert medium.
- Efter opvarmning proceduren, overføre blastocyst til en 4-godt parabol med recovery medium og vaske det i alle tre dråber af forsigtigt pipettering det.
Bemærk: Vask udføres i ca 1 min. - Overføre blastocyst til time-lapse 9-godt fadet med recovery medium. Placer 9-godt parabol under en time-lapse kamera i en inkubator (ved 37 ° C med 6% CO2 og 5% O2).
Bemærk: Thre opvarmning procedure, som fortsætter med at placere 9-godt parabol under en time-lapse kamera i en inkubator, varer ca 17 min.
11. time-lapse optagelse af en Blastocyst Re-udvidelse under opsving efter opvarmning
- Køre time-lapse optagelse software.
- Vælg en optagelse kamera.
- Tryk på knappen Live mode .
- Placer musemarkøren på billedet og bruge rulleknappen til at forstørre det. Klik og hold venstre museknap nede og flytte markøren til at placere godt med blastocyst i midten af skærmen.
- Under fokusering, brug op-ned grønne pile for at fokusere optagelse plan blastocyst. Under lysintensitet, indstille lysintensiteten.
- Klik på knappen mikroskop parametre at indstille eksponering og Gamma.
- Tryk på Luk live-mode.
- Tryk på knappen Start projekt og angive projektdata, Vælg typen kultur parabol (3 x 3 eller 4 x 4) og uncheck alle positioner undtagen den skal registreres.
- Sæt capture timing til at tage et billede hvert 5 min.
- Starte optagelsen ved at trykke på knappen Godkend . Optage mindst 150 min.
- Stoppe optagelsen ved at trykke på knappen Stop projekt .
Bemærk: Se de repræsentative resultater af optagelse af en intakt (figur 3) og en skjult blastocyst (figur 4) opsving i perioden efter opvarmning.
12. video redigering af indspillede Blastocyst under Re-udvidelse efter opvarmning
- Gå til mappen projekt og Find optagede billeder, der er omtrent 80 KB i størrelse.
- Opret en anden mappe og overføre disse billeder til det. Omdøbe billeder i tal efter den tid, der er oprettet. Importere dem til den video redigeringssoftware som en billedsekvens.
- Gå til Video fanen → Filter → Tilføj og vælg Null transform filter.
- Klik på knappen beskæring på højre side og beskære billedet, så synlige kun feltet med den registrerede blastocyst. Bekræfte med OK og igen med OK.
- Klik på filer → Eksporter → billedsekvens. Vælge JPEG som outputformat, sætte mappe til at holde den gemte sekvens af billeder, og klik på OK.
Bemærk: Dette vil skabe mellemstore (beskåret) billeder parat til yderligere målinger i video analyse software.
13. fastsættelse af en måleskala i Video analyse Software til billeder skabt med Time-lapse optagelse Software
- Køre Analyzer time-lapse optagelse software.
- Åbn projektet med de registrerede blastocyst.
- Klik på knappen analyser på feltet med den registrerede blastocyst.
Bemærk: Et nyt Analyze vindue vil åbne. Klik på knappen måling vise måleværktøjet. - Bruge måleværktøjet til at måle bredden på hele billedet.
- Højreklik på billedet og Gem den. I egenskaber, skal du kontrollere billedets bredde i pixels.
- Opdele den faktiske billedbredde med dens bredde i pixels.
Bemærk: Dette beregner den faktiske længde af en enkelt pixel i billedet. - Kør video analyse software.
- Klik på fanen vindue og vælg tidslinje.
- I ruden tidslinje skal du klikke på tegnet film strip og vælge Tilføj medier... tilføje billedsekvens af post varm igen ekspanderende blastocyst.
- Klik billedet → analyse → Indstil måleskala → Brugerdefineret til at åbne vinduet måleskala. For Pixel længde, indtaste 1; for logisk længde, Angiv den tidligere beregnede faktiske længde af en pixel (trin 13,6); Logiske enheder, Angiv µm. Gem forudindstillingen.
14. måling af den Blastocyst tværsnitsareal fra billeder oprettet under Re-udvidelse efter opvarmning
- Når måleskalaen er sæt og billedsekvens importeret, måle den blastocyst tværsnits områder på samme måde som beskrevet i trin 8, med den eneste forskel er, at de målte tværsnitsareal i disse målinger har enheder i µm2 .
15. redigering af datafilen med den registrerede Blastocyst tværsnitsareal fra billeder oprettet under Re-udvidelse efter opvarmning
- Overføre data fra den registrerede blastocyst tværsnitsareal fra .txt-filen til et regneark editor.
- Oprette en gang variabel ved siden af variablen område og tilføje den første gang værdi.
Bemærk: I dette tilfælde den første tid indstilles til 0 minutter, der er udbrud af time-lapse optagelsen. Hver næste gang i træk værdien beregnes ved at tilføje 5 minutter til den forrige værdi. Fem minutter er det tidsinterval, der bruges mellem to på hinanden følgende time-lapse optagelser.
16. oprettelse af en linje Diagram
- Import filen regneark data i statistiske analyse software til at skabe en gang plot af den blastocyst tværsnitsareal ændringer i gang i vitrifikation eller re-udvidelse efterfølgende opvarmning ækvilibrering fase.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I en demonstration viste vi blastocyst morphodynamics i kun én previtrification og én post opvarmning fase. En forskel i den blastocyst volumen i slutningen af ækvilibrering fase og begyndelsen af inddrive dyrkningsmedium viste intensiteten af embryo svind, som faktisk, intensiteten af embryo bevarelse mod isen krystallisering.
Som det kan blive bemærket fra figur 1 og Video 1, intakt blastocyst ikke kollapse fuldstændigt i ækvilibrering løsning. Blastocoel indgået kun delvist, men inden for 10 minutter, det nået langsomt re-ekspansion størrelsen på 70%. Dette, kunstigt kollapsede blastocyst tømt helt blastocoel straks efter laserbehandling, men i ækvilibrering løsning, dens volumen ændre ikke nogen mere (figur 2, Video 2). Præsentation af blastocoel re-ekspansion i recovery medium (figur 3 og figur 4) med microphotographs og med linje diagrammer viser forskellige mønstre af blastocoel vækst. En visning af en enkelt måling af tværsnitsareal af blastocyst er vist i figur 5.
I vitrifikation medium med en højere koncentration af cryoprotectants, intakt blastocyster intensivt skrumpet ind igen, mens den kollapsede blastocyst mængden forblev næsten uændret. Fra en grafisk præsentation, ved hjælp af protokollen præsenteres her, det er indlysende, at de intakte blastocyst gennemgår en gradvis reduktion af blastocoel (figur 6), en gang i ækvilibrering løsning og en gang i vitrifikation medium, mens den kollapsede blastocyst nået en indskrumpet fase i begyndelsen af interventionen med en laser (figur 7). Dette rejser spørgsmålet om 10 minutter af ækvilibrering fase er virkelig nødvendigt for kollapsede blastocyster, eller om denne frist kan afkortes.
Præsentation af blastocoel re-udvidelse kan være lineært eller afbrudt med flere større eller mindre sammentrækninger (figur 8).
Figur 1: Time-lapse microphotography af ændringer af en intakt blastocyst under eksponering til ækvilibrering løsning. Enkelt billeder blev registreret hver 20 sekunder. Skalalinjen er 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Time-lapse microphotography af ændringer af et kunstigt kollapsede blastocyst under eksponering til ækvilibrering løsning. Enkelt billeder blev registreret hver 20 sekunder. Skalalinjen er 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Time-lapse microphotography af ændringer af en intakt blastocyst under recoverypost-opvarmning. Enkelt billeder blev registreret hvert 5 minut. Skalalinjen er 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Time-lapse microphotography af ændringer af en sammenstyrtet blastocyst under recoverypost-opvarmning. Enkelt billeder blev registreret hvert 5 minut. Skalalinjen er 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: visning af en enkelt måling af tværsnitsareal af en blastocyst. Blastocyst er omhyggeligt omkranset med det relevante markeringsværktøj i video analyse software. Zona pellucida er altid udelukkes fra målingen. Skalalinjen er 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: repræsentation af ændringer i tværsnitsareal af en intakt blastocyst. Disse paneler Vis repræsentation af ændringer i tværsnitsareal af en intakt blastocyst under eksponering til ækvilibrering løsning (A) på forglasning og (B) under opsving efter opvarmning. Enheder af tværsnitsareal er i forhold til den oprindelige blastocyst tværsnitsareal før vitrifikation. Den stiplede linje, der forbinder paneler A og B er indbildt, der repræsenterer ændringerne under vitrifikation, køling til-196 ° C, og opvarmning til 37 ° C. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: repræsentation af ændringer i tværsnitsareal af en sammenstyrtet blastocyst. Disse paneler Vis repræsentation af ændringer i tværsnitsareal af (A) en skjult blastocyst under eksponering til ækvilibrering løsning (B) på forglasning og (C) under opsving efter opvarmning. Enheder af tværsnitsareal er i forhold til den oprindelige blastocyst tværsnitsareal før kollapse og vitrifikation. Den stiplede linje på panelet A er imaginære og repræsenterer de start- og slutdatoer punkt under blastocyst sammenbrud. Også repræsenterer den imaginære stiplet linje mellem paneler B og C, ændringerne under vitrifikation, køling til-196 ° C, og opvarmning til 37 ° C. Kun de ubrudte linjer i paneler B og C er resultatet af faktiske målinger af tværsnitsareal under ækvilibrering og recovery proces. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: grafisk præsentation af forskellige mønstre af blastocyst opsving efter opvarmning. Skalalinjen er 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Video 1: Time-lapse video af ændringer af en intakt blastocyst under eksponering til ækvilibrering løsning. Videoen repræsenterer de ændringer, som vare næsten 10 minutter i realtid. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)
Video 2: Time-lapse video af ændringer af en sammenstyrtet blastocyst under eksponering til ækvilibrering løsning. Videoen repræsenterer de ændringer, som vare næsten 10 minutter i realtid. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokol for observation af blastocyst morphodynamics under og efter kryopræservering kan også foretages ved hjælp af lignende instrumenter og softwareværktøjer fra andre producenter. Time-lapse systemer justeret for embryologi giver mulighed for løbende overvågning af embryo udvikling. Formålet med dette arbejde var at indføre kvantificering af blastocyst adfærd i forbindelse med udarbejdelsen af blastocyster for forglasning og efter deres opvarmning. Dette blev gjort ved den objektive måling af ændringer i morfologi på en tidsskala. Resultaterne af disse målinger kan være matematisk analyseret og sammenlignet med andre resultater. Blandt de parametre, der kan følges op af den beskrevne protokol er ændringer i størrelsen af blastocyst, dets indre cellemasse, blastocoel eller zona pellucida inden for en bestemt periode. Størrelsen kan vises som areal i den største blastocyst tværsnit, blastocyst omkreds eller diameter, og efter beregning, selv som dens volumen.
I tidligere undersøgelser ved hjælp af time-lapse systemer, er blastocoel ekspansion velocity målingerne foretaget kun på friske embryoner11. I forglasset/varmet blastocyster, kun blastocyster størrelser blev målt umiddelbart efter opvarmning og før ægoplægningen, eller perioden blev analyseret som varmede blastocyster igen udvidet til zona pellucida9,10 . Mere detaljerede blastocyst re-ekspansion dynamics blev analyseret kun i vores tidligere undersøgelse8. I denne undersøgelse, er morfometrisk protokollen allerede blevet brugt til at spore den hastighed og mønster af blastocyst re-udvidelser efter opvarmning. Selvom disse blastocyst vækst biomarkører har vist sig ikke for at have en høj prædiktiv værdi for implantation, kan de bruges til sammenligning af blastocyst opsving potentielle efter vitrifikation og opvarmning med forskellige kryopræservering medier og protokoller . Nemlig, de større sammentrækninger af blastocyst under blastocoel re-udvidelsen foreslå svagheden i det trophectodermal lag, der kunne være forårsaget under kryopræservering, og dens evne til at modstå presset fra den væskefyldte blastocoel.
Beskrevet morfometrisk protokol kan give mange flere sammenlignende analyser af blastocyst adfærd, ikke kun efter kryopræservering, ved at måle den hastighed og intensitet af ændringer i volumen, antallet af delvise blastocoel sammentrækninger eller alt blastocyst kollapser, tid til samlede blastocoel re-ekspansion, eller tid til at ruge. Det kan desuden også bruges i previtrification faser til at bestemme den mest optimale timing af blastocyst eksponering for forskellige koncentrationer af cryoprotectants, som blev præsenteret i resultaterne. Vanderzwalmen et al. viste på mus oocyter at vitrifikation også kan lykkes, hvis intracellulære osmotiske tryk ikke kan nå en ligevægt med eksterne kryoprotektant løsning12. Den eneste problematiske fase for optagelse af blastocyster under bevarelse er perioden i vitrifikation løsning på grund af begrænset tid; fosteret har at blive udsat for en højere koncentration af cryoprotectants og pakket ind i strå i mindre end 90 sekunder. Disse målinger vil det anbefales at bruge kun blastocyster, der er doneret til forskning. Ikke desto mindre kan klinisk tilgængelige blastocyster være optagede og målte igen umiddelbart efter opvarmning, med formålet at iagttage hvordan de opfører sig i fortynding og vask løsninger. Umiddelbart efter en blastocyst overførsel fra vask løsning til nyttiggørelse medium, blastocyster har tendens til at flyde ned i bunden. Dette kan udgøre et problem i at holde fosteret i det samme brændplanet under optagelsen. For at løse dette problem, anbefales det at udarbejde en ret med fladtrykt dråber af medium. Et lignende problem er blevet observeret af Vanderzwalmen et al. 12.
I yderligere forskning, ville det være nyttigt at undersøge, om længden af eksponeringen for kunstigt kollapsede blastocyster til cryoprotectants kunne reduceres, derfor minimere den giftige virkning af disse kemikalier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde er en del af programmet P3-0327 og forskning forskningsprojekt J3-7177, grundlagt af slovenske Research Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted microscope Eclipse TE2000-U | Nikon, Japan | / | |
| Saturn 5 Laser System | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Digital camera DC1 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Digital camera DC2 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | |
| Cronus 3.7 | Research Instruments, Origio, Denmark | / | microscope recording software |
| Incubator with 6% CO2, 5% O2 | Binder, Germany | / | |
| Primo Vision microscope | Vitrolife, Sweden | 16600 | |
| Primo Vision Capture software | Vitrolife, Sweden | 16608 | time-lapse recording software |
| Adobe Photoshop CS6 Extended software | Adobe Systems Incorporated, USA | / | video analysis software |
| VirtualDub | Avery Lee | / | video editing software |
| Microsoft Office Excell | Microsoft, USA | / | spreadsheet editor |
| PrimoVision culture dish | Vitrolife, Sweden | 16604 | |
| G2-plus medium | Vitrolife, Sweden | 10132 | cultivation medium for blastocyst stage embryos |
| Human Serum Albumins | Vitrolife, Sweden | 10064 | |
| Paraffin oil | Vitrolife, Sweden | 10029 | |
| Equilibration solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90131 | |
| Vitrification solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90132 | |
| Thawing solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90134 | |
| Dilution solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90135 | |
| Washing solution medium | Irvine Scientific, Ireland | 90136 | |
| HSV Vitrification straws | CryoBio System, France | 025246, 025249, 025250, 025248 | |
| Liquid nitrogen | / | ||
| Cryo vessel Biosafe 120 MD β | Cryotherm, Germany | 229286 | |
| Cryo tank | Cryotherm, Germany | ||
| Forceps | / | / | |
| Scisors | / | / | |
| Pippete for blastocyst manipulation | Gynetics, Belgium | ID275/10 | diameter 275 µm |
| Pipette for oocyte denudation | Vitromed, Germany | V-DEN-135 | diameter 135 µm |
| Pipettor EZ-Grip | Research Instruments | 7-72-2802 | |
| Digital interval timer Assistent | Glaswarenfabrik Karl Hecht | 41977010 | |
| IBM SPSS Statistics 21 | IBM, USA | / | statistical analysis software |
| Self adjusting wire stripper | Knipex, Germany | 1262180 |
References
- Trounson, A., Mohr, L. Human pregnancy following cryopreservation, thawing and transfer of an eight-cell embryo. Nature. 305 (5936), 707-709 (1983).
- Leibo, S. P., McGrath, J. J., Cravalho, E. G. Microscopic observation of intracellular ice formation in unfertilized mouse ova as a function of cooling rate. Cryobiology. 15 (3), 257-271 (1978).
- Cohen, J., et al. Birth after replacement of hatching blastocyst cryopreserved at expanded blastocyst stage. Lancet. 1 (8429), 647 (1985).
- Yokota, I., Sato, S., Yokota, H., Araki, Y. Birth of a healthy baby following vitrification of human blastocysts. Fertility Sterility. 75 (5), 1027-1029 (2001).
- Vanderzwalmen, P., et al. Births after vitrification at morula and blastocyst stages: effect of artificial reduction of the blastocoelic cavity before vitrification. Human Reproduction. 17 (3), 744-751 (2002).
- Kovačič, B., Taborin, M., Vlaisavljević, V. Artificial blastocoel collapse of human blastocysts before vitrification and its effect on re-expansion after warming - a prospective observational study using time-lapse microscopy. Reproductive Biomedicine Online. 36 (2), 121-129 (2018).
- Vlaisavljević, V., Kovačič, B., Knez, J. Cumulative live birth rate after GnRH agonist trigger and elective cryopreservation of all embryos in high responders. Reproductive Biomedicine Online. 35, 42-48 (2017).
- Kader, A. A., Choi, A., Orief, Y., Agarwal, A. Factors affecting the outcome of human blastocyst vitrification. Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (7), 99 (2009).
- Ebner, T., et al. Morphokinetics of vitrified and warmed blastocysts predicts implantation potential. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 34 (2), 239-244 (2017).
- Coello, A., et al. Analysis of the morphological dynamics of blastocysts after vitrification/warming: defining new predictive variables of implantation. Fertility Sterility. 108 (4), 659-666 (2017).
- Huang, T. T. F., Chinn, K., Kosasa, T., Ahn, H. J., Kessel, B. Morphokinetics of human blastocyst expansion in vitro. Reproductive Biomedicine Online. 33, 659-667 (2016).
- Vanderzwalmen, P., et al. Lower intracellular concentration of cryoprotectants after vitrification than after slow freezing despite exposure to higher concentration of cryoprotectant solutions. Human Reproduction. 28, 2101-2110 (2013).
