وأعرب عن تحديد الترميز وفئات الحمض النووي الريبي غير الترميز في الخنازير الدم كله
Summary
هنا، نقدم بروتوكول الأمثل لمعالجة الترميز (مرناً) وانخفاض غير الترميز جلوبين (نكرنا) مكتبات تسلسل الحمض النووي الريبي من عينة واحدة من دم كله.
Abstract
حلول مبتكرة وقوية على نحو متزايد تقنيات التسلسل الجيل القادم وقد فتحت آفاقاً جديدة في القدرة على دراسة التعبير الجيني الأساسية المتصلة بالعمليات البيولوجية للفائدة. ليس فقط تسمح هذه الابتكارات الباحثين مراعاة التعبير من تسلسل مرناً أن التعليمات البرمجية للجينات أن الدالة effect الخلوية، ولكن أيضا جزيئات الحمض النووي الريبي (نكرنا) غير الترميز التي تظل غير مترجمة، ولكن لا تزال لديها مهام تنظيمية. على الرغم من أن الباحثين لديها القدرة على مراقبة التعبير مرناً ونكرنا، قد جرت العادة لدراسة التركيز على واحدة أو أخرى. ومع ذلك، عند الدراسات المهتمة بالتعبير مرناً ونكرنا، مرات عديدة يستخدمونها عينات منفصلة دراسة الترميز أو غير الترميز الكشف بسبب الاختلاف في الاستعدادات مكتبة. وهذا يمكن أن يؤدي إلى الحاجة إلى مزيد من العينات التي يمكن أن تزيد من الوقت والمواد الاستهلاكية، والإجهاد الحيوانية. بالإضافة إلى ذلك، فإنه قد يسبب الباحثين أن تقرر إعداد العينات لتحليل واحد فقط، وعادة ما تكون مرناً، مما يحد من عدد الأسئلة البيولوجية التي يمكن أن تحقق. ومع ذلك، تمتد نكرناس فئات متعددة مع الأدوار التنظيمية التعبير مرناً أثر ذلك. لأن نكرنا الهامة للعمليات البيولوجية الأساسية واضطراب في هذه العمليات في أثناء الإصابة، يجوز، ولذلك تقدم أهدافا جذابة للمداواة. يوضح هذه المخطوطة بروتوكول معدل لتوليد مرناً والحمض النووي الريبي غير الترميز التعبير المكتبات، بما في ذلك الجيش الملكي النيبالي الفيروسية، من عينة واحدة من الدم كله. الأمثل لهذا البروتوكول، تحسين نقاء الحمض النووي الريبي وزيادة ربط لانتعاش الكشف ميثليته وأغفلت حجم التحديد، للسماح بالتقاط أكثر الأنواع الجيش الملكي النيبالي.
Introduction
تسلسل الجيل القادم (خ ع) برز كأداة قوية لتحقيق التغيرات التي تحدث على مستوى الجينوم من الكائنات البيولوجية. إعداد نموذج لأساليب خ ع يمكن أن تختلف تبعاً للكائن الحي، ونوع الأنسجة، والأهم من ذلك الأسئلة الباحثون حريصون على العنوان. وقد تحول العديد من الدراسات إلى خ ع كوسيلة لدراسة الاختلافات في التعبير الجيني بين الدول مثل الأشخاص الأصحاء والمرضى1،2،،من34. تأخذ تسلسل وضع على أساس جينوم كله ويسمح لباحث الاستيلاء معظم، أن لم يكن كل، المعلومات الجينومية لعلامة الوراثية خاصة في وقت تشير.
العلامات الأكثر شيوعاً للتعبير ولاحظ يتم الكشف رسول (مرناس). الإجراءات الأكثر استخداماً لمكتبات الاستعداد لتسلسل الحمض النووي الريبي هي الأمثل لاسترداد الجزيئات مرناً عن طريق استخدام سلسلة من تنقية والتشظيات ليجيشنز5،6. ومع ذلك، القرار المتعلق بكيفية بروتوكول المراد تنفيذها تعتمد على نوع العينة والأسئلة حول عينة وقال. وفي معظم الحالات يتم استخراج الحمض النووي الريبي مجموع؛ حتى الآن، ليس كل جزيئات الحمض النووي الريبي تهم وفي حالات مثل دراسات التعبير مرناً وفرة مفرطة الحمض النووي الريبي الأنواع، مثل الكشف الريباسي (الرنا الريباسي) تحتاج إلى إزالة لزيادة عدد النصوص القابلة للاكتشاف المقترنة مرناس. الأسلوب الأكثر شعبية وتستخدم على نطاق واسع لإزالة جزيئات الرنا الريباسي الوفيرة هو الحد من بوليادينيلاتيد الجيش الملكي النيبالي النصوص المشار إليها ك نضوب بوليا7. يعمل هذا الأسلوب أيضا لتحليل التعبير مرناً كما أنه لا يؤثر على النصوص مرناً. ومع ذلك، في الدراسات التي تهتم بالكشف غير الترميز أو الفيروسية، استنفاد بوليا كما يزيل هذه الجزيئات.
اختر العديد من الدراسات إلى التركيز على إعداد مكتبة تسلسل الحمض النووي الريبي لدراسة أما التعبير مرناً (الترميز) أو فئة معينة من الرنا غير الترميز صغيرة أو كبيرة. على الرغم من أن هناك إجراءات أخرى8 مثلنا التي تسمح لإعداد العينة المزدوجة، إعداد دراسات عديدة المكتبات من عينات منفصلة لدراسات منفصلة عندما تكون متاحة. لدراسة مثل بلدنا، وهذا يتطلب عادة عدة عينات الدم زيادة الوقت والمواد الاستهلاكية، والإجهاد الحيوانية. وكان هدف دراستنا ليتمكن من استخدام الدم كله من الحيوانات للتعرف على والتحديد الكمي لفئات مختلفة من كلا مرناً، وأعرب عن الحمض النووي الريبي غير الترميز بين الصحة الإنجابية الخنزير صحية وشديدة العدوى والالتهاب الرئوي فيروس (إتش بي-برسف) تحدي الخنازير9،10 على الرغم من وجود عينة دم كله واحد فقط (2.5 مل) من كل خنزير. من أجل القيام بذلك، نحن بحاجة إلى تحسين استخراج نموذجية وبروتوكولات إنشاء مكتبة لتوليد البيانات المناسبة للسماح بتحليل كل من مرناً وغير الترميز الحمض النووي الريبي (نكرنا) التعبير11 من عينة واحدة.
هذا ما دفع حاجة إلى بروتوكول يسمح مرناً وغير الترميز تحليل الحمض النووي الريبي لمجموعات القياسية المتوفرة والأساليب لإنشاء مكتبة واستخراج الحمض النووي الريبي كانت موجهة أساسا مرناً واستخدام خطوة استنفاد بولي-أ12. هذه الخطوة أن جعلت من المستحيل لاستعادة الجيش الملكي النيبالي غير الترميز أو النصوص الفيروسية من العينة. ولذلك، هناك حاجة إلى أسلوب أمثل الذي يسمح لاستخراج الحمض النووي الريبي مجموع دون استنفاد نموذج بوليا. وقد تم تحسين الطريقة التي عرضت في هذه المخطوطة للسماح باستخدام الدم كله كنوع عينة وبناء المكتبات التسلسل مرناً ونكرناس من الأحجام الصغيرة والكبيرة على حد سواء. تم تحسين الطريقة للسماح لتحليل جميع الكشف الترميز غير قابلة للكشف، فضلا عن الاحتفاظ بالكشف الفيروسية ل التحقيق بعد13. في كل شيء، يسمح بروتوكول إعداد مكتبة الأمثل لدينا لتحقيق جزيئات الحمض النووي الريبي متعددة من عينة واحدة من دم كله.
وكان الهدف العام وراء استخدام هذا الأسلوب وضع عملية تسمح بجمع كل الترميز غير الجيش الملكي النيبالي ومرناً من عينة واحدة من الدم كله. وهذا يسمح لنا أن يكون مرناً ونكرنا، والجيش الملكي النيبالي الفيروسية لكل الحيوانات في دراستنا المصدر من نموذج واحد9. هذا، في نهاية المطاف، يسمح باكتشاف علمي أكثر دون تكاليف إضافية الحيوان ويعطي صورة أكثر اكتمالا للتعبير عن كل عينة الفردية. وصف الأسلوب يسمح لفحص المنظمين للتعبير الجيني، فضلا عن السماح لإتمام الدراسات الارتباطية مقارنة كلا مرناً وغير الترميز التعبير الجيش الملكي النيبالي باستخدام عينة واحدة من دم كله. دراستنا يستخدم هذا البروتوكول لدراسة التغيرات في التعبير الجيني والمنظمين جينية الممكنة في المصابة فيروسي الخنازير التجارية الذكور 9-الأسبوع القديمة.
Protocol
Representative Results
Discussion
وشملت الخطوة الحاسمة الأولى في البروتوكول التي جعلت من الأمثل الخطوات استنفاد جلوبين المضافة، التي جعلت من الممكن الحصول على نوعية ما يلي من عينات الدم كله. واحدة من أكبر القيود المفروضة على استخدام الدم كله في تسلسل الدراسات هي أرقام عالية من يقرأ في العينة خريطة لجزيئات جلوبين والحد من …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وكان هذا العمل أساسا بدعم من “وزارة الزراعة” NIFA أفري 2013-67015-21236، وفي جزء آخر من “وزارة الزراعة” عام 2015 أفري NIFA-67015-23216. هذه الدراسة تدعمها جزئيا تعيين إلى “الزراعية البحوث خدمة البحث مشاركة برنامج” يديره معهد أوك ريدج للعلم والتعليم (أرس) من خلال اتفاق مشترك بين الوكالات بين (وزارة الطاقة الأمريكية وزارة الطاقة)، ووزارة الزراعة في الولايات المتحدة. إدارة أوريسي أوك ريدج الجامعات المرتبطة بمقتضى العقد الفلاني لا. دي-AC05-06OR2310.
ونود أن نشكر الدكتور كاي فابيرج لاستنساخ المعدية HP برسف، الدكتورة سوزان بروكمير لمساعدة لها مع الحيوانات المشاركة في التجربة، وسو أوهليندورف للمساعدة في مجال السكرتارية في إعداد المخطوطة.
Materials
| PAXgene Tubes | PreAnalytix | 762165 | |
| Molecular Biology Grade Water | ThermoFisher | 10977-015 | |
| mirVana miRNA Isolation Kit | ThermoFisher | AM1560 | |
| Rneasy MinElute Clean Up Kit | QIAGEN | 74204 | |
| 100% Ethanol | Decon Labs, Inc. | 2716 | |
| 0.2 mL thin-walled tubes | ThermoFisher | 98010540 | |
| 1.5 mL RNase/DNase – free tubes | Any supplier | ||
| Veriti 96-well Thermocycler | ThermoFisher | 4375786R | |
| Globin Reduction Oligo (α 1) | Any supplier | Sequence GAT CTC CGA GGC TCC AGC TTA ACG GT | |
| Globin Reduction Oligo (α 2) | Any supplier | Sequence TCA ACG ATC AGG AGG TCA GGG TGC AA | |
| Globin Reduction Oligo (β 1) | Any supplier | Sequence AGG GGA ACT TAG TGG TAC TTG TGG GT | |
| Globin Reduction Oligo (β 2) | Any supplier | Sequence GGT TCA GAG GAA AAA GGG CTC CTC CT | |
| 10X Oligo Hybridization Buffer | |||
| -Tris-HCl, pH 7.6 | Fisher Scientific | BP1757-100 | |
| -KCl | Millipore Sigma | 60142-100ML-F | |
| 10X RNase H Buffer | |||
| -Tris-HCl, pH 7.6 | Fisher Scientific | BP1757-100 | |
| -DTT | ThermoFisher | Y00147 | |
| -MgCl2 | Promega | A351B | |
| -Molecular Biology Grade Water | ThermoFisher | 10977-015 | |
| RNase H | ThermoFisher | AM2292 | |
| SUPERase-IN | ThermoFisher | AM2694 | Rnase inhibitor |
| EDTA | Millipore Sigma | E7889 | |
| Microcentrifuge | Any supplier | ||
| 2100 Electrophoresis BioAnalyzer Instrument | Agilent Technologies | G2938C | |
| Agilent RNA 6000 Nano Kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit with Ribo-Zero | Illumina | RS-122-2201 | mRNA kit; Human/Mouse/Rat Set A (48 samples, 12 indexes) |
| TruSeq Stranded Total RNA Sample Preparation Guide | Illumina | Available on-line | |
| RNAClean XP Beads | BeckmanCoulter | A63987 | |
| AMPure XP Beads | BeckmanCoulter | A63880 | |
| MicroAmp Optical 8-tube Strip | ThermoFisher | N8010580 | 0.2 ml thin-walled tubes |
| MicroAmp Optical 8-tube Strip Cap | ThermoFisher | N801-0535 | |
| RNase/DNase – free reagent reservoirs | Any supplier | ||
| SuperScript II Reverse Transcriptase | ThermoFisher | 18064-014 | |
| MicroAmp Optical 96 well plates | ThermoFisher | N8010560 | These were used in place of .3mL plates as needed |
| MicroAmp Optical adhesive film | ThermoFisher | 4311971 | |
| NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina® (Set 1) | New England Biolabs | E73005 | small RNA kit |
| NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina® (Set 2) | New England Biolabs | E75805 | small RNA kit |
| QIAQuick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
| 96S Super Magnet Plate | ALPAQUA | A001322 |
Riferimenti
- Finotello, F., Di Camillo, B. Measuring differential gene expression with RNA-seq: challenges and strategies for data analysis. Briefings in Functional Genomics. 14 (2), 130-142 (2015).
- Coble, D. J., et al. RNA-seq analysis of broiler liver transcriptome reveals novel responses to high ambient temperature. BMC Genomics. 15, 1084 (2014).
- Koltes, J. E., et al. Identification of a putative quantitative trait nucleotide in guanylate binding protein 5 for host response to PRRS virus infection. BMC Genomics. 16, 412 (2015).
- Miller, L. C., et al. Comparative analysis of signature genes in PRRSV-infected porcine monocyte-derived cells to different stimuli. PLoS One. 12 (7), 0181256 (2017).
- Head, S. R., et al. Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges. Biotechniques. 56 (2), 61-64 (2014).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature reviews. Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).
- Dominic, O. N., Heike, G., Martin, S. Ribosomal RNA Depletion for Efficient Use of RNA-Seq Capacity. Current Protocols in Molecular Biology. 103 (1), 11-14 (2013).
- Fleming, D. S., Miller, L. C. Identification of small non-coding RNA classes expressed in swine whole blood during HP-PRRSV infection. Virology. 517, 56-61 (2018).
- Fleming, D. S., Miller, L. C. Small non-coding RNA expression status in animals faced with highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus (HP-PRRSV). Proceedings of the World Congress on Genetics Applied to Livestock Production. (11), (2018).
- Bivens Nathan, J., Zhou, M. RNA-Seq Library Construction Methods for Transcriptome Analysis. Current Protocols in Plant Biology. 1 (1), 197-215 (2016).
- Cui, P., et al. A comparison between ribo-minus RNA-sequencing and polyA-selected RNA-sequencing. Genomics. 96 (5), 259-265 (2010).
- Guo, Y., et al. RNAseq by Total RNA Library Identifies Additional RNAs Compared to Poly(A) RNA Library. BioMed Research International. 2015, 9 (2015).
- Choi, I., et al. Increasing gene discovery and coverage using RNA-seq of globin RNA reduced porcine blood samples. BMC Genomics. 15, 954 (2014).
- . TruSeq® Stranded Total RNA Sample Preparation Guide. Illumina. , (2018).
- . New England Biolabs Inc. Protocol for use with NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Kit for Illumina (Index Primers 1-48) (E7560) Available from: https://www.neb.com/~/media/Catalog/All-Protocols/758F75A29CDE4D03954E1EF75E78EA3D/Content/manualE7560_Figure_1.jpg (2018)
- Shin, H., et al. Variation in RNA-Seq transcriptome profiles of peripheral whole blood from healthy individuals with and without globin depletion. PLoS One. 9 (3), 91041 (2014).
- Costa, V., Angelini, C., De Feis, I., Ciccodicola, A. Uncovering the complexity of transcriptomes with RNA-Seq. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2010, 853916 (2010).
- Martens-Uzunova, E. S., Olvedy, M., Jenster, G. Beyond microRNA–novel RNAs derived from small non-coding RNA and their implication in cancer. Cancer Letters. 340 (2), 201-211 (2013).
