Identifizierung der Codierung und nicht-kodierende RNA-Klassen ausgedrückt bei Schweinen Vollblut
Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Verarbeitung der Codierung (mRNA) optimiert und nicht-kodierenden (NcRNA) Globin reduziert RNA-Seq-Bibliotheken von einer einzigen Vollblut-Probe.
Abstract
Das Aufkommen von innovativer und leistungsfähiger nächste Generation Sequenzierung Techniken eröffnet neue Wege in der Fähigkeit, die zugrunde liegenden Genexpression im Zusammenhang mit biologischen Prozesse von Interesse zu untersuchen. Diese Innovationen ermöglichen nicht nur Forscher, Ausdruck aus der mRNA-Sequenzen zu beobachten, die diesen Effekt zelluläre Funktion für Gene kodieren, aber auch die nicht-kodierende RNA (NcRNA) Moleküle, die nicht übersetzten, aber dennoch bleiben regulatorische Funktionen. Obwohl Forscher die Fähigkeit haben, mRNA und NcRNA Ausdruck zu beobachten, wurde es üblich, dass eine Studie, die auf eine oder die andere zu konzentrieren. Jedoch wenn Studien an mRNA und NcRNA Ausdruck interessiert sind, verwenden viele Male sie separate Proben, um Codierung oder nicht-kodierende RNAs aufgrund der Differenz in Bibliothek Vorbereitungen zu untersuchen. Das führt zu der Notwendigkeit mehr Proben die Zeit, Verbrauchsmaterialien und tierischen Stress erhöhen können. Darüber hinaus kann es kommen Forscher zu entscheiden, zur Vorbereitung von Proben für nur eine Analyse, in der Regel die mRNA, Begrenzung der Zahl der biologischen Fragestellungen, die untersucht werden können. Allerdings umfassen NcRNAs mehrere Klassen mit regulatorischen Rollen diesen Effekt mRNA Ausdruck. Da NcRNA sind wichtig, grundlegende biologische Prozesse und Störung dieser Prozesse in während der Infektion, können sie daher attraktive Ziele für Therapeutika vornehmen. Diese Handschrift zeigt eine geänderte Protokoll für die Generation mRNA und nicht-kodierende RNA Ausdruck Bibliotheken, einschließlich der viralen RNA aus einer einzigen Stichprobe von Vollblut. Optimierung dieses Protokolls RNA Reinheit verbessert, erhöht Ligatur für die Wiederherstellung der methylierten RNAs und ausgelassen Größenauswahl, um Erfassung von mehr RNA-Spezies zu ermöglichen.
Introduction
Sequenzierung der nächsten Generation entstanden (NGS) als ein leistungsfähiges Werkzeug für die Untersuchung der Veränderungen, die auf Genomebene von biologischen Organismen auftreten. Probenvorbereitung für die NGS Methoden variiert werden, je nach Organismus, Gewebetyp, und vor allem die Fragen die Forscher wollen Adresse. Viele Studien haben NGS als Mittel zur Untersuchung der Unterschiede in der Genexpression zwischen Staaten wie gesunde und kranke Personen1,2,3,4geworden. Die Sequenzierung legen Sie auf ein ganzes Genom-Basis und ermöglicht ein Forscher, der meisten zu erfassen, wenn nicht alle, die genomische Informationen für einen bestimmten genetischen Marker zu einem Zeitpunkt zeigen.
Die am häufigsten verwendeten Marker des Ausdrucks beobachtet sind der Messenger-RNAs (mRNAs). Die am häufigsten verwendeten Verfahren zur prepping Bibliotheken für RNA-Seq sind optimiert für die Erholung der mRNA-Moleküle durch den Einsatz einer Reihe von Reinigungen, Fragmentierungen und grundsätzlich5,6. Die Entscheidung darüber, wie ein Protokoll durchgeführt werden stützt sich jedoch auf Probentyp und die Fragen über diese Probe. In den meisten Fällen wird die Gesamt-RNS extrahiert; Doch nicht alle RNA-Moleküle sind von Interesse und in Fällen wie mRNA Ausdruck Studien allzu reichlich RNA-Spezies, wie ribosomale RNA (rRNA) müssen entfernt werden, um die Zahl der nachweisbaren Abschriften der mRNAs zugeordnet. Die beliebtesten und am weitesten verbreitete Methode zur Entfernung der reichlich rRNA Moleküle ist die Reduzierung von Polyadenylated RNA-Transkripte als PolyA Erschöpfung7bezeichnet. Dieser Ansatz funktioniert gut für die Analyse der mRNA Ausdruck, da es die mRNA Transkripte nicht beeinträchtigt wird. In Studien, die in nicht-kodierenden oder viralen RNAs interessiert sind, entfernt jedoch auch PolyA Erschöpfung dieser Moleküle.
Viele Studien wählen, um auf die RNA-Sequenz Bibliothek Vorbereitung mRNA Expression (Codierung) zu untersuchen oder eine bestimmte Klasse von kleinen oder großen nicht-kodierender RNA zu konzentrieren. Zwar gibt es andere Verfahren8 wie der unsrigen, die für die duale Probenvorbereitung ermöglichen, bereiten viele Studien Bibliotheken aus gesonderten Proben für separate Studien wenn verfügbar. Für eine Studie wie der unsrigen erfordert dies normalerweise mehrere Blutproben, die Erhöhung der Zeit, Verbrauchsmaterialien und Tier Stress. Ziel unserer Studie war es, möglicherweise verwenden Vollblut von Tieren zu identifizieren und quantifizieren die verschiedenen Klassen der beiden mRNA und nicht-kodierender RNA ausgedrückt zwischen gesunden und hochpathogenen Porcines reproduktives und respiratorisches Syndrom Virus (HP-PRRSV) Schweine-9,–10 trotz des Habens von nur einer einzigen Vollblut-Probe (2,5 mL) von jedem Schwein in Frage gestellt. Um dies zu tun, mussten wir zur Optimierung der typischen Extraktion und Bibliothek erstellen Protokolle, die richtigen Daten für die Analyse von mRNA und nicht-kodierende RNA (NcRNA) Ausdruck11 aus einer einzigen Probe ermöglichen zu generieren.
Dies veranlasste eine Notwendigkeit für ein Protokoll, das für mRNA und nicht-kodierende RNA Analyse zulässig, da die verfügbaren standard-Kits und Methoden für die Erstellung RNA-Extraktion und Bibliothek hauptsächlich für mRNA bestimmt wurden und ein Poly-A Erschöpfung Schritt12 verwenden. Dieser Schritt würde es wieder nicht-kodierender RNA oder viralen Transkripte aus der Probe unmöglich gemacht haben. Daher bedurfte es eine optimierte Methode, die für insgesamt RNA-Extraktion ohne Probe PolyA Erschöpfung zulässig. In diesem Manuskript vorgestellte Methode wurde für den Einsatz von Vollblut als Probentyp ermöglichen und Sequenzierung Bibliotheken für mRNA und NcRNAs von kleinen und großen Größen zu bauen optimiert. Die Methode wurde optimiert, um für die Analyse von allen nachweisbar nicht-kodierende RNAs sowie virale RNA für spätere Untersuchung13zu behalten. Alles in allem ermöglicht unsere optimierte Bibliothek-Vorbereitung-Protokoll für die Untersuchung mehrere RNA-Moleküle aus einer einzigen Blutprobe ganz.
Das übergeordnete Ziel hinter der Verwendung dieser Methode war, ein Verfahren zu entwickeln, die für die Sammlung von nicht-kodierende RNA und mRNA aus einer Stichprobe von Vollblut zulässig. Dies ermöglicht es uns, mRNA, NcRNA und virale RNA für jedes Tier in unserer Studie, die aus einer einzigen Probe9bezogen haben. Dies, letztlich ermöglicht weitere wissenschaftliche Entdeckung ohne Zusatzkosten Tier und gibt ein vollständigeres Bild des Ausdrucks von jeder einzelnen Probe. Das beschriebene Verfahren ermöglicht die Untersuchung der Regulierungsbehörden der gen-Expression als auch für den Abschluss der korrelative Studien zum Vergleich beide mRNA und nicht-kodierende RNA-Ausdruck mit Hilfe einer einzigen Vollblut-Stichprobe. Unserer Studie dieses Protokoll verwendet, um die Änderungen in der Genexpression zu untersuchen und mögliche epigenetische Regulatoren in Viral infiziert 9 – Wochen alten männlichen kommerzielle Schweine.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der erste wichtige Schritt in das Protokoll, das es optimiert gemacht enthalten die zusätzlichen Globin Erschöpfung Schritte, die es möglich gemacht, Qualität liest aus Vollblut-Proben zu erhalten. Eine der größten Einschränkungen zur Verwendung von Vollblut in Sequenzierung Studien sind die hohe Anzahl der Lesevorgänge in der Probe, die Globin Moleküle ordnen und reduziert das liest, die andere Moleküle Interesse18zuordnen könnte. Daher mussten wir bei der Optimierung des Protokolls f?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vor allem von unterstützt die von der USDA NIFA AFRI 2013-67015-21236 und zum Teil durch USDA NIFA AFRI 2015-67015-23216. Diese Studie wurde zum Teil durch einen Termin, um die landwirtschaftliche Forschung Service Teilnahme Forschungsprogramm verwaltet vom Oak Ridge Institut für Wissenschaft und Bildung (ORISE) durch eine interinstitutionelle Vereinbarung zwischen dem US-Department of Energy (unterstützt DOE) und das US-Landwirtschaftsministerium. ORISE wird von Oak Ridge verbundene Universitäten DOE vertraglich nicht verwaltet. DE-AC05-06OR2310.
Wir möchten Dr. Kay Faaberg für die HP-PRRSV infektiöse Klone, Dr. Susan Brockmeier für ihre Hilfe mit Tieren an dem Experiment beteiligt und Sue Ohlendorf für Sekretariatsaufgaben in der Manuskripterstellung danken.
Materials
| PAXgene Tubes | PreAnalytix | 762165 | |
| Molecular Biology Grade Water | ThermoFisher | 10977-015 | |
| mirVana miRNA Isolation Kit | ThermoFisher | AM1560 | |
| Rneasy MinElute Clean Up Kit | QIAGEN | 74204 | |
| 100% Ethanol | Decon Labs, Inc. | 2716 | |
| 0.2 mL thin-walled tubes | ThermoFisher | 98010540 | |
| 1.5 mL RNase/DNase – free tubes | Any supplier | ||
| Veriti 96-well Thermocycler | ThermoFisher | 4375786R | |
| Globin Reduction Oligo (α 1) | Any supplier | Sequence GAT CTC CGA GGC TCC AGC TTA ACG GT | |
| Globin Reduction Oligo (α 2) | Any supplier | Sequence TCA ACG ATC AGG AGG TCA GGG TGC AA | |
| Globin Reduction Oligo (β 1) | Any supplier | Sequence AGG GGA ACT TAG TGG TAC TTG TGG GT | |
| Globin Reduction Oligo (β 2) | Any supplier | Sequence GGT TCA GAG GAA AAA GGG CTC CTC CT | |
| 10X Oligo Hybridization Buffer | |||
| -Tris-HCl, pH 7.6 | Fisher Scientific | BP1757-100 | |
| -KCl | Millipore Sigma | 60142-100ML-F | |
| 10X RNase H Buffer | |||
| -Tris-HCl, pH 7.6 | Fisher Scientific | BP1757-100 | |
| -DTT | ThermoFisher | Y00147 | |
| -MgCl2 | Promega | A351B | |
| -Molecular Biology Grade Water | ThermoFisher | 10977-015 | |
| RNase H | ThermoFisher | AM2292 | |
| SUPERase-IN | ThermoFisher | AM2694 | Rnase inhibitor |
| EDTA | Millipore Sigma | E7889 | |
| Microcentrifuge | Any supplier | ||
| 2100 Electrophoresis BioAnalyzer Instrument | Agilent Technologies | G2938C | |
| Agilent RNA 6000 Nano Kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit with Ribo-Zero | Illumina | RS-122-2201 | mRNA kit; Human/Mouse/Rat Set A (48 samples, 12 indexes) |
| TruSeq Stranded Total RNA Sample Preparation Guide | Illumina | Available on-line | |
| RNAClean XP Beads | BeckmanCoulter | A63987 | |
| AMPure XP Beads | BeckmanCoulter | A63880 | |
| MicroAmp Optical 8-tube Strip | ThermoFisher | N8010580 | 0.2 ml thin-walled tubes |
| MicroAmp Optical 8-tube Strip Cap | ThermoFisher | N801-0535 | |
| RNase/DNase – free reagent reservoirs | Any supplier | ||
| SuperScript II Reverse Transcriptase | ThermoFisher | 18064-014 | |
| MicroAmp Optical 96 well plates | ThermoFisher | N8010560 | These were used in place of .3mL plates as needed |
| MicroAmp Optical adhesive film | ThermoFisher | 4311971 | |
| NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina® (Set 1) | New England Biolabs | E73005 | small RNA kit |
| NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina® (Set 2) | New England Biolabs | E75805 | small RNA kit |
| QIAQuick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
| 96S Super Magnet Plate | ALPAQUA | A001322 |
Riferimenti
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