全血豚で表されるコーディングおよび非コーディングの RNA クラスの識別
Summary
ここで、(mRNA) を符号化の処理のために最適化されたプロトコルを提案する、非コーディング (ncRNA) グロビンが単一の全血のサンプルから RNA シーケンス ライブラリを削減します。
Abstract
革新的でますます強力な次世代シーケンシング技術の出現は、興味の生物学的プロセスに関連する根本的な遺伝子発現を調べる能力に新たな道をオープンしました。これらの技術革新だけでなく、遺伝子の効果細胞機能をコードする mRNA シーケンスから式を観察する研究者が、無変換、それでも残っている非コーディングの RNA (ncRNA) 分子が規制機能を持っているも。研究者には、mRNA および ncRNA の表現を観察する能力があるが、どちらか一方に焦点を当てる研究の慣習だった。ただし、研究 mRNA および ncRNA の表現に興味を持っていると、何度も使用別サンプル コーディングまたは非コード Rna ライブラリの準備で差を調べる。これは時間、消耗品、および動物のストレスを高めることができるより多くのサンプルの必要性につながることができます。さらに、研究者は通常、mRNA を調べることができます生物の質問の数を制限する 1 つだけ分析用サンプルを準備することがあります。しかし、ncRNAs はその効果発現調節的役割を持つ複数のクラスに します。NcRNA は伝染の間に基本的な生物学的プロセスおよびこれらのプロセスの障害が重要なので、治療のための魅力的なターゲットを下す可能性があります、したがって。この原稿は、世代のための修正されたプロトコルを示します mRNA と非コード RNA 発現ライブラリー、全血の 1 つのサンプルからウイルスの RNA を含みます。このプロトコルの最適化 RNA の純度を改善、メチル化された Rna の回復のための結紮を増加しより多くの RNA 種の捕獲を許可するように、サイズの選択を省略すると。
Introduction
次世代シーケンシング (NGS) は、生物のゲノムのレベルで発生する変更の調査のための強力なツールとして浮上しています。NGS メソッドのサンプル準備は、生体組織の種類によって様々 なことより重要な質問、研究者に注目しているアドレスです。多くの研究は、健康と病気の個人1,2,3、4などの状態の間の遺伝子発現の差異を検討するための手段として、NGS になっています。すべて一度に特定の遺伝標識のゲノム情報のシーケンスを全ゲノム的に配置し、ほとんどのキャプチャを研究者を許可しない場合。
観察式の最も一般的なマーカーは、メッセンジャー Rna (Mrna) です。RNA シーケンスの準備中のライブラリの最もよく使われるプロシージャは、浄化、断片化、および5,6のシリーズを使用して mRNA 分子の回復に最適です。ただし、プロトコルが実行される方法の決定は、サンプルの種類及び当該サンプルについての質問に大きく依存します。ほとんどの場合では、総 RNA を抽出する;しかし、すべての RNA 分子は、関心のある、mRNA 発現研究などの場合過度に豊富な rna、リボソーム Rna (rRNA) のようなは、Mrna に関連付けられている検出成績の数を増やすために削除する必要があります。豊富な rRNA 分子を除去する最も人気のあると広く使用されている方法は、ポリア枯渇7と呼ばれる polyadenylated RNA 転写産物の減少です。このアプローチは、mRNA のコピーには影響しません、mRNA 発現の解析のためによく動作します。ただし、非コーディングやウイルスの Rna に興味がある学部で polyA 枯渇がまたこれらの分子を削除します。
多くの研究は、(コーディング) いずれかの mRNA の発現を RNA シーケンス ライブラリの準備や小規模または大規模な非コーディングの RNA の特定のクラスに集中する選択します。デュアル試料調製を可能にする我々 のような他の手順8にありますが、多くの研究は利用可能な独立した研究個別のサンプルからライブラリを準備します。我々 のような研究、これは通常時間、消耗品、および動物のストレスを増加して複数の血液サンプルを必要があります。私たちの研究の目標は動物から全血を使用して識別および両方の mRNA の異なるクラスを定量化することができる、および非コーディングの RNA 発現健康と高病原性豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス (PRRSV-HP) の間各豚からのみ 1 つの全血のサンプル (2.5 mL) を持っていることにもかかわらず豚9,10に挑戦。これを行うには、一般的な抽出と mRNA と非コード RNA (ncRNA) 式11 1 つのサンプルからの両方の分析を許可する適切なデータを生成するライブラリ作成プロトコルを最適化する必要があります。
これは mRNA のために主に意図されていた、ポリ A 枯渇ステップ12を使用して、入手可能な標準的なキットと RNA 抽出とライブラリを作成するためのメソッド、mRNA の非コーディングの RNA 解析できるプロトコルの必要性を求めてください。このステップしたらサンプルから非コーディングの RNA やウイルスの成績証明書を回復することは不可能。したがって、最適化されたメソッドが必要だったサンプル polyA 枯渇せず総 RNA の抽出に使用できます。本稿で紹介した方法は、サンプルの種類と全血の使用を可能にし、mRNA の小規模および大規模サイズの ncRNAs シーケンス ライブラリを構築する最適化されています。メソッドは、以降の調査13ウイルス Rna を保持と同様、すべての検出可能な非コード Rna の解析を可能にする最適化されています。すべてでは、私たちの最適化されたライブラリの準備のプロトコルは、単一の全血のサンプルから複数の RNA 分子の調査のためことができます。
このメソッドを使用しての背後にある全体的な目標は、全血のサンプルから非コード RNA と mRNA のコレクションに対して許可プロセスを開発しました。これにより、9つのサンプルから本研究では mRNA、ncRNA とそれぞれの動物のウイルスの RNA があります。これは最終的に、動物の追加費用なしより多くの科学的発見は、それぞれの個々 のサンプルの式のより完全な画像を与えます。記載されているメソッドを使用する両方の比較相関研究の完了を可能にすると同様、遺伝子発現の規制当局の検査のため mRNA および非コーディングの RNA 発現単一の全血サンプルを使用して。我々 の研究は、遺伝子発現の変化を調べるにこのプロトコルを使用し、可能なエピジェネティックな規制当局、9 週間の古い男性商業豚ウィルスに感染します。
Protocol
Representative Results
Discussion
最適化は、プロトコルの最初の重要なステップには、全血のサンプルから品質の読み取りを取得する可能追加グロビン枯渇の手順が含まれています。配列研究に全血を使用しての最大の制限の 1 つは高いグロビン分子にマップし、金利18の他の分子にマップ可能性があります読み取りを減らしたサンプルの読み取り数です。したがって、我々 のサンプルのタイプのプロトコ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は主に支えられ、米国農務省 NIFA アフリカ 2013年-67015-21236 によって、一部は米国農務省 NIFA アフリカ 2015年 67015 23216 によって。本研究は、農業研究サービス研究参加プログラム、米国エネルギー省 (間の省庁間協定により科学と教育 (ORISE) のオークリッジ国立研究所によって管理に任命によって部分で支えられましたDOE)、米国農務省。ORISE は、オーク リッジ関連大学によってない DOE の契約の下で管理されます。デ-AC05-06OR2310。
HP PRRSV 感染クローン、動物実験では、関与と彼女の助けのための博士スーザン Brockmeier と原稿の準備でセクレタリーのスー オーレンドルフ博士ケイ Faaberg に感謝したいと思います。
Materials
| PAXgene Tubes | PreAnalytix | 762165 | |
| Molecular Biology Grade Water | ThermoFisher | 10977-015 | |
| mirVana miRNA Isolation Kit | ThermoFisher | AM1560 | |
| Rneasy MinElute Clean Up Kit | QIAGEN | 74204 | |
| 100% Ethanol | Decon Labs, Inc. | 2716 | |
| 0.2 mL thin-walled tubes | ThermoFisher | 98010540 | |
| 1.5 mL RNase/DNase – free tubes | Any supplier | ||
| Veriti 96-well Thermocycler | ThermoFisher | 4375786R | |
| Globin Reduction Oligo (α 1) | Any supplier | Sequence GAT CTC CGA GGC TCC AGC TTA ACG GT | |
| Globin Reduction Oligo (α 2) | Any supplier | Sequence TCA ACG ATC AGG AGG TCA GGG TGC AA | |
| Globin Reduction Oligo (β 1) | Any supplier | Sequence AGG GGA ACT TAG TGG TAC TTG TGG GT | |
| Globin Reduction Oligo (β 2) | Any supplier | Sequence GGT TCA GAG GAA AAA GGG CTC CTC CT | |
| 10X Oligo Hybridization Buffer | |||
| -Tris-HCl, pH 7.6 | Fisher Scientific | BP1757-100 | |
| -KCl | Millipore Sigma | 60142-100ML-F | |
| 10X RNase H Buffer | |||
| -Tris-HCl, pH 7.6 | Fisher Scientific | BP1757-100 | |
| -DTT | ThermoFisher | Y00147 | |
| -MgCl2 | Promega | A351B | |
| -Molecular Biology Grade Water | ThermoFisher | 10977-015 | |
| RNase H | ThermoFisher | AM2292 | |
| SUPERase-IN | ThermoFisher | AM2694 | Rnase inhibitor |
| EDTA | Millipore Sigma | E7889 | |
| Microcentrifuge | Any supplier | ||
| 2100 Electrophoresis BioAnalyzer Instrument | Agilent Technologies | G2938C | |
| Agilent RNA 6000 Nano Kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit with Ribo-Zero | Illumina | RS-122-2201 | mRNA kit; Human/Mouse/Rat Set A (48 samples, 12 indexes) |
| TruSeq Stranded Total RNA Sample Preparation Guide | Illumina | Available on-line | |
| RNAClean XP Beads | BeckmanCoulter | A63987 | |
| AMPure XP Beads | BeckmanCoulter | A63880 | |
| MicroAmp Optical 8-tube Strip | ThermoFisher | N8010580 | 0.2 ml thin-walled tubes |
| MicroAmp Optical 8-tube Strip Cap | ThermoFisher | N801-0535 | |
| RNase/DNase – free reagent reservoirs | Any supplier | ||
| SuperScript II Reverse Transcriptase | ThermoFisher | 18064-014 | |
| MicroAmp Optical 96 well plates | ThermoFisher | N8010560 | These were used in place of .3mL plates as needed |
| MicroAmp Optical adhesive film | ThermoFisher | 4311971 | |
| NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina® (Set 1) | New England Biolabs | E73005 | small RNA kit |
| NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina® (Set 2) | New England Biolabs | E75805 | small RNA kit |
| QIAQuick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
| 96S Super Magnet Plate | ALPAQUA | A001322 |
Riferimenti
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