Identification de codage et de Classes d’ARN Non codants exprimée chez le porc sang total
Summary
Ici, nous présentons un protocole optimisé pour le traitement du codage (ARNm) et non-codantes (ARNnc) globine réduite RNA-seq bibliothèques auprès d’un échantillon de sang total unique.
Abstract
L’avènement de l’innovants et de plus en plus puissantes techniques de séquençage prochaines génération a ouvert de nouvelles avenues dans la possibilité d’étudier l’expression des gènes associée à des processus biologiques d’intérêt sous-jacent. Ces innovations permettent non seulement aux chercheurs d’observer l’expression à partir des séquences d’ADN messagère gènes codant cette fonction cellulaire de l’effet, mais les molécules d’ARN (ARNnc) non codantes qui restent non traduits, mais encore ont également des fonctions de réglementation. Bien que les chercheurs ont la capacité d’observer les ARNm et les ARNnc expression, il est d’usage pour une étude visant à mettre l’accent sur l’un ou l’autre. Cependant, lorsque les études sont intéressés par l’expression des ARNm et ARNnc, autant de fois qu’ils utilisent des échantillons distincts pour examiner codage ou non codantes RNAs en raison de la différence dans les préparations de la bibliothèque. Cela peut conduire à la nécessité pour d’autres exemples qui peuvent augmenter le stress animal, consommables et temps. En outre, il peut causer aux chercheurs de décider de préparer les échantillons pour seul analyse, habituellement l’ARNm, en limitant le nombre de questions biologiques qui peuvent être l’objet d’une enquête. Cependant, ncRNA couvrent plusieurs classes avec rôles régulateurs cette expression de l’ARNm effet. ARNnc étant important à des processus biologiques fondamentaux et trouble de ces processus au cours de l’infection, ils peuvent, par conséquent, faire des cibles intéressantes pour les thérapies. Ce manuscrit montre un protocole modifié pour la génération non codantes RNA expression bibliothèques, y compris l’ARN viral, d’un seul échantillon de sang total et l’ARNm. Optimisation du présent protocole, amélioré la pureté du RNA, a augmenté de ligature pour la récupération d’ARN méthylés et omis de sélection de taille, pour permettre la capture de plusieurs espèces d’ARN.
Introduction
Séquençage de la génération suivant (NGS) a émergé comme un outil puissant pour l’étude des changements qui se produisent au niveau génomique d’organismes biologiques. Préparation des échantillons pour les méthodes end peut varier selon l’organisme, le type de tissu, et surtout les questions les chercheurs tiennent à adresse. De nombreuses études se sont tournés vers la NGS comme un moyen d’étudier les différences dans l’expression des gènes entre Etats comme des individus sains et malades1,2,3,4. Le séquençage de prendre place sur une base de l’ensemble du génome et permet à un chercheur capturer la plupart, sinon tous, de l’information génomique pour un marqueur génétique particulière à la fois le point.
Les marqueurs plus courants d’expression observés sont les ARN messagers (ARNm). Les procédures plus utilisés pour préparer des bibliothèques pour RNA-seq sont optimisées pour la récupération des molécules d’ARNm au moyen d’une série de purifications, fragmentations et des trompes5,6. Toutefois, la décision sur comment un protocole doit être effectuée dépend fortement du type de l’échantillon et les questions étant posées sur ledit échantillon. Dans la plupart des cas, l’ARN total est extrait ; Pourtant, pas toutes les molécules d’ARN sont intéressants et dans des cas tels que les études d’expression ARNm trop abondantes espèces d’ARN, comme l’ARN ribosomique (ARNr) doivent être éliminés afin d’augmenter le nombre de transcriptions décelables associée à l’ARNm. La méthode la plus populaire et largement utilisée pour éliminer les molécules d’ARNr abondante est la réduction des transcriptions polyadénylé RNA dénommé polyA appauvrissement de la couche7. Cette approche fonctionne bien pour l’analyse de l’expression de l’ARNm qu’elle n’affecte pas la transcription de l’ARNm. Toutefois, dans les études qui sont intéressent à des ARN non codants ou virales, l’appauvrissement de polyA supprime également ces molécules.
De nombreuses études choisissent de se concentrer sur la préparation de bibliothèque de séquence ARN afin d’examiner l’expression de l’ARNm (codage) ou une classe particulière d’ARN non codants de petite ou grande. Bien qu’il existe d’autres procédures8 comme le nôtre qui permettent la préparation de l’échantillon double, nombreuses études préparent de bibliothèques à partir des échantillons distincts pour des études distinctes lorsqu’ils sont disponibles. Pour une étude comme la nôtre, il faudrait normalement plusieurs échantillons de sang, augmentant le stress animal, consommables et temps. L’objectif de notre étude était d’être capable d’utiliser le sang d’animaux pour identifier et quantifier les différentes classes de deux ARNm et non-codantes RNA exprimée entre sain et hautement pathogène dysgénésique et le virus du syndrome respiratoire (HP-PRRSV) contesté de porcs9,10 en dépit d’avoir seulement un échantillon simple de sang total (2,5 mL) de chaque cochon. Pour ce faire, il nous fallait optimiser l’extraction typique et les protocoles de création de bibliothèque pour générer les données appropriées permettant l’analyse des ARNm et non-codantes RNA (ARNnc) expression11 auprès d’un échantillon unique.
Cela a incité un besoin pour un protocole qui permettait d’ARNm et d’analyse de RNA non-codantes parce que les kits standards disponibles et méthodes d’extraction de l’ARN et bibliothèque de création étaient destinés principalement à des ARNm et utilisent une déplétion de poly-A étape12. Cette étape aurait rendu impossible de récupérer des ARN non codants ou transcriptions virales de l’échantillon. Par conséquent, il fallait une méthode optimisée qui a permis d’extraction de l’ARN totale sans appauvrissement de polyA échantillon. La méthode présentée dans ce manuscrit a été optimisée pour permettre l’utilisation de sang comme un type d’échantillon et pour construire des librairies de séquençage de l’ADN messagère et ncRNA de petites et grandes tailles. La méthode a été optimisée pour permettre l’analyse de tous les ARN de non-codage détectable mais aussi de conserver l’ARN viral pour l’enquête ultérieure13. Dans l’ensemble, notre protocole de préparation de Bibliothèque optimisée permet d’enquête sur les multiples molécules d’ARN auprès d’un échantillon de sang total unique.
L’objectif derrière l’utilisation de cette méthode était d’élaborer un processus qui a permis pour la collecte de non-codage ARN et ADN messagère dans un échantillon de sang entier. Cela nous permet d’avoir ARNm, ARNnc et l’ARN viral pour chaque animal dans notre étude proviennent d’un seul échantillon9. Ceci, en fin de compte, permet la découverte plus scientifique sans animaux surcoûts et donne une image plus complète de l’expression de chaque échantillon individuel. La méthode décrite permet l’examen des régulateurs de l’expression des gènes comme permettant à l’achèvement des études de corrélation en comparant les deux ARNm et expression de RNA non codantes en utilisant un échantillon simple de sang total. Notre étude a utilisé ce protocole pour examiner les changements dans l’expression des gènes et des régulateurs épigénétiques possibles dans virally infectés 9 – vieux semaine commerciales verrats.
Protocol
Representative Results
Discussion
La première étape critique dans le protocole qui fait optimisé inclus les étapes de l’appauvrissement globine ajouté, qui ont permis d’obtenir des lectures de qualité provenant d’échantillons de sang entier. L’une des plus grandes limites sur l’utilisation de sang dans les études de séquençage sont le grand nombre de lectures dans l’échantillon qui seront correspondent à des molécules de globine et réduire les lectures qui pourraient mappent à d’autres molécules d’intérêt<sup class="xref…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu principalement par le par le USDA NIFA AFRI 2013-67015-21236 et en partie par l’USDA NIFA AFRI 2015-67015-23216. Cette étude a été financée en partie par une nomination Agricultural Research Service Participation programme de recherche administré par l’Institut d’Oak Ridge pour la Science et l’éducation (Siero) grâce à un accord interinstitutions entre le US Department of Energy ( DOE) et le département américain de l’Agriculture. ORISE est géré par Oak Ridge Associated universités sous contrat DOE pas. DE-AC05-06OR2310.
Nous tenons à remercier le Dr Kay Faaberg pour les clones infectieux HP-PRRSV, Dr. Susan Brockmeier pour son aide avec les animaux impliqués dans l’expérience et Sue Ohlendorf pour l’assistance administrative dans la préparation du manuscrit.
Materials
| PAXgene Tubes | PreAnalytix | 762165 | |
| Molecular Biology Grade Water | ThermoFisher | 10977-015 | |
| mirVana miRNA Isolation Kit | ThermoFisher | AM1560 | |
| Rneasy MinElute Clean Up Kit | QIAGEN | 74204 | |
| 100% Ethanol | Decon Labs, Inc. | 2716 | |
| 0.2 mL thin-walled tubes | ThermoFisher | 98010540 | |
| 1.5 mL RNase/DNase – free tubes | Any supplier | ||
| Veriti 96-well Thermocycler | ThermoFisher | 4375786R | |
| Globin Reduction Oligo (α 1) | Any supplier | Sequence GAT CTC CGA GGC TCC AGC TTA ACG GT | |
| Globin Reduction Oligo (α 2) | Any supplier | Sequence TCA ACG ATC AGG AGG TCA GGG TGC AA | |
| Globin Reduction Oligo (β 1) | Any supplier | Sequence AGG GGA ACT TAG TGG TAC TTG TGG GT | |
| Globin Reduction Oligo (β 2) | Any supplier | Sequence GGT TCA GAG GAA AAA GGG CTC CTC CT | |
| 10X Oligo Hybridization Buffer | |||
| -Tris-HCl, pH 7.6 | Fisher Scientific | BP1757-100 | |
| -KCl | Millipore Sigma | 60142-100ML-F | |
| 10X RNase H Buffer | |||
| -Tris-HCl, pH 7.6 | Fisher Scientific | BP1757-100 | |
| -DTT | ThermoFisher | Y00147 | |
| -MgCl2 | Promega | A351B | |
| -Molecular Biology Grade Water | ThermoFisher | 10977-015 | |
| RNase H | ThermoFisher | AM2292 | |
| SUPERase-IN | ThermoFisher | AM2694 | Rnase inhibitor |
| EDTA | Millipore Sigma | E7889 | |
| Microcentrifuge | Any supplier | ||
| 2100 Electrophoresis BioAnalyzer Instrument | Agilent Technologies | G2938C | |
| Agilent RNA 6000 Nano Kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit with Ribo-Zero | Illumina | RS-122-2201 | mRNA kit; Human/Mouse/Rat Set A (48 samples, 12 indexes) |
| TruSeq Stranded Total RNA Sample Preparation Guide | Illumina | Available on-line | |
| RNAClean XP Beads | BeckmanCoulter | A63987 | |
| AMPure XP Beads | BeckmanCoulter | A63880 | |
| MicroAmp Optical 8-tube Strip | ThermoFisher | N8010580 | 0.2 ml thin-walled tubes |
| MicroAmp Optical 8-tube Strip Cap | ThermoFisher | N801-0535 | |
| RNase/DNase – free reagent reservoirs | Any supplier | ||
| SuperScript II Reverse Transcriptase | ThermoFisher | 18064-014 | |
| MicroAmp Optical 96 well plates | ThermoFisher | N8010560 | These were used in place of .3mL plates as needed |
| MicroAmp Optical adhesive film | ThermoFisher | 4311971 | |
| NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina® (Set 1) | New England Biolabs | E73005 | small RNA kit |
| NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina® (Set 2) | New England Biolabs | E75805 | small RNA kit |
| QIAQuick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
| 96S Super Magnet Plate | ALPAQUA | A001322 |
Riferimenti
- Finotello, F., Di Camillo, B. Measuring differential gene expression with RNA-seq: challenges and strategies for data analysis. Briefings in Functional Genomics. 14 (2), 130-142 (2015).
- Coble, D. J., et al. RNA-seq analysis of broiler liver transcriptome reveals novel responses to high ambient temperature. BMC Genomics. 15, 1084 (2014).
- Koltes, J. E., et al. Identification of a putative quantitative trait nucleotide in guanylate binding protein 5 for host response to PRRS virus infection. BMC Genomics. 16, 412 (2015).
- Miller, L. C., et al. Comparative analysis of signature genes in PRRSV-infected porcine monocyte-derived cells to different stimuli. PLoS One. 12 (7), 0181256 (2017).
- Head, S. R., et al. Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges. Biotechniques. 56 (2), 61-64 (2014).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature reviews. Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).
- Dominic, O. N., Heike, G., Martin, S. Ribosomal RNA Depletion for Efficient Use of RNA-Seq Capacity. Current Protocols in Molecular Biology. 103 (1), 11-14 (2013).
- Fleming, D. S., Miller, L. C. Identification of small non-coding RNA classes expressed in swine whole blood during HP-PRRSV infection. Virology. 517, 56-61 (2018).
- Fleming, D. S., Miller, L. C. Small non-coding RNA expression status in animals faced with highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus (HP-PRRSV). Proceedings of the World Congress on Genetics Applied to Livestock Production. (11), (2018).
- Bivens Nathan, J., Zhou, M. RNA-Seq Library Construction Methods for Transcriptome Analysis. Current Protocols in Plant Biology. 1 (1), 197-215 (2016).
- Cui, P., et al. A comparison between ribo-minus RNA-sequencing and polyA-selected RNA-sequencing. Genomics. 96 (5), 259-265 (2010).
- Guo, Y., et al. RNAseq by Total RNA Library Identifies Additional RNAs Compared to Poly(A) RNA Library. BioMed Research International. 2015, 9 (2015).
- Choi, I., et al. Increasing gene discovery and coverage using RNA-seq of globin RNA reduced porcine blood samples. BMC Genomics. 15, 954 (2014).
- . TruSeq® Stranded Total RNA Sample Preparation Guide. Illumina. , (2018).
- . New England Biolabs Inc. Protocol for use with NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Kit for Illumina (Index Primers 1-48) (E7560) Available from: https://www.neb.com/~/media/Catalog/All-Protocols/758F75A29CDE4D03954E1EF75E78EA3D/Content/manualE7560_Figure_1.jpg (2018)
- Shin, H., et al. Variation in RNA-Seq transcriptome profiles of peripheral whole blood from healthy individuals with and without globin depletion. PLoS One. 9 (3), 91041 (2014).
- Costa, V., Angelini, C., De Feis, I., Ciccodicola, A. Uncovering the complexity of transcriptomes with RNA-Seq. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2010, 853916 (2010).
- Martens-Uzunova, E. S., Olvedy, M., Jenster, G. Beyond microRNA–novel RNAs derived from small non-coding RNA and their implication in cancer. Cancer Letters. 340 (2), 201-211 (2013).
