Kodlama ve RNA sınıfları kodlamayan teşhis kodu içinde domuz tam kan ifade.
Summary
Burada, biz (mRNA) kodlama işlem için optimize edilmiş bir iletişim kuralı mevcut ve (ncRNA) globin kodlamayan RNA-seq kitaplıkları bir tek tam kan örneğinden azaltılmış.
Abstract
Yenilikçi ve giderek güçlü bir sonraki nesil sıralama teknikleri gelişiyle faiz biyolojik süreçleri ile ilgili temel gen ekspresyonu incelemek için yetenek içine yeni yollar açtı. Bu yenilikler sadece araştırmacılar ifade mRNA dizilerinden genler için bu etkin hücresel işlevi kod gözlemlemek için izin, ancak çevrilmeyen ama hala kalır kodlamayan RNA (ncRNA) molekülleri düzenleyici fonksiyonları da mevcuttur. Araştırmacılar mRNA ve ncRNA ifade gözlemlemek yeteneği olmasına rağmen alışılmış odaklanmak bir veya diğer bir çalışma oldu. Çalışmalar mRNA ve ncRNA ifadede ilgileniyor musunuz, ancak, birçok kez onlar ayrı örnekleri kodlama veya RNA’ların Kütüphane hazırlıklar farklılığı nedeniyle kodlamayan incelemek için kullanın. Bu zaman, sarf malzemeleri ve hayvan stres artırabilir daha fazla örnek için gereken yol açabilir. Ayrıca, araştırmacılar örnekleri tek bir analizi için genellikle mRNA soruşturma olması biyolojik soru sayısını sınırlama, hazırlamak karar vermek neden olabilir. Ancak, ncRNA’lar o etkisi mRNA ifade düzenleyici rollere sahip birden çok sınıf span. NcRNA olduğundan temel biyolojik süreçler ve bu süreçlerin bozukluğu için önemli enfeksiyon sırasında bu nedenle, tedavi için çekici hedefler hale getirebilir. Bu el yazması değiştirilmiş bir protokol oluşturmak için gösterir mRNA ve tam kan tek bir örnek üzerinden viral RNA da dahil olmak üzere kodlamayan RNA ifade kütüphaneler,. Bu protokol optimizasyon RNA saflık geliştirilmiş, ligasyonu metillenmiş RNA’ların kurtarılması için arttı ve boyut seçimi, daha fazla RNA türlerin yakalama izin vermek için ihmal.
Introduction
Sonraki nesil sıralama (NGS) biyolojik organizmalar genomik düzeyinde meydana gelen değişiklikler incelenmesi için güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır. NGS yöntemleri için numune hazırlama organizma, doku türü, bağlı olarak değiştirilebilir ve daha da önemlisi sorular araştırmacılar adresine keskin burada. Birçok çalışma NGS için gen ekspresyonu hasta ve sağlıklı bireyler1,2,3,4gibi devletler arasındaki farklılıkları eğitim aracı olarak döndü. Sıralama bir bütün genom olarak yerleştirin ve en iyi yakalamak bir araştırmacı sağlar, değilse, genomik için tüm bilgileri belirli bir genetik marker teker teker gelin.
En yaygın veri işaretleyicilerini gözlenen ifade haberci RNA (mRNA) vardır. En çok kullanılan yordamlar prepping kitaplıkları için RNA-seq purifications, fragmentations ve d5,6bir dizi aracılığıyla mRNA molekülleri kurtarılması için optimize edilmiştir. Ancak, bir protokol yapılması için nasıl üzerinde karar ağır örnek türü ve dedi örnek hakkında yöneltilen sorular üzerine dayanmaktadır. Çoğu durumda toplam RNA elde edilir; henüz, tüm RNA molekülleri ilgi ve mRNA ifade çalışmaları gibi durumlarda ribozomal RNA (rRNA) gibi aşırı bol RNA tür tespit tutanakları mRNA’ların ile ilişkili sayısını artırmak için kaldırılması gerekir. Bol rRNA molekülleri kaldırmak için en popüler ve yaygın olarak kullanılan yöntem polyA tükenmesi7olarak anılacaktır poliadenile RNA transkript azalma var. Bu yaklaşım mRNA transkript etkilemez de mRNA ifade analizi için çalışır. Ancak, içinde ya da viral kodlamayan RNA’ların ilgilenen çalışmalarda polyA tükenmesi bu moleküller de kaldırır.
Birçok çalışma (kodlama) ya da mRNA ifade incelemek için RNA dizisi Kütüphane hazırlık veya küçük veya büyük kodlamayan RNA’ın belirli bir sınıfın odaklanmak seçin. Bizimki Çift numune hazırlama için izin gibi diğer yordamlar8 olsa da, birçok çalışma kitaplıkları ayrı örneklerinden ayrı çalışmalar ne zaman elde edilebilir için hazır olun. Bizimki gibi bir çalışma için bu normalde zaman, sarf malzemeleri ve hayvan stres artan birden fazla kan örnekleri gerektirecektir. Çalışmamızın amacı belirlemek ve her iki mRNA farklı sınıflar ölçmek için tam kan hayvanlardan kullanmak mümkün olacaktı ve sağlıklı ve yüksek patojenik domuz üreme ve solunum Sendromu virüs (HP-PRRSV) arasında kodlamayan RNA ifade Sadece bir tek tam kan örneği (2.5 mL) her domuz olmasına rağmen domuz9,10 meydan. Bunu yapabilmek için biz tipik çıkarma ve kütüphane oluşturma protokolleri mRNA ve kodlamayan RNA (ncRNA) ifade11 tek bir örnek üzerinden analizi için izin vermek için uygun verileri oluşturmak için en iyi duruma getirmek için gerekli.
Bu mevcut standart kitleri ve RNA-ekstraksiyon ve kütüphane oluşturma yöntemlerini esas mRNA için amaçlanmıştır ve bir poli-A tükenmesi adım12kullanın çünkü mRNA ve kodlamayan RNA analizi için izin verilen bir iletişim kuralı için bir ihtiyaç istenir. Bu adımı kodlamayan RNA veya viral transkript alınan örneğin kurtarmak mümkün olurdu. Bu nedenle, en iyi duruma getirilmiş bir yöntemi ihtiyaç vardı bu izin olmadan örnek polyA tükenmesi toplam RNA çıkarılması için. Bu el yazması sunulan Yöntem mRNA ve ncRNA’lar küçük ve büyük boyutlarda için sıralama kitaplıkları oluşturmak için ve tam kan bir örnek türü olarak kullanmak için izin vermek için optimize edilmiştir. Yöntem, tüm tespit kodlamayan RNA’ların analiz için izin gibi daha sonra soruşturma13viral RNA’ların korumak için en iyi duruma getirilmiş. Toplamda, bir tek tam kan örneği üzerinden birden çok RNA molekülleri incelenmesi için bizim en iyi duruma getirilmiş Kütüphane hazırlık Protokolü sağlar.
Genel amacı, bu yöntemin kullanılması arkasında hem kodlamayan RNA ve mRNA koleksiyonundan bir tam kan örneği için izin verilen bir süreç geliştirmekti. Bu bir tek örnek9‘ dan kaynaklı çalışma mRNA, ncRNA ve her hayvan için viral RNA olmasını sağlar. Bu, sonuçta, ek hayvan maliyeti olmadan daha bilimsel keşif için izin verir ve daha kapsamlı bir resmi tek tek her örnek ifade verir. Gen ifadesinin yanı sıra her iki karşılaştırarak bağdaşık çalışmaların tamamlanması için izin düzenleyiciler incelenmesi için açıklanan yöntemi sağlar mRNA ve kodlamayan RNA ifade tek bütün kan örneği kullanarak. Bizim çalışma gen ekspresyonu değişiklikleri incelemek için bu protokolü kullanılan ve olası epigenetik düzenleyiciler virally 9 – hafta eski erkek ticari domuzları enfekte.
Protocol
Representative Results
Discussion
En iyi duruma getirilmiş yapılan protokolündeki ilk kritik adım kalite okuma tam kan örnekleri almak mümkün kılan eklenen globin tükenmesi adımları dahil. Bir tam kan sıralama çalışmalarda kullanma en büyük sınırlamalar globin moleküller için harita ve ilgi18diğer moleküller için harita okuma azaltmak okuma örnek sayısının fazlalığı vardır. Bu nedenle, bizim örnek türü için protokol optimize içinde en yüksek olası mRNA ve kodlamayan RNA aracılığıyla sıra…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser esas olarak tarafından desteklenmiştir USDA NIFA Engelleyeceğiz 2013-67015-21236 tarafından ve kısmen USDA NIFA Engelleyeceğiz 2015-67015-23216 tarafından. Bu çalışmada kısmen randevu Tarımsal Araştırma hizmet araştırma katılım bilim ve eğitim (ORISE) için bize Enerji Bakanlığı (arasında arası bir anlaşma ile Oak Ridge Enstitüsü tarafından yönetilen programı tarafından desteklenen DOE) ve ABD Tarım Bakanlığı. ORISE Hayır DOE sözleşme altında Oak Ridge Associated üniversiteler tarafından yönetilir. DE-AC05-06OR2310.
Dr. Kay Faaberg HP-PRRSV bulaşıcı klonlar, Dr Susan Brockmeier için ona yardım hayvanlarla denemede yer ve Sue Ohlendorf yazının hazırlanmasında sekreterlik yardım için teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| PAXgene Tubes | PreAnalytix | 762165 | |
| Molecular Biology Grade Water | ThermoFisher | 10977-015 | |
| mirVana miRNA Isolation Kit | ThermoFisher | AM1560 | |
| Rneasy MinElute Clean Up Kit | QIAGEN | 74204 | |
| 100% Ethanol | Decon Labs, Inc. | 2716 | |
| 0.2 mL thin-walled tubes | ThermoFisher | 98010540 | |
| 1.5 mL RNase/DNase – free tubes | Any supplier | ||
| Veriti 96-well Thermocycler | ThermoFisher | 4375786R | |
| Globin Reduction Oligo (α 1) | Any supplier | Sequence GAT CTC CGA GGC TCC AGC TTA ACG GT | |
| Globin Reduction Oligo (α 2) | Any supplier | Sequence TCA ACG ATC AGG AGG TCA GGG TGC AA | |
| Globin Reduction Oligo (β 1) | Any supplier | Sequence AGG GGA ACT TAG TGG TAC TTG TGG GT | |
| Globin Reduction Oligo (β 2) | Any supplier | Sequence GGT TCA GAG GAA AAA GGG CTC CTC CT | |
| 10X Oligo Hybridization Buffer | |||
| -Tris-HCl, pH 7.6 | Fisher Scientific | BP1757-100 | |
| -KCl | Millipore Sigma | 60142-100ML-F | |
| 10X RNase H Buffer | |||
| -Tris-HCl, pH 7.6 | Fisher Scientific | BP1757-100 | |
| -DTT | ThermoFisher | Y00147 | |
| -MgCl2 | Promega | A351B | |
| -Molecular Biology Grade Water | ThermoFisher | 10977-015 | |
| RNase H | ThermoFisher | AM2292 | |
| SUPERase-IN | ThermoFisher | AM2694 | Rnase inhibitor |
| EDTA | Millipore Sigma | E7889 | |
| Microcentrifuge | Any supplier | ||
| 2100 Electrophoresis BioAnalyzer Instrument | Agilent Technologies | G2938C | |
| Agilent RNA 6000 Nano Kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit with Ribo-Zero | Illumina | RS-122-2201 | mRNA kit; Human/Mouse/Rat Set A (48 samples, 12 indexes) |
| TruSeq Stranded Total RNA Sample Preparation Guide | Illumina | Available on-line | |
| RNAClean XP Beads | BeckmanCoulter | A63987 | |
| AMPure XP Beads | BeckmanCoulter | A63880 | |
| MicroAmp Optical 8-tube Strip | ThermoFisher | N8010580 | 0.2 ml thin-walled tubes |
| MicroAmp Optical 8-tube Strip Cap | ThermoFisher | N801-0535 | |
| RNase/DNase – free reagent reservoirs | Any supplier | ||
| SuperScript II Reverse Transcriptase | ThermoFisher | 18064-014 | |
| MicroAmp Optical 96 well plates | ThermoFisher | N8010560 | These were used in place of .3mL plates as needed |
| MicroAmp Optical adhesive film | ThermoFisher | 4311971 | |
| NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina® (Set 1) | New England Biolabs | E73005 | small RNA kit |
| NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina® (Set 2) | New England Biolabs | E75805 | small RNA kit |
| QIAQuick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
| 96S Super Magnet Plate | ALPAQUA | A001322 |
Riferimenti
- Finotello, F., Di Camillo, B. Measuring differential gene expression with RNA-seq: challenges and strategies for data analysis. Briefings in Functional Genomics. 14 (2), 130-142 (2015).
- Coble, D. J., et al. RNA-seq analysis of broiler liver transcriptome reveals novel responses to high ambient temperature. BMC Genomics. 15, 1084 (2014).
- Koltes, J. E., et al. Identification of a putative quantitative trait nucleotide in guanylate binding protein 5 for host response to PRRS virus infection. BMC Genomics. 16, 412 (2015).
- Miller, L. C., et al. Comparative analysis of signature genes in PRRSV-infected porcine monocyte-derived cells to different stimuli. PLoS One. 12 (7), 0181256 (2017).
- Head, S. R., et al. Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges. Biotechniques. 56 (2), 61-64 (2014).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature reviews. Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).
- Dominic, O. N., Heike, G., Martin, S. Ribosomal RNA Depletion for Efficient Use of RNA-Seq Capacity. Current Protocols in Molecular Biology. 103 (1), 11-14 (2013).
- Fleming, D. S., Miller, L. C. Identification of small non-coding RNA classes expressed in swine whole blood during HP-PRRSV infection. Virology. 517, 56-61 (2018).
- Fleming, D. S., Miller, L. C. Small non-coding RNA expression status in animals faced with highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus (HP-PRRSV). Proceedings of the World Congress on Genetics Applied to Livestock Production. (11), (2018).
- Bivens Nathan, J., Zhou, M. RNA-Seq Library Construction Methods for Transcriptome Analysis. Current Protocols in Plant Biology. 1 (1), 197-215 (2016).
- Cui, P., et al. A comparison between ribo-minus RNA-sequencing and polyA-selected RNA-sequencing. Genomics. 96 (5), 259-265 (2010).
- Guo, Y., et al. RNAseq by Total RNA Library Identifies Additional RNAs Compared to Poly(A) RNA Library. BioMed Research International. 2015, 9 (2015).
- Choi, I., et al. Increasing gene discovery and coverage using RNA-seq of globin RNA reduced porcine blood samples. BMC Genomics. 15, 954 (2014).
- . TruSeq® Stranded Total RNA Sample Preparation Guide. Illumina. , (2018).
- . New England Biolabs Inc. Protocol for use with NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Kit for Illumina (Index Primers 1-48) (E7560) Available from: https://www.neb.com/~/media/Catalog/All-Protocols/758F75A29CDE4D03954E1EF75E78EA3D/Content/manualE7560_Figure_1.jpg (2018)
- Shin, H., et al. Variation in RNA-Seq transcriptome profiles of peripheral whole blood from healthy individuals with and without globin depletion. PLoS One. 9 (3), 91041 (2014).
- Costa, V., Angelini, C., De Feis, I., Ciccodicola, A. Uncovering the complexity of transcriptomes with RNA-Seq. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2010, 853916 (2010).
- Martens-Uzunova, E. S., Olvedy, M., Jenster, G. Beyond microRNA–novel RNAs derived from small non-coding RNA and their implication in cancer. Cancer Letters. 340 (2), 201-211 (2013).
