זיהוי של קידוד ללא קידוד RNA מחלקות לידי ביטוי החזירים דם מלא
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול אופטימיזציה עבור העיבוד של קידוד (mRNA) האופטימיזציות גלובין (ncRNA) ללא קידוד RNA-seq ספריות של דגימת דם כל יחיד.
Abstract
כניסתו של יותר ויותר חזקים וחדשניים הבא הדור רצף טכניקות פתחה דרכים חדשות היכולת לבחון בביטוי הגן הבסיסי הקשור תהליכים ביולוגיים של עניין. חידושים אלה מאפשרים לא רק חוקרים לבחון ביטוי מ רצפי mRNA זה הקוד של הגנים את תפקוד התאים השפעה, אך גם מולקולות RNA (ncRNA) ללא קידוד שנותרו לא מתורגם, אבל עדיין יש פונקציות רגולטוריות. למרות חוקרים יש את היכולת להתבונן ביטוי mRNA והן ncRNA, זה כבר מקובל מחקר להתמקד אחת או אחרת. עם זאת, כאשר מחקרים מעוניינים בביטוי mRNA והן ncRNA, פעמים רבות הם משתמשים דגימות נפרד לבחון קידוד או ללא קידוד RNAs לאור ההבדל בהכנות ספריה. זה יכול להוביל הצורך לקבלת דוגמאות נוספות, אשר יכול להגביר הזמן, מתכלים, והלחץ בעלי חיים. בנוסף, הוא עלול לגרום חוקרים להחליט להכין דגימות לבדיקה אחת בלבד, בדרך כלל mRNA, הגבלת מספר שאלות ביולוגי יכול ייחקרו. עם זאת, ncRNAs להקיף כמה מחלקות רגולטוריות תפקידים עם הביטוי הזה mRNA אפקט. כי ncRNA חשובים היסוד תהליכים ביולוגיים, הפרעה של תהליכים אלה ב במהלך זיהום, הם עשויים, לכן, לבצע יעדים אטרקטיביים עבור הרפוי. כתב יד זה מדגים פרוטוקול ששונה לדור ה-mRNA, ללא קידוד RNA ביטוי ספריות, כולל RNA נגיפי, מתוך מדגם יחיד של דם מלא. אופטימיזציה של פרוטוקול זה, שיפור טוהר RNA, גדל מצדו להתאוששות של RNAs מפוגל, הושמט גודל הבחירה, כדי לאפשר לכידה של RNA יותר מינים.
Introduction
רצף הדור הבא (הגדרות) התפתחה כלי רב עוצמה עבור החקירה של השינויים המתרחשים ברמת גנומית של אורגניזם ביולוגי. הכנת הדוגמא לשיטות המיתרים יכולים להיות מגוונים בהתאם האורגניזם, סוג הרקמה, והם וחשוב השאלות החוקרים להוטים כתובת. מחקרים רבים פנו המיתרים כאמצעי של הלומדים את ההבדלים בביטוי הגנים בין מדינות כגון אנשים בריאים וחולים1,2,3,4. קח רצף במקום על בסיס כל הגנום ומאפשר חוקר ללכוד את רוב, אם לא כל, של המידע גנומית סמן גנטי מסוים בכל פעם הצבע.
הסימנים הנפוצים ביותר הביטוי נצפו הן RNAs שליח (mRNAs). ההליכים הנפוצה ביותר עבור ספריות מכין עבור ה-RNA-seq ממוטבים עבור ההתאוששות של מולקולות ה-mRNA באמצעות סדרה של purifications, fragmentations ו-5,ligations6. עם זאת, ההחלטה על איך פרוטוקול נמצא שיבוצע מסתמכת במידה רבה על סוג הדגימה ואת השאלות להיות דיגמנה על הדגימה האמורה. ברוב המקרים מופק RNA הכולל; ובכל זאת, לא כל מולקולות RNA עניין, במקרים כמו ה-mRNA ביטוי מחקרים מופרזת שופע מינים RNA, כמו ribosomal RNAs (rRNA) צורך להסיר כדי להגדיל את מספר תעתיקים לזיהוי המשויך את mRNAs. שיטת ביותר פופולריים והשימוש בהם נפוץ עבור הסרת מולקולות rRNA שופע היא הפחתת polyadenylated RNA תעתיקים המכונה תיקים עשויים דלדול7. גישה זו עובד היטב עבור הניתוח של mRNA ביטוי זה אינו משפיע על התרשימים mRNA. עם זאת, מחקרים הם מעוניינים RNAs ללא קידוד או ויראלי, תיקים עשויים דלדול מסיר גם מולקולות אלה.
מחקרים רבים בחרו להתמקד ההכנה ספריית רצף הרנ א לבחון אחד מהביטויים mRNA (קידוד) או שיעור מסוים ללא קידוד RNA קטנות או גדולות. למרות שיש אחרים הליכים8 כמו שלנו המאפשרים הכנת הדוגמא כפול, מחקרים רבים להכין ספריות מדגימות נפרדת ללימודים נפרדים כאשר היא זמינה. עבור מחקר כמו שלנו, זה בדרך כלל דורש מספר דגימות דם הגדלת זמן, מתכלים, מתח בעלי חיים. מטרת המחקר שלנו היה להיות מסוגל להשתמש דם מבעלי כדי לזהות ולכמת את מחלקות שונות של שני mRNA והביע ללא קידוד RNA בין הרבייה חזירי פתוגני ובריאה תסמונת נשימתית וירוס (HP-PRRSV) תגר חזירים9,,10 , למרות שיש רק דגימת דם כל יחיד (2.5 מ ל) של חזיר אחד. כדי לעשות זאת, היינו צריכים למטב את החילוץ אופייני והפרוטוקולים ספריית יצירה כדי ליצור את הנתונים המתאימים כדי לאפשר ניתוח של mRNA והן ללא קידוד RNA (ncRNA) ביטוי11 מתוך מדגם בודד.
הנחיה זו צורך פרוטוקול המותר עבור ה-mRNA, ללא קידוד RNA ניתוח כי ערכות סטנדרטיים זמינים ושיטות ליצירת RNA-חילוץ וספריה היו מיועדות בעיקר mRNA ולהשתמש עם דלדול poly-A בשלב12. שלב זה הייתה בלתי אפשרי לשחזר ללא קידוד RNA או ויראלי תעתיקים מדגם. לכן, שיטת אופטימיזציה היה צורך זה מותר לחילוץ RNA הכולל ללא מדגם תיקים עשויים דלדול. השיטה המובאת כתב יד זה מוטבה כדי לאפשר לשימוש של דם מלא כסוג לדוגמה, להקים ספריות רצפי mRNA והן ncRNAs בגדלים קטנים וגדולים. השיטה מוטבה כדי לאפשר הניתוח של כל לזיהוי אי קידוד RNAs, כמו גם לשמר RNAs נגיפי עבור חקירה מאוחר יותר13. בסך הכל, פרוטוקול הכנה שלנו ספריית ממוטבת מאפשר החקירה של מספר מולקולות RNA מתוך דגימת דם כל יחיד.
המטרה הכוללת מאחורי השימוש בשיטה זו הייתה לפתח תהליך איפשרה לאוסף ללא קידוד RNA וגם mRNA דוגמא אחת של דם מלא. זה מאפשר לנו יש mRNA, ncRNA ו- RNA נגיפי עבור כל בעל חיים במחקר שלנו הטרייה דוגמה יחידה9. זה, בסופו של דבר, מאפשר גילוי מדעי יותר ללא עלויות נוספות חיות ונותן תמונה שלמה יותר של הביטוי של כל דגימה בודדת. השיטה המתוארת מאפשרת הבחינה של הרגולטורים של ביטוי גנים, כמו גם לאפשר את השלמת correlative מחקרים שהשוו את שניהם mRNA וביטוי ללא קידוד RNA באמצעות דגימת דם כל יחיד. המחקר שלנו להשתמש בפרוטוקול זה לבחון השינויים בביטוי הגנים, הרגולטורים epigenetic ניתן ב נגוע לשווק 9 – בן שבועיים חזירים מסחרי זכרים.
Protocol
Representative Results
Discussion
השלב הקריטי הראשון בפרוטוקול כי עשה את זה אופטימיזציה כלל הצעדים דלדול נוסף גלובין, שהפכו אותו ניתן לקבל איכות קריאות מדגימות דם מלא. אחת המגבלות הגדולות על השימוש דם במחקרים רצף המספרים גבוהה הקריאות במדגם זה יהיה למפות גלובין מולקולות להפחית את הקורא את יכולת למפות את מולקולות אחרות הר?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו בעיקר נתמך על ידי על ידי משרד החקלאות NIFA אפריק 2013-67015-21236, וכן על ידי משרד החקלאות NIFA אפריק 2015-67015-23216. מחקר זה נתמך בחלקה על ידי פעילות חקלאית מחקר שירות מחקר השתתפות בתוכנית מנוהל על ידי המכון אוק רידג על מדע, חינוך (ORISE) דרך הסוכנויות הסכם בין (משרד האנרגיה של ארה DOE), מחלקת החקלאות של ארצות הברית. ORISE מנוהלת על ידי אלון רכס Associated אוניברסיטאות תחת חוזה דו. לא. דה-AC05-06OR2310.
ברצוננו להודות ד ר קיי Faaberg HP-PRRSV זיהומיות שיבוטים, ד ר סוזן Brockmeier עזרה עם חיות מעורב בניסוי, סו Ohlendorf עבור שירותי מזכירות בהכנה של כתב היד.
Materials
| PAXgene Tubes | PreAnalytix | 762165 | |
| Molecular Biology Grade Water | ThermoFisher | 10977-015 | |
| mirVana miRNA Isolation Kit | ThermoFisher | AM1560 | |
| Rneasy MinElute Clean Up Kit | QIAGEN | 74204 | |
| 100% Ethanol | Decon Labs, Inc. | 2716 | |
| 0.2 mL thin-walled tubes | ThermoFisher | 98010540 | |
| 1.5 mL RNase/DNase – free tubes | Any supplier | ||
| Veriti 96-well Thermocycler | ThermoFisher | 4375786R | |
| Globin Reduction Oligo (α 1) | Any supplier | Sequence GAT CTC CGA GGC TCC AGC TTA ACG GT | |
| Globin Reduction Oligo (α 2) | Any supplier | Sequence TCA ACG ATC AGG AGG TCA GGG TGC AA | |
| Globin Reduction Oligo (β 1) | Any supplier | Sequence AGG GGA ACT TAG TGG TAC TTG TGG GT | |
| Globin Reduction Oligo (β 2) | Any supplier | Sequence GGT TCA GAG GAA AAA GGG CTC CTC CT | |
| 10X Oligo Hybridization Buffer | |||
| -Tris-HCl, pH 7.6 | Fisher Scientific | BP1757-100 | |
| -KCl | Millipore Sigma | 60142-100ML-F | |
| 10X RNase H Buffer | |||
| -Tris-HCl, pH 7.6 | Fisher Scientific | BP1757-100 | |
| -DTT | ThermoFisher | Y00147 | |
| -MgCl2 | Promega | A351B | |
| -Molecular Biology Grade Water | ThermoFisher | 10977-015 | |
| RNase H | ThermoFisher | AM2292 | |
| SUPERase-IN | ThermoFisher | AM2694 | Rnase inhibitor |
| EDTA | Millipore Sigma | E7889 | |
| Microcentrifuge | Any supplier | ||
| 2100 Electrophoresis BioAnalyzer Instrument | Agilent Technologies | G2938C | |
| Agilent RNA 6000 Nano Kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit with Ribo-Zero | Illumina | RS-122-2201 | mRNA kit; Human/Mouse/Rat Set A (48 samples, 12 indexes) |
| TruSeq Stranded Total RNA Sample Preparation Guide | Illumina | Available on-line | |
| RNAClean XP Beads | BeckmanCoulter | A63987 | |
| AMPure XP Beads | BeckmanCoulter | A63880 | |
| MicroAmp Optical 8-tube Strip | ThermoFisher | N8010580 | 0.2 ml thin-walled tubes |
| MicroAmp Optical 8-tube Strip Cap | ThermoFisher | N801-0535 | |
| RNase/DNase – free reagent reservoirs | Any supplier | ||
| SuperScript II Reverse Transcriptase | ThermoFisher | 18064-014 | |
| MicroAmp Optical 96 well plates | ThermoFisher | N8010560 | These were used in place of .3mL plates as needed |
| MicroAmp Optical adhesive film | ThermoFisher | 4311971 | |
| NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina® (Set 1) | New England Biolabs | E73005 | small RNA kit |
| NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina® (Set 2) | New England Biolabs | E75805 | small RNA kit |
| QIAQuick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
| 96S Super Magnet Plate | ALPAQUA | A001322 |
Riferimenti
- Finotello, F., Di Camillo, B. Measuring differential gene expression with RNA-seq: challenges and strategies for data analysis. Briefings in Functional Genomics. 14 (2), 130-142 (2015).
- Coble, D. J., et al. RNA-seq analysis of broiler liver transcriptome reveals novel responses to high ambient temperature. BMC Genomics. 15, 1084 (2014).
- Koltes, J. E., et al. Identification of a putative quantitative trait nucleotide in guanylate binding protein 5 for host response to PRRS virus infection. BMC Genomics. 16, 412 (2015).
- Miller, L. C., et al. Comparative analysis of signature genes in PRRSV-infected porcine monocyte-derived cells to different stimuli. PLoS One. 12 (7), 0181256 (2017).
- Head, S. R., et al. Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges. Biotechniques. 56 (2), 61-64 (2014).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature reviews. Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).
- Dominic, O. N., Heike, G., Martin, S. Ribosomal RNA Depletion for Efficient Use of RNA-Seq Capacity. Current Protocols in Molecular Biology. 103 (1), 11-14 (2013).
- Fleming, D. S., Miller, L. C. Identification of small non-coding RNA classes expressed in swine whole blood during HP-PRRSV infection. Virology. 517, 56-61 (2018).
- Fleming, D. S., Miller, L. C. Small non-coding RNA expression status in animals faced with highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus (HP-PRRSV). Proceedings of the World Congress on Genetics Applied to Livestock Production. (11), (2018).
- Bivens Nathan, J., Zhou, M. RNA-Seq Library Construction Methods for Transcriptome Analysis. Current Protocols in Plant Biology. 1 (1), 197-215 (2016).
- Cui, P., et al. A comparison between ribo-minus RNA-sequencing and polyA-selected RNA-sequencing. Genomics. 96 (5), 259-265 (2010).
- Guo, Y., et al. RNAseq by Total RNA Library Identifies Additional RNAs Compared to Poly(A) RNA Library. BioMed Research International. 2015, 9 (2015).
- Choi, I., et al. Increasing gene discovery and coverage using RNA-seq of globin RNA reduced porcine blood samples. BMC Genomics. 15, 954 (2014).
- . TruSeq® Stranded Total RNA Sample Preparation Guide. Illumina. , (2018).
- . New England Biolabs Inc. Protocol for use with NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Kit for Illumina (Index Primers 1-48) (E7560) Available from: https://www.neb.com/~/media/Catalog/All-Protocols/758F75A29CDE4D03954E1EF75E78EA3D/Content/manualE7560_Figure_1.jpg (2018)
- Shin, H., et al. Variation in RNA-Seq transcriptome profiles of peripheral whole blood from healthy individuals with and without globin depletion. PLoS One. 9 (3), 91041 (2014).
- Costa, V., Angelini, C., De Feis, I., Ciccodicola, A. Uncovering the complexity of transcriptomes with RNA-Seq. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2010, 853916 (2010).
- Martens-Uzunova, E. S., Olvedy, M., Jenster, G. Beyond microRNA–novel RNAs derived from small non-coding RNA and their implication in cancer. Cancer Letters. 340 (2), 201-211 (2013).
