코딩 및 비 코딩 RNA 클래스의 식별 표시 돼지에서 전 혈
Summary
여기, 우리가 코딩 (mRNA)의 처리를 위해 최적화 된 프로토콜을 제시 하 고 비 코딩 (ncRNA) globin 단일 전체 혈액 샘플에서 RNA-seq 라이브러리를 감소.
Abstract
점점 더 강력 하 고 혁신적인 다음 세대 시퀀싱 기술의 출현 관심의 생물학 프로세스에 관련 된 기본 유전자 발현 검사 하는 기능으로 새로운 길을 열었습니다. 이러한 혁신 뿐만 아니라 그 효과 세포 기능, 유전자에 대 한 코드는 mRNA 시퀀스에서 관찰 하는 연구원을 허용 하지만 또한 비 코딩 RNA (ncRNA) 분자 번역, 하지만 여전히 남아 있는 규정 하는 기능. 연구자는 mRNA와 ncRNA 식 관찰 하는 능력, 그것은 하나 또는 다른에 집중 하는 연구에 대 한 관습 되었습니다. 그러나, 연구는 mRNA와 ncRNA 식으로 관심이 있다, 여러 번 사용 별도 샘플 검사 코딩 또는 비 코딩 RNAs 라이브러리 준비에 차이 때문에. 이 시간, 소모품 및 동물 스트레스를 증가 시킬 수 있는 더 많은 샘플에 대 한 필요 발생할 수 있습니다. 또한, 그것은 하나의 분석, 일반적으로 mRNA, 조사 될 수 있는 생물 학적 질문의 수를 제한에 대 한 샘플을 준비 하기로 하는 연구자를 발생할 수 있습니다. 그러나, ncRNAs 효과 mRNA 식 규제 역할을 가진 여러 클래스를 스팬. 중요 하기 때문에 ncRNA 기본적인 생물 학적 프로세스와 이러한 프로세스에서의 장애를 감염 하는 동안, 그들은 따라서, 치료제에 대 한 매력적인 목표를 만들 수 있습니다. 이 원고는 세대에 대 한 수정된 프로토콜을 보여줍니다 mRNA 및 비 코딩 RNA 식 라이브러리, 전 혈의 단일 샘플에서 바이러스 성 RNA를 포함 하 여. 이 프로토콜의 최적화 RNA의 순도 향상, 갠 RNAs의 복구용 결 찰을 증가 하 고 더 많은 RNA의 캡처 수 있도록 크기 선택, 생략.
Introduction
다음 차세대 시퀀싱 (NGS) 생물학 유 기체의 게놈 수준에서 발생 하는 변경의 수사를 위한 강력한 도구로 떠오르고 있다. NGS 메서드에 대 한 샘플 준비 유기 체, 조직 유형에 따라 변화 될 수 있습니다 그리고 더 중요 한 것은 질문 연구원은 촉각을 곤두세우고 있다 주소. 많은 연구 결과 건강 하 고 아픈 개인1,2,,34같은 국가 사이 유전자 발현의 차이 공부 하는 수단으로 NGS를 아닙니다. 시퀀싱 걸릴 전체 게놈으로 놓고, 대부분 캡처 연구원 수 없다면, 한 번에 특정 유전자 표식에 대 한 게놈 정보의 포인트.
관찰 하는 식의 가장 일반적인 표시는 메신저 RNAs (mRNAs). RNA-seq에 대 한 준비 라이브러리에 대 한 가장 많이 사용 된 절차 purifications, fragmentations, 및 ligations5,6의 시리즈를 통해 mRNA 분자의 복구를 위해 최적화 되어 있다. 그러나, 수행 하는 프로토콜은 어떻게에 결정 샘플 유형과 말했다 샘플에 대해 제기 되는 질문에 무 겁 게 의존 합니다. 대부분의 경우에서 총 RNA 추출; 그러나, 관심의 모든 RNA 분자는 고 mRNA 식 연구 같은 경우에 리보솜 RNAs (rRNA) 같은 지나치게 풍부한 RNA 종 감지 성적표는 mRNAs와 관련 된의 수를 늘리기 위해 제거 될 필요가 있다. 풍부한 rRNA 분자를 제거 하기 위한 가장 대중적이 고 널리 사용 방법은 polyadenylated RNA 사본 polyA 고갈7로의 감소 이다. 이 접근은 mRNA 발현의 분석으로 mRNA 사본에는 영향을 주지 않습니다. 그러나, 비 코딩 또는 바이러스 성 RNAs에 관심이 있는 연구에 polyA 고갈이이 분자도 제거 합니다.
많은 연구는 RNA 순서 라이브러리 준비 검사 (코딩) mRNA 식 이거나 또는 작은 또는 큰 비 코딩 RNA의 특정 클래스에 초점을 선택 합니다. 듀얼 샘플 준비에 대 한 허용 하는 우리 같은 다른 절차8 있지만, 많은 연구 가능한 경우 별도 연구에 대 한 별도 샘플에서 라이브러리를 준비 합니다. 우리 같은 연구에 대 한이 일반적으로 여러 개의 혈액 샘플, 소모품, 시간과 동물 스트레스 증가 요구할 것입니다. 우리의 연구의 목표를 사용 하 여 전체 혈액 동물에서 식별 하 고 두 mRNA의 다른 클래스를 계량 수 되었고 건강 하 고 높은 병원 성 돼지 재생산과 호흡 증후군 바이러스 (PRRSV HP) 사이 비 코딩 RNA 표현 도 불구 하 고만 하나의 전체 혈액 샘플 (2.5 mL) 각 돼지에서 돼지9,10 도전. 이 위해서 우리 일반적인 추출 및 mRNA 및 비 코딩 RNA (ncRNA) 식11 단일 샘플에서의 분석에 대 한 있도록 적절 한 데이터를 생성 하기 위해 라이브러리 생성 프로토콜을 최적화 하기 위해 필요 합니다.
이 때문에 RNA 추출 및 라이브러리 생성을 위한 방법과 사용할 수 있는 표준 키트 mRNA를 위해 주로 예정 되었다 폴 리 A 고갈 단계12를 사용 하 여 mRNA 및 비 코딩 RNA 분석에 대 한 허용 하는 프로토콜에 대 한 필요 라는 메시지가 나타납니다. 이 단계 만들었을 것입니다 그것은 비 코딩 RNA 바이러스 증명서 샘플에서 복구 불가능. 따라서, 최적화 방법 필요 했다 샘플 polyA 고갈 없이 총 RNA 추출에 대 한 허용. 이 원고에 표시 메서드에 mRNA를 소형 및 대형 크기의 ncRNAs 시퀀싱 라이브러리를 빌드를 샘플 형식으로 전체 혈액의 사용 하 고 최적화 되었습니다. 메서드는 모든 감지 비 코딩 RNAs의 분석에 대 한 허용 하 고 이후 수사13에 대 한 바이러스 성 RNAs를 유지 최적화 되었습니다. 모두 있음, 우리의 최적화 된 라이브러리 준비 프로토콜 단일 전체 혈액 샘플에서 여러 개의 RNA 분자의 조사에 대 한 수 있습니다.
이 메서드를 사용 하 여 뒤에 전반적인 목표는 전체 혈액의 1 개의 샘플에서 비 코딩 RNA와 mRNA의 컬렉션에 대 한 허용 하는 프로세스를 개발 했다. 우리의 연구는 단일 샘플9에서 공급에 mRNA, ncRNA, 및 각 동물에 대 한 바이러스 성 RNA를가지고 수 있습니다. 이, 궁극적으로, 동물 추가 비용 없이 더 많은 과학적 발견에 대 한 허용 하 고 각 개별 샘플의 식의 더 완전 한 그림을 제공 합니다. 설명 된 메서드를 모두 비교 하는 상호 학문의 완료에 대 한 허용 뿐만 아니라 유전자 발현의 레 귤 레이 터의 시험에 대 한 수 있습니다 mRNA 및 비 코딩 RNA 식 단일 전체 혈액 샘플을 사용 하 여. 우리의 연구는 유전자 발현에 변화를 검사 하이 프로토콜을 사용 하 고 가능한 후 레 귤 레이 터는 9 주 된 남성 상업 돼지에 virally 감염 된.
Protocol
Representative Results
Discussion
만든 최적화 된 프로토콜의 첫 번째 중요 한 단계 추가 globin 고갈 단계, 전체 혈액 샘플에서 품질 읽기를 가능 하 게 포함 되어 있습니다. 전 혈을 사용 하 여 시퀀싱 연구에서에 가장 큰 한계 중 하나는 globin 분자에 지도 하 고 관심18의 다른 분자에 매핑할 수 있는 읽기를 줄이기 위해 샘플에서 읽기의 높은 숫자입니다. 따라서, 우리의 샘플 유형에 대 한 프로토콜을 최적화, 우리?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품에 의해 주로 지원 되었다에 의해 미국 농 무부 NIFA AFRI 2013-67015-21236, 그리고 일부 USDA NIFA AFRI 2015-67015-23216 여. 이 연구는 농업 연구 서비스 연구 참여 프로그램은 미국 에너지 부 (사이 부처간 합의 통해 과학 교육 (ORISE)에 대 한 오크 리 지 연구소에 의해 관리 하는 약속에 의해 부분적으로 지원 되었다 미상)와 미국 농 무부. ORISE는 관리 오크 리 지 연관 된 대학에 의해 DOE 계약에서 더. 드-AC05-06OR2310입니다.
우리는 HP PRRSV 전염 성 클론, 박사 수잔 Brockmeier에 대 한 그녀의 동물 실험에 관련 된 도움말 및 비서 지원 원고 준비에 대 한 고소 Ohlendorf 닥터 케이 Faaberg 감사 하 고 싶습니다.
Materials
| PAXgene Tubes | PreAnalytix | 762165 | |
| Molecular Biology Grade Water | ThermoFisher | 10977-015 | |
| mirVana miRNA Isolation Kit | ThermoFisher | AM1560 | |
| Rneasy MinElute Clean Up Kit | QIAGEN | 74204 | |
| 100% Ethanol | Decon Labs, Inc. | 2716 | |
| 0.2 mL thin-walled tubes | ThermoFisher | 98010540 | |
| 1.5 mL RNase/DNase – free tubes | Any supplier | ||
| Veriti 96-well Thermocycler | ThermoFisher | 4375786R | |
| Globin Reduction Oligo (α 1) | Any supplier | Sequence GAT CTC CGA GGC TCC AGC TTA ACG GT | |
| Globin Reduction Oligo (α 2) | Any supplier | Sequence TCA ACG ATC AGG AGG TCA GGG TGC AA | |
| Globin Reduction Oligo (β 1) | Any supplier | Sequence AGG GGA ACT TAG TGG TAC TTG TGG GT | |
| Globin Reduction Oligo (β 2) | Any supplier | Sequence GGT TCA GAG GAA AAA GGG CTC CTC CT | |
| 10X Oligo Hybridization Buffer | |||
| -Tris-HCl, pH 7.6 | Fisher Scientific | BP1757-100 | |
| -KCl | Millipore Sigma | 60142-100ML-F | |
| 10X RNase H Buffer | |||
| -Tris-HCl, pH 7.6 | Fisher Scientific | BP1757-100 | |
| -DTT | ThermoFisher | Y00147 | |
| -MgCl2 | Promega | A351B | |
| -Molecular Biology Grade Water | ThermoFisher | 10977-015 | |
| RNase H | ThermoFisher | AM2292 | |
| SUPERase-IN | ThermoFisher | AM2694 | Rnase inhibitor |
| EDTA | Millipore Sigma | E7889 | |
| Microcentrifuge | Any supplier | ||
| 2100 Electrophoresis BioAnalyzer Instrument | Agilent Technologies | G2938C | |
| Agilent RNA 6000 Nano Kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit with Ribo-Zero | Illumina | RS-122-2201 | mRNA kit; Human/Mouse/Rat Set A (48 samples, 12 indexes) |
| TruSeq Stranded Total RNA Sample Preparation Guide | Illumina | Available on-line | |
| RNAClean XP Beads | BeckmanCoulter | A63987 | |
| AMPure XP Beads | BeckmanCoulter | A63880 | |
| MicroAmp Optical 8-tube Strip | ThermoFisher | N8010580 | 0.2 ml thin-walled tubes |
| MicroAmp Optical 8-tube Strip Cap | ThermoFisher | N801-0535 | |
| RNase/DNase – free reagent reservoirs | Any supplier | ||
| SuperScript II Reverse Transcriptase | ThermoFisher | 18064-014 | |
| MicroAmp Optical 96 well plates | ThermoFisher | N8010560 | These were used in place of .3mL plates as needed |
| MicroAmp Optical adhesive film | ThermoFisher | 4311971 | |
| NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina® (Set 1) | New England Biolabs | E73005 | small RNA kit |
| NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina® (Set 2) | New England Biolabs | E75805 | small RNA kit |
| QIAQuick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
| 96S Super Magnet Plate | ALPAQUA | A001322 |
Riferimenti
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