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Ricerca sul cancro

Longitudinal morphologischen und physiologischen Überwachung der dreidimensionalen Tumor Sphäroide mit optischen Kohärenztomographie

Published: February 09, 2019
doi:
10.3791/59020
, , , , , , , , , , , , ,
1Department of Electrical and Computer Engineering,Lehigh University, 2Department of Mechanical Engineering,Lehigh University, 3Department of Biomedical Engineering,Southern University of Science and Technology, 4Department of Technology R&D,Nexcelom Bioscience LLC, 5Department of Bioengineering,Lehigh University, 6Center for Photonics and Nanoelectronics,Lehigh University

Summary

Optische Kohärenztomografie (OCT), eine dreidimensionale imaging-Technologie, wurde verwendet, um zu überwachen und zu charakterisieren, die Wachstum Kinetik der vielzelligen Tumor Sphäroide. Präzise volumetrische Quantifizierung der Tumor Sphäroide mit einem Voxel zählen Ansatz und markierungsfreie abgestorbenes Gewebe-Erkennung in der Sphäroide basierend auf intrinsische optische Dämpfung dagegen wurden demonstriert.

Abstract

Tumor-Sphäroide wurden als eine dreidimensionale (3D) Kultur Zellmodell in der Krebs-Forschung und Anti-Krebs-Wirkstoffforschung entwickelt. Jedoch Hochdurchsatz-bildgebende Modalitäten Verwendung von hellen Feld oder Fluoreszenz-Detektion, derzeit nicht in der Lage, die insgesamt 3D-Struktur des Tumor-Sphäroid aufgrund begrenzter Lichtdurchlässigkeit, Diffusion von Fluoreszenzfarbstoffen zu lösen und Tiefe-Abwicklungsfähigkeit. Vor kurzem, unser Labor demonstriert die Verwendung der optischen Kohärenztomographie (OCT), ein markierungsfreie und zerstörungsfreie 3D bildgebende Modalität, um längs Charakterisierung von mehrzelligen Tumor Sphäroide in eine 96-Well-Platte auszuführen. OCT war in der Lage, 3D morphologischen und physiologischen Informationsbeschaffung der Tumor Sphäroide wächst bis zu ca. 600 µm in der Höhe. In diesem Artikel zeigen wir eine Hochdurchsatz-Okt (HT-Okt) Image System, die scannt die gesamte Multi-well-Platte und OCT 3D-Daten der Tumor Sphäroide automatisch erhält. Wir beschreiben die Details der HT-OCT-System und Bau Richtlinien im Protokoll. Aus den 3D-Daten OCT einer visualisieren die Gesamtstruktur der Sphäroid mit 3D gerendert und orthogonale Scheiben Längenwachstums Kurve von der Tumor-Sphäroid morphologische anhand von Größe und Volumen zu charakterisieren und überwacht das Wachstum von die toten Zellen Regionen in der Tumor-Sphäroid basierend auf optische intrinsischen Dämpfung Kontrast. Wir zeigen, dass HT-OCT als Hochdurchsatz-bildgebende Modalität für Drug screening sowie die Charakterisierung von Biofabricated Proben verwendet werden kann.

Introduction

Krebs ist die zweithäufigste Ursache des Todes in der Welt1. Medikamente gegen Krebs zu entwickeln, ist von entscheidender Bedeutung für die Patienten. Jedoch wird es geschätzt, dass mehr als 90 % der neue Anti-Krebs-Medikamente in der Entwicklungsphase wegen mangelnder Wirksamkeit und unerwartete Toxizität in klinischen Studien2scheitern. Der Teil des Grundes lässt sich zurückführen auf die Verwendung von einfachen zweidimensionalen (2D) Kultur Zellmodelle für zusammengesetzte Screening, die Ergebnisse mit begrenzten Vorhersagewerte der zusammengesetzten Wirksamkeit und Toxizität für die folgenden Phasen des Drug Discovery2 , 3 , 4. vor kurzem, dreidimensionale (3D) Tumor Sphäroid Modelle wurden entwickelt, um klinisch relevante physiologische und pharmakologische Daten vorsehen, Anti-Krebs-Medikament Entdeckung3,4,5 ,6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23, 24,25. Da diese Sphäroide Gewebe-spezifische Eigenschaften von Tumoren in Vivonachahmen können, können wie Nährstoffe und Sauerstoff gradient, hypoxische Kern sowie Medikament Widerstand19, die Verwendung dieser Modelle potenziell Drug Discovery Fristen zu verkürzen, reduzieren Sie Investitionskosten zu, und bringen Sie neue Medikamente für Patienten noch effektiver. Ein kritischer Ansatz zur Bewertung zusammengesetzte Wirksamkeit in 3D Tumorentwicklung Sphäroid ist zur Überwachung der Sphäroid Wachstum und Wiederauftreten nach Behandlungen9,26. Um dies zu tun, sind quantitative Charakterisierung der Tumor Morphologie, mit seinen Durchmesser und Volumen, mit hochauflösender bildgebender Verfahren zwingend notwendig.

Konventionelle bildgebende Verfahren, z. B. Hellfeld Phase Kontrast7,9,22,24und Fluoreszenz-Mikroskopie8,9,16, 18,22 kann eine Messung des Durchmessers der Sphäroid bieten aber nicht die allgemeine Struktur der Sphäroid im 3D-Raum lösen. Viele Faktoren tragen zu dieser Beschränkungen, einschließlich Eindringen von bohrenden Licht in den Sphäroid; Diffusion von Fluoreszenzfarbstoffen in den Sphäroid; emittierenden Leuchtstoff Signale von aufgeregt fluoreszierende Farbstoffe im Inneren oder auf der gegenüberliegenden Fläche des Sphäroids aufgrund der starken Absorption und Streuung; und Tiefe-Abwicklungsfähigkeit dieser bildgebende Modalitäten. Dies führt häufig zu einer ungenauen Volumenmessung. Entwicklung des nekrotischen Kerns in Sphäroide imitiert Nekrose in in Vivo Tumoren6,10,15,19,25. Diese pathologische Funktion dürfte in 2D Zelle Kulturen19,25,27,28reproduziert. Sphäroid größer als 500 µm im Durchmesser, eine Dreischicht-konzentrische Struktur, einschließlich eine äußere Schicht der proliferierenden Zellen, eine mittlere Schicht von ruhenden Zellen und einem nekrotischen Kern in der Sphäroid6,10 zu beobachten ,15,19,25, aufgrund des Mangels an Sauerstoff und Nährstoffe. Lebende und tote Zelle Fluoreszenz-Bildgebung ist die Standardtherapie, die Grenze des nekrotischen Kern zu kennzeichnen. Allerdings behindern Durchdringungen dieser fluoreszierende Farbstoffe und sichtbares Licht wieder, das Potenzial, die Sonde in den nekrotischen Kern, seine Entwicklung in seiner eigentlichen Form zu überwachen.

Eine alternative 3D bildgebende Modalität, ist Optische Kohärenztomografie (OCT) eingeführt, um den Tumor Sphäroide charakterisieren. OCT ist eine biomedizinische bildgebendes Verfahren, die für den Erwerb markierungsfreie, zerstörungsfreie 3D-Daten von bis zu 1-2 mm Tiefe in biologischen Geweben29,30,31,32,33 ,34. OCT beschäftigt Low-Kohärenz Interferometrie zurückgestreute Signale aus verschiedenen Tiefen der Probe zu erkennen und rekonstruierten Tiefe gelöst Bilder bei Mikron-Ebene räumliche Auflösungen im lateralen und vertikalen Richtungen bietet. OCT ist weit verbreitet in der Augenheilkunde35,36,37 und Angiographie38,39angenommen worden. Frühere Studien haben OCT zu beobachten die Morphologie von in-vitro- Tumor Sphäroide Basalmembran Matrix (z.B.Matrigel) und evaluieren ihre Reaktionen auf die photodynamische Therapie40,41verwendet. Vor kurzem hat unsere Gruppe eine Hochdurchsatz-OCT Image Plattform, um systematisch zu überwachen und zu quantifizieren, die Wachstum Kinetik der 3D Tumor Sphäroide im Multi-well-Platten42. Präzise volumetrische Quantifizierung der 3D Tumor Sphäroide mit einem Voxel zählen Ansatz und markierungsfreie nekrotischen Gewebes Erkennung in der Sphäroide basierend auf intrinsische optische Dämpfung Kontrast wurden demonstriert. Dieses Papier beschreibt die Details wie die OCT-Bildgebung-Plattform wurde konstruiert und eingesetzt, um hochauflösende 3D-Bilder von Tumor Sphäroide zu erhalten. Schritt für Schritt Quantitative Analysen der Kinetik von 3D Tumor Sphäroide, genaue Messungen der Sphäroid Durchmesser und Volumen, einschließlich Wachstum wird beschrieben. Darüber hinaus wird die Methode der zerstörungsfreien Detektion des nekrotischen Gewebes Regionen mit OCT, basierend auf der inneren optische Dämpfung Kontrast präsentiert.

Protocol

1. Vorbereitung der Zellen Ein qualifizierter Lieferant Zelllinien einzuholen.Hinweis: Stellen Sie sicher, dass Zellen von der Zell-Linien von Interesse Sphäroid in den Kultur-Medien oder mit Hilfe eines Substrates (Basalmembran Matrix wie Matrigel) bilden können. Schauen Sie in der Literatur-9 oder durchführen Sie einer Runde eines Pre-Experiment für einen Check. Tauen Sie die gefrorenen Zellen nach dem spezifischen Verfahren von der Zelllinie Anbieter zur Verfügung g…

Representative Results

Hoher Durchsatz optische Kohärenz Tomographie Bildgebung der Sphäroide in eine 96-Well-Platte Abbildung 3 zeigt das Ergebnis der HT-OCT Abtastung einer 96-Well-Platte mit HCT-116 Tumor Sphäroide am 3. Tag. Sequentielle Scan der gesamten Platte beginnt aus dem rechten unteren Brunnen (H12). Abbildung 3 b zeigt das Flussdiagramm der Software-Implementierung des Systems de…

Discussion

Tumor-Aktivität ist für seine morphologische Struktur äußerst relevant. Ähnlich wie bei der Überwachung der charakteristischen Wachstumskurve für 2D Zellkulturen, ist tracking die Wachstumskurve für 3D Tumor Sphäroide auch einen konventionellen Ansatz für das langfristige Sphäroid Wachstum Verhalten für verschiedene Zelllinien zu charakterisieren. Insbesondere können wir die Droge Antwort charakterisieren, durch die Analyse von Tumor-Abbau oder Tumor Regrowth spiegelt sich direkt in der Wachstumskurve. Quant…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde unterstützt durch NSF gewährt IDBR (DBI-1455613), PFI:AIR-TT (IIP-1640707), NIH Zuschüsse, R21EY026380, R15EB019704 und R01EB025209 und Lehigh University Gründerfonds.

Materials

Custom Spectral Domain OCT imaging system Developed in our lab
Superluminescent Diode (SLD) Thorlabs SLD1325 light source
2×2 single mode fused fiber coupler, 50:50 splitting ratio AC Photonics WP13500202B201
Reference Arm
Lens Tube Thorlabs
Adapter Thorlabs
Collimating Lens Thorlabs AC080-020-C
Focusing Lens Thorlabs
Kinematic Mirror Mount Thorlabs
Mirror Thorlabs
1D Translational Stage Thorlabs
Continuous neutral density filter Thorlabs
Pedestrial Post Thorlabs
Clamping Fork Thorlabs
Sample Arm
Lens Tube Thorlabs
Adapter Thorlabs
Collimating Lens Thorlabs AC080-020-C
Galvanometer Thorlabs
Relay Lens Thorlabs AC254-100-C two Relay lens to make a telescope setup
Triangle Mirror Mount Thorlabs
Mirror Thorlabs
Objective Mitutoyo
Pedestrial Post Thorlabs
Clamping Fork Thorlabs
Polarization Controller Thorlabs
30mm Cage Mount Thorlabs
Cage Rod Thorlabs
Stage
3D motorized translation stage Beijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd. JTH360XY
2D Tilting Stage
Rotation Stage
Plate Holder 3D printed
Spectrometer
Lens Tube Thorlabs
Adapter Thorlabs
Collimating Lens Thorlabs AC080-020-C
Grating Wasatch G = 1145 lpmm
F-theta Lens Thorlabs FTH-1064-100
InGaAs Line-scan Camera Sensor Unlimited SU1024-LDH2
Name Company Catalog Number Comments
Cell Culture Component
HCT 116 Cell line ATCC CCL-247
Cell Culture Flask SPL Life Sciences 70025
Pipette Fisherbrand 14388100
Pipette tips Sorenson Bioscience 10340
Gibco GlutaMax DMEM Thermo Fisher Scientific 10569044
Fetal Bovine Serum, certified, US origin Thermo Fisher Scientific 16000044
Antibiotic-Antimycotic (100X) Thermo Fisher Scientific 15240062
Corning 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate Corning 7007
Gibco PBS, pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010023
Gibco Trypsin-EDTA (0.5%) Thermo Fisher Scientific 15400054
Forma Series II 3110 Water-Jacketed CO2 Incubators Thermo Fisher Scientific 3120
Gloves VWR 89428-750
Parafilm Sigma-Aldrich P7793
Transfer pipets Globe Scientific 138080
Centrifuge Eppendorf 5702 R To centrifuge the 15 mL tube
Centrifuge NUAIRE AWEL CF 48-R To centrifuge the 96-well plate
Microscope Olympus
Name Company Catalog Number Comments
Histology & IHC
Digital slide scanner Leica Aperio AT2 Obtain high-resolution histological images
Histology Service Histowiz Request service for histological and immunohistological staining of tumor spheroid
Name Company Catalog Number Comments
List of Commerical OCTs
SD-OCT system Thorlabs Telesto Series
SD-OCT system Wasatch Photonics WP OCT 1300 nm
Name Company Catalog Number Comments
Software for Data Analyses
Basic Image Analysis NIH ImageJ Fiji also works.
3D Rendering Thermo Fisher Scientific Amira Commercial software. Option 1
3D Rendering Bitplane Imaris Commercial software. Option 2. Used in the protocol
OCT acquisition software custom developed in C++.
Stage Control Beijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd. MRC_3 Incorporated into the custom OCT acquisition code
OCT processing software custom developed in C++. Utilize GPU. Incorporated into the custom OCT acquisition code.
Morphological and Physiological Analysis custom developed in MATLAB

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Riferimenti

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Keywords: 3D Tumor SpheroidsOptical Coherence Tomography3D Cell CultureAnti-cancer Drug DiscoveryCell SeedingCell SuspensionUltra-low Attachment PlateCentrifugationCell ConcentrationCell MonitoringIncubationMedium RefreshOCT System Construction
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Huang, Y., Zou, J., Badar, M., Liu, J., Shi, W., Wang, S., Guo, Q., Wang, X., Kessel, S., Chan, L. L., Li, P., Liu, Y., Qiu, J., Zhou, C. Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography. J. Vis. Exp. (144), e59020, doi:10.3791/59020 (2019).
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