JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Ricerca sul cancro

Продольные морфологических и физиологических мониторинг сфероидов трехмерной опухоли с помощью оптическая когерентная томография

Published: February 09, 2019
doi:
10.3791/59020
, , , , , , , , , , , , ,
1Department of Electrical and Computer Engineering,Lehigh University, 2Department of Mechanical Engineering,Lehigh University, 3Department of Biomedical Engineering,Southern University of Science and Technology, 4Department of Technology R&D,Nexcelom Bioscience LLC, 5Department of Bioengineering,Lehigh University, 6Center for Photonics and Nanoelectronics,Lehigh University

Summary

Оптическая когерентная томография (Окт), трехмерные технологии визуализации, был использован для мониторинга и характеризуют Кинетика роста многоклеточных опухоли сфероидов. Точные объемного количественной сфероидов опухоли с помощью voxel, считая подход и обнаружения метки бесплатно мертвых тканей в сфероидов, основанные на встроенных оптического затухания контраст, были продемонстрированы.

Abstract

Опухоль сфероидов были разработаны как модель трехмерной (3D) клетки культуры в раковых исследований и противораковых лекарств. Однако, в настоящее время, высок объём визуализации формы используя яркие поля или флуоресценции обнаружения, не удастся разрешить в целом 3D структура сфероида опухоль из-за ограниченной проникновение света, диффузии флуоресцентных красителей и Глубина растворимость. Недавно Наша лаборатория продемонстрировали использование оптическая когерентная томография (Окт), этикетка свободно и неразрушающего 3D визуализации модальности, для выполнения продольной характеристика сфероидов многоклеточных опухоли в 96-луночных пластине. Октябрь был способен получения 3D морфологических и физиологических информации сфероидов опухоли расти до около 600 мкм в высоту. В этой статье мы демонстрируем высок объём OCT (HT-Окт) изображения системы, которая сканирует весь несколькими хорошо пластины и автоматически получает 3D данные OCT опухоли сфероидов. Мы описываем подробности руководящих принципов системы и строительство HT-Сен, в протоколе. С 3D данных OCT один можно визуализировать в общей структуре сфероида с 3D визуализации и ортогональных срезов, характеризуют кривой продольного роста опухоли сфероида основе морфологических информации, размер и объем и контролировать рост регионах мертвых клеток в опухоли сфероида, основанный на контраст оптических встроенные затухания. Мы покажем, что HT-Окт может использоваться как механизм визуализации высокой пропускной способностью для наркотиков скрининг, а также охарактеризовав biofabricated образцов.

Introduction

Рак является второй ведущей причиной смерти в мире-1. Разработки лекарств против рака имеет решающее значение для пациентов. Однако предполагается, что более 90% новых противораковых препаратов не в фазе развития ввиду отсутствия эффективности и неожиданные токсичности в клинических испытаниях2. Часть причины можно объяснить использование простой двухмерный (2D) клетки культуры моделей для составных скрининга, которые обеспечивают результаты с ограниченным предсказательная ценность составных эффективности и токсичности для следующих этапов обнаружения наркотиков2 , 3 , 4. Недавно, трехмерные (3D) опухоли сфероида модели были разработаны предоставлять клинически соответствующие физиологические и фармакологические данные для борьбы против рака наркотиков обнаружения3,4,5 ,6,,78,9,10,11,12,13,14, 15,16,,1718,19,20,21,,2223, 24,25. Поскольку эти сфероидов могут имитировать ткани специфические свойства опухоли в естественных условиях, например, питательных веществ и кислорода градиента, гипоксических ядро, а также наркотиков сопротивления19, использование этих моделей потенциально может сократить сроки обнаружения наркотиков, снизить затраты на инвестиции и принести новые медикаменты пациентам более эффективно. Один критический подход к оценке составные эффективность развития сфероида 3D опухоли является мониторинг сфероида роста и возобновления под лечения9,26. Для этого необходимы количественные характеристики опухоли морфологии, его диаметр и объем, с высоким разрешением изображения формы.

Обычных изображений условия, например, ярко поле, фаза контраст7,9,,2224и флуоресцентной микроскопии8,9,16, 18,22 может обеспечить измерение диаметра сфероида, но не может решить общую структуру сфероида в трехмерном пространстве. Многие факторы способствуют этих ограничений, в том числе проникновения зондирующего света в сфероида; Диффузия флуоресцентных красителей в сфероида; Флуоресцентный радиосигналов от возбужденных флуоресцентных красителей внутри или на поверхности противоположной сфероида из-за сильного поглощения и рассеяния; и глубина растворимость этих изображений условий. Это часто приводит к неточным объем измерений. Развитие некротические ядра в сфероидов имитирует некроза в в естественных условиях опухоли6,10,15,19,25. Эта функция патологических маловероятно, воспроизведены в 2D клетки культуры19,25,27,28. С сфероида размером более 500 мкм в диаметре, трехслойные концентрических структуры, включая внешний слой пролиферирующих клеток, средний слой покоя клеток и некротические ядро, можно наблюдать в сфероида6,10 ,15,19,25, из-за недостатка кислорода и питательных веществ. Живые и мертвые клетки флуоресценции изображений является стандартный подход к этикетке границы некротические ядра. Однако опять же, проникновение этих флуоресцентных красителей и видимого света препятствуют потенциал для зонда в ядро некротические контролировать свое развитие в его фактической формы.

Альтернативные 3D визуализации модальности, оптическая когерентная томография (Окт) вводится для характеристики опухоли сфероидов. Октябрь является биомедицинских изображений техники, которая способна до приобретения лейбл бесплатно, неразрушающего 3D данные из 1-2 мм глубины в биологических тканях29,30,,3132,33 ,34. Окт использует низкий согласованности интерферометрии для обнаружения обратно рассеянном сигналы с разных глубин образца и обеспечивает реконструированный решена глубины изображения на микрон уровня пространственного разрешения в боковых и вертикальном направлениях. Окт была широко принята в офтальмологии35,,3637 и ангиографии38,39. Предыдущие исследования использовали OCT наблюдать морфология в vitro сфероидов опухоли базальной мембраны матрицы (например, Matrigel) и оценить их ответы для фотодинамической терапии40,41. Недавно наша группа создана высок объём OCT изображений платформы для систематического мониторинга и количественной оценки Кинетика роста сфероидов 3D опухоли в нескольких хорошо плиты42. Были продемонстрированы точные объемного количественной сфероидов 3D опухоли с помощью voxel, считая подход и обнаружения метки бесплатно некротических тканей в сфероидов, основанные на встроенных оптического затухания контраст. Этот документ описывает детали как платформа отображения информации октября была построена и используемых для получения изображений с высоким разрешением 3D из опухоли сфероидов. Шаг за шагом количественный анализ кинетики роста сфероидов 3D опухоли, включая точные измерения диаметра сфероида и томов, описан. Кроме того представлен метод неразрушающего обнаружения областей некротических тканей с помощью OCT, основанные на встроенных оптического затухания контраст.

Protocol

1. Подготовка клеток Получения клеточных линий от квалифицированного поставщика.Примечание: Убедитесь, что клетки от клеточных линий интерес может сформировать сфероида, в культуре средств массовой информации или с помощью субстрата (базальной мембраны матрица как Matrigel). Загля…

Representative Results

Высокая пропускная способность оптическая когерентная томография томография сфероидов в 96-луночных плита Рис. 3 демонстрирует результат сканирования HT-OCT 96-луночных плиты с HCT 116 сфероидов опухоли на 3 день. Последователь…

Discussion

Опухоли деятельности является весьма актуальным для ее морфологической структуры. Аналогичные наблюдения кривой роста характерные для 2D клеточных культур, отслеживание кривая роста для 3D опухоли сфероидов является также традиционный подход к характеризуют долгосрочное сфероида ро?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана NSF предоставляет мкр (DBI-1455613), PFI:AIR-TT (МИП-1640707), низ грантов, R21EY026380, R15EB019704 и R01EB025209 и университете Лихай запуска фонда.

Materials

Custom Spectral Domain OCT imaging system Developed in our lab
Superluminescent Diode (SLD) Thorlabs SLD1325 light source
2×2 single mode fused fiber coupler, 50:50 splitting ratio AC Photonics WP13500202B201
Reference Arm
Lens Tube Thorlabs
Adapter Thorlabs
Collimating Lens Thorlabs AC080-020-C
Focusing Lens Thorlabs
Kinematic Mirror Mount Thorlabs
Mirror Thorlabs
1D Translational Stage Thorlabs
Continuous neutral density filter Thorlabs
Pedestrial Post Thorlabs
Clamping Fork Thorlabs
Sample Arm
Lens Tube Thorlabs
Adapter Thorlabs
Collimating Lens Thorlabs AC080-020-C
Galvanometer Thorlabs
Relay Lens Thorlabs AC254-100-C two Relay lens to make a telescope setup
Triangle Mirror Mount Thorlabs
Mirror Thorlabs
Objective Mitutoyo
Pedestrial Post Thorlabs
Clamping Fork Thorlabs
Polarization Controller Thorlabs
30mm Cage Mount Thorlabs
Cage Rod Thorlabs
Stage
3D motorized translation stage Beijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd. JTH360XY
2D Tilting Stage
Rotation Stage
Plate Holder 3D printed
Spectrometer
Lens Tube Thorlabs
Adapter Thorlabs
Collimating Lens Thorlabs AC080-020-C
Grating Wasatch G = 1145 lpmm
F-theta Lens Thorlabs FTH-1064-100
InGaAs Line-scan Camera Sensor Unlimited SU1024-LDH2
Name Company Catalog Number Comments
Cell Culture Component
HCT 116 Cell line ATCC CCL-247
Cell Culture Flask SPL Life Sciences 70025
Pipette Fisherbrand 14388100
Pipette tips Sorenson Bioscience 10340
Gibco GlutaMax DMEM Thermo Fisher Scientific 10569044
Fetal Bovine Serum, certified, US origin Thermo Fisher Scientific 16000044
Antibiotic-Antimycotic (100X) Thermo Fisher Scientific 15240062
Corning 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate Corning 7007
Gibco PBS, pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010023
Gibco Trypsin-EDTA (0.5%) Thermo Fisher Scientific 15400054
Forma Series II 3110 Water-Jacketed CO2 Incubators Thermo Fisher Scientific 3120
Gloves VWR 89428-750
Parafilm Sigma-Aldrich P7793
Transfer pipets Globe Scientific 138080
Centrifuge Eppendorf 5702 R To centrifuge the 15 mL tube
Centrifuge NUAIRE AWEL CF 48-R To centrifuge the 96-well plate
Microscope Olympus
Name Company Catalog Number Comments
Histology & IHC
Digital slide scanner Leica Aperio AT2 Obtain high-resolution histological images
Histology Service Histowiz Request service for histological and immunohistological staining of tumor spheroid
Name Company Catalog Number Comments
List of Commerical OCTs
SD-OCT system Thorlabs Telesto Series
SD-OCT system Wasatch Photonics WP OCT 1300 nm
Name Company Catalog Number Comments
Software for Data Analyses
Basic Image Analysis NIH ImageJ Fiji also works.
3D Rendering Thermo Fisher Scientific Amira Commercial software. Option 1
3D Rendering Bitplane Imaris Commercial software. Option 2. Used in the protocol
OCT acquisition software custom developed in C++.
Stage Control Beijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd. MRC_3 Incorporated into the custom OCT acquisition code
OCT processing software custom developed in C++. Utilize GPU. Incorporated into the custom OCT acquisition code.
Morphological and Physiological Analysis custom developed in MATLAB

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Kola, I., Landis, J. Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates?. Nature Reviews Drug Discovery. 3 (8), 711-716 (2004).
  2. Breslin, S., O’Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18, 240-249 (2013).
  3. Hickman, J. A., et al. Three-dimensional models of cancer for pharmacology and cancer cell biology: Capturing tumor complexity in vitro/ex vivo. Biotechnology Journal. 9 (9), 1115-1128 (2014).
  4. Sutherland, R. M. Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model. Science. 240 (4849), 177-184 (1988).
  5. Mueller-Klieser, W. Three-dimensional cell cultures: from molecular mechanisms to clinical applications. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 273, C1109-C1123 (1997).
  6. Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach. Nature Protocols. 4 (3), 309-324 (2009).
  7. Tung, Y. -. C., et al. High-throughput 3D spheroid culture and drug testing using a 384 hanging drop array. The Analyst. 136 (3), 473-478 (2011).
  8. Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC biology. 10, 29 (2012).
  9. LaBarbera, D. V., Reid, B. G., Yoo, B. H. The multicellular tumor spheroid model for high-throughput cancer drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 7, 819-830 (2012).
  10. Pampaloni, F., Ansari, N., Stelzer, E. H. K. High-resolution deep imaging of live cellular spheroids with light-sheet-based fluorescence microscopy. Cell and Tissue Research. 352, 161-177 (2013).
  11. Lovitt, C. J., Shelper, T. B., Avery, V. M. Miniaturized three-dimensional cancer model for drug evaluation. Assay and Drug Development Technologies. 11 (7), 435-448 (2013).
  12. Wenzel, C., et al. 3D high-content screening for the identification of compounds that target cells in dormant tumor spheroid regions. Experimental Cell Research. 323 (1), 131-143 (2014).
  13. Astashkina, A., Grainger, D. W. Critical analysis of 3-D organoid in vitro cell culture models for high-throughput drug candidate toxicity assessments. Innovative tissue models for drug discovery and development. 69, 1-18 (2014).
  14. Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
  15. Gong, X., et al. Generation of multicellular tumor spheroids with microwell-based agarose scaffolds for drug testing. PLoS ONE. 10 (6), e0130348 (2015).
  16. Hoffmann, O. I., et al. Impact of the spheroid model complexity on drug response. Journal of biotechnology. 205, 14-23 (2015).
  17. Martinez, N. J., Titus, S. A., Wagner, A. K., Simeonov, A. High-throughput fluorescence imaging approaches for drug discovery using in vitroand in vivothree-dimensional models. Expert Opinion on Drug Discovery. 10, 1347-1361 (2015).
  18. Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacology, Therapeutics. 163, 94-108 (2016).
  19. Li, L., Zhou, Q., Voss, T. C., Quick, K. L., LaBarbera, D. V. High-throughput imaging: Focusing in on drug discovery in 3D. Methods. 96, 97-102 (2016).
  20. Ham, S. L., Joshi, R., Thakuri, P. S., Tavana, H. Liquid-based three-dimensional tumor models for cancer research and drug discovery. Experimental Biology and Medicine. 241 (9), 939-954 (2016).
  21. Kessel, S., et al. High-Throughput 3D Tumor Spheroid Screening Method for Cancer Drug Discovery Using Celigo Image Cytometry. Journal of Laboratory Automation. , 2211068216652846 (2016).
  22. Stock, K., et al. Capturing tumor complexity in vitro: Comparative analysis of 2D and 3D tumor models for drug discovery. Scientific Reports. 6, 28951 (2016).
  23. Thakuri, P. S., Ham, S. L., Luker, G. D., Tavana, H. Multiparametric analysis of oncology drug screening with aqueous two-phase tumor spheroids. Molecular Pharmaceutics. 13 (11), 3724-3735 (2016).
  24. Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
  25. Piccinini, F., Tesei, A., Arienti, C., Bevilacqua, A. Cancer multicellular spheroids: Volume assessment from a single 2D projection. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 118 (2), 95-106 (2015).
  26. Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Scientific Reports. 6, 19103 (2016).
  27. Debnath, J., Brugge, J. S. Modelling glandular epithelial cancers in three-dimensional cultures. Nature Reviews Cancer. 5 (9), 675-688 (2005).
  28. Huang, D., et al. Optical coherence tomography. Science. 254 (5035), 1178-1181 (1991).
  29. Drexler, W., et al. Optical coherence tomography today: speed, contrast, and multimodality. Journal of Biomedical Optics. 19 (7), 071412 (2014).
  30. Fujimoto, J., Swanson, E. The development, commercialization, and impact of optical coherence tomography. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 57 (9), (2016).
  31. Vakoc, B. J., Fukumura, D., Jain, R. K., Bouma, B. E. Cancer imaging by optical coherence tomography: preclinical progress and clinical potential. Nature Reviews Cancer. 12 (5), 363-368 (2012).
  32. Wojtkowski, M. High-speed optical coherence tomography: basics and applications. Applied optics. 49 (16), D30-D61 (2010).
  33. Drexler, W., Fujimoto, J. G. . Optical coherence tomography: technology and applications. , (2008).
  34. Geitzenauer, W., Hitzenberger, C. K., Schmidt-Erfurth, U. M. Retinal optical coherence tomography: past, present and future perspectives. British Journal of Ophthalmology. 95 (2), 171 (2011).
  35. Sakata, L. M., DeLeon-Ortega, J., Sakata, V., Girkin, C. A. Optical coherence tomography of the retina and optic nerve – a review. Clinical, Experimental Ophthalmology. 37 (1), 90-99 (2009).
  36. van Velthoven, M. E. J., Faber, D. J., Verbraak, F. D., van Leeuwen, T. G., de Smet, M. D. Recent developments in optical coherence tomography for imaging the retina. Progress in Retinal and Eye Research. 26 (1), 57-77 (2007).
  37. Kashani, A. H., et al. Optical coherence tomography angiography: A comprehensive review of current methods and clinical applications. Progress in Retinal and Eye Research. 60, 66-100 (2017).
  38. de Carlo, T. E., Romano, A., Waheed, N. K., Duker, J. S. A review of optical coherence tomography angiography (OCTA). International Journal of Retina and Vitreous. 1 (1), 5 (2015).
  39. Sharma, M., Verma, Y., Rao, K. D., Nair, R., Gupta, P. K. Imaging growth dynamics of tumour spheroids using optical coherence tomography. Biotechnology Letters. 29 (2), 273-278 (2006).
  40. Jung, Y., Nichols, A. J., Klein, O. J., Roussakis, E., Evans, C. L. Label-Free, Longitudinal Visualization of PDT Response In Vitro with Optical Coherence Tomography. Israel Journal of Chemistry. 52 (8-9), 728-744 (2012).
  41. Huang, Y., et al. Optical coherence tomography detects necrotic regions and volumetrically quantifies multicellular tumor spheroids. Ricerca sul cancro. 77 (21), 6011-6020 (2017).
  42. Spalteholz, W. . Über das Durchsightigmachen von menschlichen und tierischen Präparaten: nebst Anhang, Über Knochenfärbung. , (1911).
  43. Dodt, H. -. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331 (2007).
  44. Leitgeb, R., Hitzenberger, C., Fercher, A. F. Performance of fourier domain vs. time domain optical coherence tomography. Optics express. 11 (8), 889-894 (2003).
  45. Jian, Y., Wong, K., Sarunic, M. V. . Optical Coherence Tomography and Coherence Domain Optical Methods in Biomedicine XVII. , 85710Z (2013).
  46. Guizar-Sicairos, M., Thurman, S. T., Fienup, J. R. Efficient subpixel image registration algorithms. Optics Letters. 33 (2), 156-158 (2008).
  47. Canny, J. A computational approach to edge detection. IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine Intelligence. (6), 679-698 (1986).
  48. Vermeer, K. A., Mo, J., Weda, J. J. A., Lemij, H. G., de Boer, J. F. Depth-resolved model-based reconstruction of attenuation coefficients in optical coherence tomography. Biomedical Optics Express. 5 (1), 322-337 (2014).
  49. Klein, T., et al. Multi-MHz retinal OCT. Biomedical Optics Express. 4, 1890-1908 (2013).
  50. Klein, T., Huber, R. High-speed OCT light sources and systems [Invited]. Biomedical Optics Express. 8 (2), 828-859 (2017).
  51. Zhou, C., Alex, A., Rasakanthan, J., Ma, Y. Space-division multiplexing optical coherence tomography. Optics Express. 21, 19219-19227 (2013).

Tags

Keywords: 3D Tumor SpheroidsOptical Coherence Tomography3D Cell CultureAnti-cancer Drug DiscoveryCell SeedingCell SuspensionUltra-low Attachment PlateCentrifugationCell ConcentrationCell MonitoringIncubationMedium RefreshOCT System Construction
check_url/it/59020?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Huang, Y., Zou, J., Badar, M., Liu, J., Shi, W., Wang, S., Guo, Q., Wang, X., Kessel, S., Chan, L. L., Li, P., Liu, Y., Qiu, J., Zhou, C. Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography. J. Vis. Exp. (144), e59020, doi:10.3791/59020 (2019).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image