Longitudinal control morfológico y fisiológico de esferoides tumorales tridimensional mediante tomografía de coherencia óptica
Summary
Tomografía de coherencia óptica (OCT), una tecnología de imagen tridimensional, fue utilizada para monitorear y caracterizar la cinética de crecimiento de esferoides multicelulares tumor. Cuantificación volumétrica precisa de esferoides tumorales usando un voxel contando el enfoque y la detección de tejido libre de etiqueta muerto en esferoides basado en contraste intrínseco atenuación óptica, fueron demostrados.
Abstract
Esferoides tumorales se han desarrollado como un modelo de cultura (3D) tridimensional de la célula de cáncer investigación y lucha contra el cáncer el descubrimiento de medicamentos. Sin embargo, actualmente, las modalidades de la proyección de imagen de alto rendimiento utilizando detección de campo o fluorescencia brillante, son incapaces de resolver la estructura total 3D de la esferoide de tumor debido a la limitada penetración de la luz, difusión de tintes fluorescentes y profundidad-resolución. Recientemente, nuestro laboratorio demostró el uso de tomografía de coherencia óptica (OCT), no destructiva y sin etiqueta 3D de modalidad, para realizar la caracterización longitudinal de esferoides multicelulares tumor en una placa de 96 pocillos. OCT es capaz de obtener información morfológica y fisiológica 3D de esferoides de tumor creciendo hasta llegar a alrededor de 600 μm de altura. En este artículo, se demuestra un sistema de proyección de imagen de OCT (HT-OCT) alto rendimiento que escanea la placa entera y bien y obtiene datos de OCT 3D de esferoides tumorales automáticamente. Se describen los detalles de las pautas de construcción y sistema de HT-OCT en el protocolo. De los datos de OCT 3D, uno puede visualizar la estructura global del esferoide con 3D prestados y cortes ortogonales, caracterizar la curva de crecimiento longitudinal de la esferoide tumor basado en la información morfológica de tamaño y volumen y controlar el crecimiento de las regiones de muerte celular en el esferoide de tumor basado en contraste óptico atenuación intrínseca. Mostramos que el HT-OCT puede utilizarse como una modalidad de proyección de imagen de alto rendimiento para droga detección, así como caracterizar las muestras biofabricated.
Introduction
El cáncer es la segunda causa de muerte en el mundo1. Desarrollo de fármacos contra el cáncer es de crucial importancia para los pacientes. Sin embargo, se estima que más del 90% de los nuevos fármacos contra el cáncer no en fase de desarrollo debido a la falta de eficacia y toxicidad inesperada en ensayos clínicos2. Parte de la razón puede atribuirse a la utilización de modelos de cultura de célula (2D) de dos dimensiones simple para la detección compuesto, que proporcionan resultados limitados valores predictivos de toxicidad y eficacia compuesto por las siguientes etapas de descubrimiento de drogas2 , 3 , 4. recientemente, tridimensional (3D) tumor esferoide modelos han sido desarrollados para proporcionar datos fisiológicos y farmacológicos clínicamente relevantes de fármaco contra el cáncer descubrimiento3,4,5 ,6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20,21,22,23, 24,25. Puesto que estos esferoides pueden simular propiedades específicas de tejido de tumores en vivo, tales como nutrientes y oxígeno gradiente, hipóxica básico así como drogas resistencia19, el uso de estos modelos puede potencialmente acortar plazos de descubrimiento de drogas, reducir los costos de inversión y traer nuevos medicamentos a los pacientes más con eficacia. Un enfoque crítico para la evaluación de eficacia compuesto en desarrollo del esferoide de tumor 3D es supervisar el crecimiento del esferoide y recidiva en los tratamientos9,26. Para ello, las caracterizaciones cuantitativas de la morfología del tumor, con su diámetro y volumen, con modalidades de imágenes de alta resolución, son imprescindibles.
Modalidades convencionales de la proyección de imagen, como fase contraste7,9,22,24y campo claro y fluorescencia microscopía8,9,16, 18,22 puede proporcionar una medida de diámetro de esferoide pero no puede resolver la estructura general de la esferoide en el espacio 3D. Muchos factores contribuyen a estas limitaciones, incluyendo la penetración de la luz que en el esferoide; difusión de los tintes fluorescentes en el esferoide; emisión de señales fluorescentes de tintes fluorescentes excitados dentro o en la superficie opuesta de la esferoide debido a la fuerte absorción y dispersión; y resolución de profundidad de estas modalidades de imagen. Esto conduce a menudo a una medida incorrecta de volumen. Desarrollo de la base necrótica en esferoides imita necrosis en vivo tumores6,10,15,19,25. Esta característica patológica es probable que en 2D de la célula las culturas19,25,27,28. Con un tamaño de esferoide más de 500 μm de diámetro, una estructura concéntrica de tres capas, como una capa externa de células de la proliferación, una capa intermedia de células quiescentes y un núcleo necrótico, puede observarse en el esferoide6,10 ,15,19,25, debido a la falta de oxígeno y nutrientes. Imágenes de fluorescencia de células vivas y muertas son el acercamiento estándar para identificar el límite de la base necrótica. Sin embargo, una vez más, penetraciones de estos tintes fluorescentes y luz visible obstaculizan el potencial de la sonda en el núcleo necrótico para monitorear su desarrollo en su forma real.
Una alternativa 3D de modalidad, tomografía de coherencia óptica (OCT) es introducida para caracterizar los esferoides tumorales. OCT es una técnica Biomédica de imagen que es capaz de adquirir datos 3D etiqueta-libre, no-destructivo de hasta 1-2 mm profundidad en tejidos biológicos29,30,31,32,33 ,34. OCT emplea interferometría de baja coherencia para detectar señales de back-esparcidas de diferentes profundidades de la muestra y proporciona imágenes profundidad resuelto reconstruidas en resoluciones espaciales de nivel de micrones en direcciones laterales y verticales. OCT ha sido adoptado ampliamente en Oftalmología35,36,37 y angiografía38,39. Estudios previos han utilizado OCT para observar la morfología de in vitro esferoides de tumor en la matriz de la membrana del sótano (p. ej., Matrigel) y evaluar sus respuestas a la terapia fotodinámica40,41. Recientemente, nuestro grupo estableció una plataforma imágenes del OCT de alto rendimiento para sistemáticamente monitorear y cuantificar la cinética de crecimiento de esferoides tumorales 3D en placas de varios pocillos42. Cuantificación volumétrica precisa de esferoides tumorales 3D usando un voxel contando enfoque y detección de tejido necrótico etiqueta-libre en los esferoides basado en contraste intrínseco atenuación óptica fueron demostrados. Este artículo describe los detalles de cómo la plataforma de proyección de imagen de OCT fue construida y utilizada para obtener imágenes 3D de alta resolución de esferoides tumorales. Se describe el paso a paso análisis cuantitativo de la cinética de crecimiento de esferoides tumorales 3D, incluyendo las medidas exactas de volúmenes y diámetro del esferoide. También, se presenta el método de la detección no destructiva de las regiones de tejido necrótico mediante OCT, basado en el contraste de la atenuación óptica intrínseca.
Protocol
Representative Results
Discussion
Actividad tumoral es muy importante a su estructura morfológica. Similar a control de curva de crecimiento característica de cultivos celulares 2D, seguimiento de la curva de crecimiento de esferoides tumorales 3D es también un enfoque convencional para caracterizar el comportamiento a largo plazo de crecimiento de esferoide para diferentes líneas celulares. En particular, podemos caracterizar la respuesta de drogas mediante el análisis de degradación del tumor o recrecimiento del tumor directamente reflejada en la…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por la NSF concede IDBR (DBI-1455613), PFI:AIR-TT (PII-1640707), NIH fondo de inicio de becas R21EY026380, R15EB019704 y R01EB025209 y la Universidad de Lehigh.
Materials
| Custom Spectral Domain OCT imaging system | Developed in our lab | ||
| Superluminescent Diode (SLD) | Thorlabs | SLD1325 | light source |
| 2×2 single mode fused fiber coupler, 50:50 splitting ratio | AC Photonics | WP13500202B201 | |
| Reference Arm | |||
| Lens Tube | Thorlabs | ||
| Adapter | Thorlabs | ||
| Collimating Lens | Thorlabs | AC080-020-C | |
| Focusing Lens | Thorlabs | ||
| Kinematic Mirror Mount | Thorlabs | ||
| Mirror | Thorlabs | ||
| 1D Translational Stage | Thorlabs | ||
| Continuous neutral density filter | Thorlabs | ||
| Pedestrial Post | Thorlabs | ||
| Clamping Fork | Thorlabs | ||
| Sample Arm | |||
| Lens Tube | Thorlabs | ||
| Adapter | Thorlabs | ||
| Collimating Lens | Thorlabs | AC080-020-C | |
| Galvanometer | Thorlabs | ||
| Relay Lens | Thorlabs | AC254-100-C | two Relay lens to make a telescope setup |
| Triangle Mirror Mount | Thorlabs | ||
| Mirror | Thorlabs | ||
| Objective | Mitutoyo | ||
| Pedestrial Post | Thorlabs | ||
| Clamping Fork | Thorlabs | ||
| Polarization Controller | Thorlabs | ||
| 30mm Cage Mount | Thorlabs | ||
| Cage Rod | Thorlabs | ||
| Stage | |||
| 3D motorized translation stage | Beijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd. | JTH360XY | |
| 2D Tilting Stage | |||
| Rotation Stage | |||
| Plate Holder | 3D printed | ||
| Spectrometer | |||
| Lens Tube | Thorlabs | ||
| Adapter | Thorlabs | ||
| Collimating Lens | Thorlabs | AC080-020-C | |
| Grating | Wasatch | G = 1145 lpmm | |
| F-theta Lens | Thorlabs | FTH-1064-100 | |
| InGaAs Line-scan Camera | Sensor Unlimited | SU1024-LDH2 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Culture Component | |||
| HCT 116 Cell line | ATCC | CCL-247 | |
| Cell Culture Flask | SPL Life Sciences | 70025 | |
| Pipette | Fisherbrand | 14388100 | |
| Pipette tips | Sorenson Bioscience | 10340 | |
| Gibco GlutaMax DMEM | Thermo Fisher Scientific | 10569044 | |
| Fetal Bovine Serum, certified, US origin | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Corning 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate | Corning | 7007 | |
| Gibco PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Gibco Trypsin-EDTA (0.5%) | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
| Forma Series II 3110 Water-Jacketed CO2 Incubators | Thermo Fisher Scientific | 3120 | |
| Gloves | VWR | 89428-750 | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793 | |
| Transfer pipets | Globe Scientific | 138080 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 R | To centrifuge the 15 mL tube |
| Centrifuge | NUAIRE | AWEL CF 48-R | To centrifuge the 96-well plate |
| Microscope | Olympus | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Histology & IHC | |||
| Digital slide scanner | Leica | Aperio AT2 | Obtain high-resolution histological images |
| Histology Service | Histowiz | Request service for histological and immunohistological staining of tumor spheroid | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| List of Commerical OCTs | |||
| SD-OCT system | Thorlabs | Telesto Series | |
| SD-OCT system | Wasatch Photonics | WP OCT 1300 nm | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software for Data Analyses | |||
| Basic Image Analysis | NIH | ImageJ | Fiji also works. |
| 3D Rendering | Thermo Fisher Scientific | Amira | Commercial software. Option 1 |
| 3D Rendering | Bitplane | Imaris | Commercial software. Option 2. Used in the protocol |
| OCT acquisition software | custom developed in C++. | ||
| Stage Control | Beijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd. | MRC_3 | Incorporated into the custom OCT acquisition code |
| OCT processing software | custom developed in C++. Utilize GPU. Incorporated into the custom OCT acquisition code. | ||
| Morphological and Physiological Analysis | custom developed in MATLAB |
Riferimenti
- Kola, I., Landis, J. Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates?. Nature Reviews Drug Discovery. 3 (8), 711-716 (2004).
- Breslin, S., O’Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18, 240-249 (2013).
- Hickman, J. A., et al. Three-dimensional models of cancer for pharmacology and cancer cell biology: Capturing tumor complexity in vitro/ex vivo. Biotechnology Journal. 9 (9), 1115-1128 (2014).
- Sutherland, R. M. Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model. Science. 240 (4849), 177-184 (1988).
- Mueller-Klieser, W. Three-dimensional cell cultures: from molecular mechanisms to clinical applications. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 273, C1109-C1123 (1997).
- Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach. Nature Protocols. 4 (3), 309-324 (2009).
- Tung, Y. -. C., et al. High-throughput 3D spheroid culture and drug testing using a 384 hanging drop array. The Analyst. 136 (3), 473-478 (2011).
- Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC biology. 10, 29 (2012).
- LaBarbera, D. V., Reid, B. G., Yoo, B. H. The multicellular tumor spheroid model for high-throughput cancer drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 7, 819-830 (2012).
- Pampaloni, F., Ansari, N., Stelzer, E. H. K. High-resolution deep imaging of live cellular spheroids with light-sheet-based fluorescence microscopy. Cell and Tissue Research. 352, 161-177 (2013).
- Lovitt, C. J., Shelper, T. B., Avery, V. M. Miniaturized three-dimensional cancer model for drug evaluation. Assay and Drug Development Technologies. 11 (7), 435-448 (2013).
- Wenzel, C., et al. 3D high-content screening for the identification of compounds that target cells in dormant tumor spheroid regions. Experimental Cell Research. 323 (1), 131-143 (2014).
- Astashkina, A., Grainger, D. W. Critical analysis of 3-D organoid in vitro cell culture models for high-throughput drug candidate toxicity assessments. Innovative tissue models for drug discovery and development. 69, 1-18 (2014).
- Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
- Gong, X., et al. Generation of multicellular tumor spheroids with microwell-based agarose scaffolds for drug testing. PLoS ONE. 10 (6), e0130348 (2015).
- Hoffmann, O. I., et al. Impact of the spheroid model complexity on drug response. Journal of biotechnology. 205, 14-23 (2015).
- Martinez, N. J., Titus, S. A., Wagner, A. K., Simeonov, A. High-throughput fluorescence imaging approaches for drug discovery using in vitroand in vivothree-dimensional models. Expert Opinion on Drug Discovery. 10, 1347-1361 (2015).
- Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacology, Therapeutics. 163, 94-108 (2016).
- Li, L., Zhou, Q., Voss, T. C., Quick, K. L., LaBarbera, D. V. High-throughput imaging: Focusing in on drug discovery in 3D. Methods. 96, 97-102 (2016).
- Ham, S. L., Joshi, R., Thakuri, P. S., Tavana, H. Liquid-based three-dimensional tumor models for cancer research and drug discovery. Experimental Biology and Medicine. 241 (9), 939-954 (2016).
- Kessel, S., et al. High-Throughput 3D Tumor Spheroid Screening Method for Cancer Drug Discovery Using Celigo Image Cytometry. Journal of Laboratory Automation. , 2211068216652846 (2016).
- Stock, K., et al. Capturing tumor complexity in vitro: Comparative analysis of 2D and 3D tumor models for drug discovery. Scientific Reports. 6, 28951 (2016).
- Thakuri, P. S., Ham, S. L., Luker, G. D., Tavana, H. Multiparametric analysis of oncology drug screening with aqueous two-phase tumor spheroids. Molecular Pharmaceutics. 13 (11), 3724-3735 (2016).
- Lin, R. Z., Chang, H. Y. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research. Biotechnology Journal. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).
- Piccinini, F., Tesei, A., Arienti, C., Bevilacqua, A. Cancer multicellular spheroids: Volume assessment from a single 2D projection. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 118 (2), 95-106 (2015).
- Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Scientific Reports. 6, 19103 (2016).
- Debnath, J., Brugge, J. S. Modelling glandular epithelial cancers in three-dimensional cultures. Nature Reviews Cancer. 5 (9), 675-688 (2005).
- Huang, D., et al. Optical coherence tomography. Science. 254 (5035), 1178-1181 (1991).
- Drexler, W., et al. Optical coherence tomography today: speed, contrast, and multimodality. Journal of Biomedical Optics. 19 (7), 071412 (2014).
- Fujimoto, J., Swanson, E. The development, commercialization, and impact of optical coherence tomography. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 57 (9), (2016).
- Vakoc, B. J., Fukumura, D., Jain, R. K., Bouma, B. E. Cancer imaging by optical coherence tomography: preclinical progress and clinical potential. Nature Reviews Cancer. 12 (5), 363-368 (2012).
- Wojtkowski, M. High-speed optical coherence tomography: basics and applications. Applied optics. 49 (16), D30-D61 (2010).
- Drexler, W., Fujimoto, J. G. . Optical coherence tomography: technology and applications. , (2008).
- Geitzenauer, W., Hitzenberger, C. K., Schmidt-Erfurth, U. M. Retinal optical coherence tomography: past, present and future perspectives. British Journal of Ophthalmology. 95 (2), 171 (2011).
- Sakata, L. M., DeLeon-Ortega, J., Sakata, V., Girkin, C. A. Optical coherence tomography of the retina and optic nerve – a review. Clinical, Experimental Ophthalmology. 37 (1), 90-99 (2009).
- van Velthoven, M. E. J., Faber, D. J., Verbraak, F. D., van Leeuwen, T. G., de Smet, M. D. Recent developments in optical coherence tomography for imaging the retina. Progress in Retinal and Eye Research. 26 (1), 57-77 (2007).
- Kashani, A. H., et al. Optical coherence tomography angiography: A comprehensive review of current methods and clinical applications. Progress in Retinal and Eye Research. 60, 66-100 (2017).
- de Carlo, T. E., Romano, A., Waheed, N. K., Duker, J. S. A review of optical coherence tomography angiography (OCTA). International Journal of Retina and Vitreous. 1 (1), 5 (2015).
- Sharma, M., Verma, Y., Rao, K. D., Nair, R., Gupta, P. K. Imaging growth dynamics of tumour spheroids using optical coherence tomography. Biotechnology Letters. 29 (2), 273-278 (2006).
- Jung, Y., Nichols, A. J., Klein, O. J., Roussakis, E., Evans, C. L. Label-Free, Longitudinal Visualization of PDT Response In Vitro with Optical Coherence Tomography. Israel Journal of Chemistry. 52 (8-9), 728-744 (2012).
- Huang, Y., et al. Optical coherence tomography detects necrotic regions and volumetrically quantifies multicellular tumor spheroids. Ricerca sul cancro. 77 (21), 6011-6020 (2017).
- Spalteholz, W. . Über das Durchsightigmachen von menschlichen und tierischen Präparaten: nebst Anhang, Über Knochenfärbung. , (1911).
- Dodt, H. -. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nature Methods. 4 (4), 331 (2007).
- Leitgeb, R., Hitzenberger, C., Fercher, A. F. Performance of fourier domain vs. time domain optical coherence tomography. Optics express. 11 (8), 889-894 (2003).
- Jian, Y., Wong, K., Sarunic, M. V. . Optical Coherence Tomography and Coherence Domain Optical Methods in Biomedicine XVII. , 85710Z (2013).
- Guizar-Sicairos, M., Thurman, S. T., Fienup, J. R. Efficient subpixel image registration algorithms. Optics Letters. 33 (2), 156-158 (2008).
- Canny, J. A computational approach to edge detection. IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine Intelligence. (6), 679-698 (1986).
- Vermeer, K. A., Mo, J., Weda, J. J. A., Lemij, H. G., de Boer, J. F. Depth-resolved model-based reconstruction of attenuation coefficients in optical coherence tomography. Biomedical Optics Express. 5 (1), 322-337 (2014).
- Klein, T., et al. Multi-MHz retinal OCT. Biomedical Optics Express. 4, 1890-1908 (2013).
- Klein, T., Huber, R. High-speed OCT light sources and systems [Invited]. Biomedical Optics Express. 8 (2), 828-859 (2017).
- Zhou, C., Alex, A., Rasakanthan, J., Ma, Y. Space-division multiplexing optical coherence tomography. Optics Express. 21, 19219-19227 (2013).
