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Ricerca sul cancro

光コヒーレンストモグラフィーを用いた三次元腫瘍回転楕円体の縦断的形態学的および生理学的監視

Published: February 09, 2019
doi:
10.3791/59020
, , , , , , , , , , , , ,
1Department of Electrical and Computer Engineering,Lehigh University, 2Department of Mechanical Engineering,Lehigh University, 3Department of Biomedical Engineering,Southern University of Science and Technology, 4Department of Technology R&D,Nexcelom Bioscience LLC, 5Department of Bioengineering,Lehigh University, 6Center for Photonics and Nanoelectronics,Lehigh University

Summary

光コヒーレンストモグラフィ (OCT)、3次元イメージング技術は、監視し、腫瘍細胞スフェロイドの成長カイネティクスを特徴付ける使用されました。アプローチ、およびラベル無料死んだ組織検出光減衰のコントラストに基づく回転楕円体を数えるボクセルを用いた腫瘍回転楕円体の正確な体積の数量を示した。

Abstract

腫瘍回転楕円体は、がん研究・がん創薬における三次元 (3 D) 細胞培養モデルとして開発されています。しかし、現在、高スループットのモダリティをイメージング明るいフィールドまたは蛍光検出を利用したはない蛍光染料の拡散限られた光穿腫瘍回転楕円体の全体的な 3 D 構造を解決することができると深さ-resolvability。最近では、私たちの研究室は、光干渉断層計 (OCT)、ラベル無料、非破壊 3 D 96 ウェル プレートで腫瘍細胞スフェロイドの縦断的評価を実行するためのモダリティをイメージングの使用を認めた。10 月は約 600 μ m の高さにまで成長している腫瘍回転楕円体の 3 D の形態学的および生理学的な情報を得ることができます。この記事では、全体ウェル プレートをスキャンし、自動的に腫瘍回転楕円体の 3 D 10 月データを取得する高スループット 10 月 (HT OCT) イメージング システムを示しています。プロトコルで、HT OCT システム施工指針の詳細について述べる。3 D 10 月データから 3 D レンダリングと回転楕円体の全体的な構造を視覚化できます 1 つと直交スライス サイズとボリュームの形態学的情報に基づく腫瘍回転楕円体の縦断的成長曲線の特徴しの増加率を監視光減衰のコントラストに基づく腫瘍回転楕円体で死んだセル領域。HT 10 月を薬物スクリーニングと同様、biofabricated のサンプルの特性の高スループットのイメージ投射様相として使用できるを示します。

Introduction

がんは世界1の死の 2 番目の主要な原因です。患者のための重大な重要性の癌をターゲットとする薬剤の開発です。ただし、新しい抗がん剤の 90% 以上が臨床試験2で予期しない毒性と有効性の不足のため開発段階で失敗することが推定されます。理由の一部は、化合物のスクリーニング、医薬品探索2の次の段階の化合物の有効性と毒性の限られた予測値と結果を提供するための単純な二次元 (2 D) 細胞培養モデルの使用に帰することができます。,3,4. 近年、三次元 (3 D) 腫瘍回転楕円体モデルは抗癌性の薬剤の発見3,4,5 の臨床的に関連する生理学的および薬理学的データを提供するために開発されています。、6,7,8,9,10、11,12,13,14、 15,16,17,18,19,20,21,22,23、 24,25。以来、これらの回転楕円体は、生体内で腫瘍の組織に固有のプロパティをまねることができる、栄養や酸素など薬剤抵抗19、これらのモデルの使用と同様に、グラデーション、低酸素のコア潜在的短縮できる薬の発見のタイムライン投資のコストを削減しより効果的に患者に新しい薬をもたらします。3 D 腫瘍回転楕円体開発化合物の有効性を評価する重要な方法の 1 つは、回転楕円体の成長と治療9,26再発を監視することです。これを行うには、その直径と高解像度の画像診断装置では、ボリュームを含む腫瘍形態の定量的な特徴づけが不可欠であります。

明視野、位相コントラスト7,9,22,24, 蛍光顕微鏡8,9,16など、従来の画像診断装置 18,22回転楕円体の直径の測定を提供することができますが、3 D 空間で回転楕円体の全体的な構造を解決することはできません。多くの要因は、回転楕円体; プローブ光の浸透を含むこれらの制限に貢献します。回転楕円体に蛍光染料の拡散励起蛍光染料中または強い吸収と散乱のため回転楕円体の反対側の面からの発光の蛍光信号これらの深さ resolvability 画像診断。これは多くの場合不正確なボリューム計測に します。回転楕円体の壊死性のコアの開発は、生体内で腫瘍6,10,15,19,25で壊死を模倣します。この病理学的機能は、2 D セル文化19,25,27,28で再現可能性があります。回転楕円体サイズの 3 層の同心円構造、直径 500 μ m よりも大きい増殖細胞の外側の層、中間層休止期の細胞の壊死性コアなどで観察できる回転楕円体6,10 ,,1519,25酸素や栄養素の不足のため。ライブとデッド細胞蛍光イメージングは、壊死性のコアの境界にラベルを付ける標準的なアプローチです。しかし、再び、これらの蛍光染料と可視光の両方の侵入は、実際の形でその開発を監視する壊死性コアにプローブする可能性を妨げます。

画像モダリティ別 3 D、腫瘍スフェロイドを特徴付けるため光コヒーレンストモグラフィ (OCT) を導入します。10 月までからラベル無料、非破壊の 3 D データを取得することができる生物医学イメージングは、1-2 mm 深さ生体29,30,31,32,33 、34。10 月サンプルのさまざまな深さからの後方散乱信号を検出する低コヒーレンス干渉計を採用しています、ミクロン レベルの水平および垂直方向の空間分解能で再建された深さ分解画像を提供しています。10 月は、眼科35,36,37および血管造影38,39で広く採用されています。以前の研究では、基底膜マトリックス (例えばマトリゲル) で腫瘍を回転楕円体の in vitroの形態を観察し、光線力学療法40,41への応答を評価する 10 月を使用しています。最近では、当社グループは体系的に監視し、ウェル プレート42で 3 D の腫瘍を回転楕円体の成長カイネティクスの定量化に高スループット OCT イメージング プラットフォームを設立しました。アプローチおよび回転楕円体の光減衰のコントラストに基づくラベル無料壊死検出を数えるボクセルを用いた 3 D 腫瘍回転楕円体の正確な体積の数量を示した。本稿では、OCT イメージング プラットフォームを構築して採用腫瘍回転楕円体の高解像度の 3 D イメージを取得する方法の詳細について説明します。回転楕円体の直径およびボリュームの正確な測定を含む 3 D 腫瘍の回転楕円体の成長カイネティクスのステップバイ ステップによる定量的評価を説明します。また、光減衰コントラストに基づいて、OCT を使用して壊死領域の非破壊検出の手法を提案します。

Protocol

1. 細胞の調製 修飾されたサプライヤーからのセルの行を取得します。注: は、文化メディアや基板 (マトリゲルのような基底膜マトリックス) の助けを借りて興味の細胞からの細胞は、回転楕円体を形成できることを確認します。文献9に見たり、チェックのため予備実験の 1 つのラウンドを実行します。 凍結細胞の細胞ラインのサプライヤーによって提供?…

Representative Results

96 ウェル プレートに回転楕円体の高スループット光干渉断層イメージング 図 3は、HT 10 月の 3 日目の HCT 116 腫瘍スフェロイドの 96 ウェル プレートのスキャンの結果を展示します。全体の板の逐次スキャンを右下の井戸 (H12) から開始します。図 3 bは、HT OCT システムのソフトウェ…

Discussion

腫瘍の活動は、その形態学的構造に関連性の高いです。2 D 細胞培養の特徴的な成長曲線を監視と同様に、3 D 腫瘍回転楕円体の成長曲線を追跡もです長期的な回転楕円体細胞進展挙動を特徴付けるための従来のアプローチ特に、我々 は腫瘍の低下や腫瘍の再成長成長曲線に直接反映を分析することによって薬剤反応を特徴付けることができます。したがって、腫瘍の 3 D 回転楕円体、サイズ?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は、NSF によって支えられた IDBR (DBI-1455613)、PFI:AIR を付与-TT (IIP-1640707)、NIH 助成 R21EY026380、R15EB019704、R01EB025209、およびリーハイ大学スタートアップ基金。

Materials

Custom Spectral Domain OCT imaging system Developed in our lab
Superluminescent Diode (SLD) Thorlabs SLD1325 light source
2×2 single mode fused fiber coupler, 50:50 splitting ratio AC Photonics WP13500202B201
Reference Arm
Lens Tube Thorlabs
Adapter Thorlabs
Collimating Lens Thorlabs AC080-020-C
Focusing Lens Thorlabs
Kinematic Mirror Mount Thorlabs
Mirror Thorlabs
1D Translational Stage Thorlabs
Continuous neutral density filter Thorlabs
Pedestrial Post Thorlabs
Clamping Fork Thorlabs
Sample Arm
Lens Tube Thorlabs
Adapter Thorlabs
Collimating Lens Thorlabs AC080-020-C
Galvanometer Thorlabs
Relay Lens Thorlabs AC254-100-C two Relay lens to make a telescope setup
Triangle Mirror Mount Thorlabs
Mirror Thorlabs
Objective Mitutoyo
Pedestrial Post Thorlabs
Clamping Fork Thorlabs
Polarization Controller Thorlabs
30mm Cage Mount Thorlabs
Cage Rod Thorlabs
Stage
3D motorized translation stage Beijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd. JTH360XY
2D Tilting Stage
Rotation Stage
Plate Holder 3D printed
Spectrometer
Lens Tube Thorlabs
Adapter Thorlabs
Collimating Lens Thorlabs AC080-020-C
Grating Wasatch G = 1145 lpmm
F-theta Lens Thorlabs FTH-1064-100
InGaAs Line-scan Camera Sensor Unlimited SU1024-LDH2
Name Company Catalog Number Comments
Cell Culture Component
HCT 116 Cell line ATCC CCL-247
Cell Culture Flask SPL Life Sciences 70025
Pipette Fisherbrand 14388100
Pipette tips Sorenson Bioscience 10340
Gibco GlutaMax DMEM Thermo Fisher Scientific 10569044
Fetal Bovine Serum, certified, US origin Thermo Fisher Scientific 16000044
Antibiotic-Antimycotic (100X) Thermo Fisher Scientific 15240062
Corning 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate Corning 7007
Gibco PBS, pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010023
Gibco Trypsin-EDTA (0.5%) Thermo Fisher Scientific 15400054
Forma Series II 3110 Water-Jacketed CO2 Incubators Thermo Fisher Scientific 3120
Gloves VWR 89428-750
Parafilm Sigma-Aldrich P7793
Transfer pipets Globe Scientific 138080
Centrifuge Eppendorf 5702 R To centrifuge the 15 mL tube
Centrifuge NUAIRE AWEL CF 48-R To centrifuge the 96-well plate
Microscope Olympus
Name Company Catalog Number Comments
Histology & IHC
Digital slide scanner Leica Aperio AT2 Obtain high-resolution histological images
Histology Service Histowiz Request service for histological and immunohistological staining of tumor spheroid
Name Company Catalog Number Comments
List of Commerical OCTs
SD-OCT system Thorlabs Telesto Series
SD-OCT system Wasatch Photonics WP OCT 1300 nm
Name Company Catalog Number Comments
Software for Data Analyses
Basic Image Analysis NIH ImageJ Fiji also works.
3D Rendering Thermo Fisher Scientific Amira Commercial software. Option 1
3D Rendering Bitplane Imaris Commercial software. Option 2. Used in the protocol
OCT acquisition software custom developed in C++.
Stage Control Beijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd. MRC_3 Incorporated into the custom OCT acquisition code
OCT processing software custom developed in C++. Utilize GPU. Incorporated into the custom OCT acquisition code.
Morphological and Physiological Analysis custom developed in MATLAB

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Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Huang, Y., Zou, J., Badar, M., Liu, J., Shi, W., Wang, S., Guo, Q., Wang, X., Kessel, S., Chan, L. L., Li, P., Liu, Y., Qiu, J., Zhou, C. Longitudinal Morphological and Physiological Monitoring of Three-dimensional Tumor Spheroids Using Optical Coherence Tomography. J. Vis. Exp. (144), e59020, doi:10.3791/59020 (2019).
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