光コヒーレンストモグラフィ (OCT)、3次元イメージング技術は、監視し、腫瘍細胞スフェロイドの成長カイネティクスを特徴付ける使用されました。アプローチ、およびラベル無料死んだ組織検出光減衰のコントラストに基づく回転楕円体を数えるボクセルを用いた腫瘍回転楕円体の正確な体積の数量を示した。
腫瘍回転楕円体は、がん研究・がん創薬における三次元 (3 D) 細胞培養モデルとして開発されています。しかし、現在、高スループットのモダリティをイメージング明るいフィールドまたは蛍光検出を利用したはない蛍光染料の拡散限られた光穿腫瘍回転楕円体の全体的な 3 D 構造を解決することができると深さ-resolvability。最近では、私たちの研究室は、光干渉断層計 (OCT)、ラベル無料、非破壊 3 D 96 ウェル プレートで腫瘍細胞スフェロイドの縦断的評価を実行するためのモダリティをイメージングの使用を認めた。10 月は約 600 μ m の高さにまで成長している腫瘍回転楕円体の 3 D の形態学的および生理学的な情報を得ることができます。この記事では、全体ウェル プレートをスキャンし、自動的に腫瘍回転楕円体の 3 D 10 月データを取得する高スループット 10 月 (HT OCT) イメージング システムを示しています。プロトコルで、HT OCT システム施工指針の詳細について述べる。3 D 10 月データから 3 D レンダリングと回転楕円体の全体的な構造を視覚化できます 1 つと直交スライス サイズとボリュームの形態学的情報に基づく腫瘍回転楕円体の縦断的成長曲線の特徴しの増加率を監視光減衰のコントラストに基づく腫瘍回転楕円体で死んだセル領域。HT 10 月を薬物スクリーニングと同様、biofabricated のサンプルの特性の高スループットのイメージ投射様相として使用できるを示します。
がんは世界1の死の 2 番目の主要な原因です。患者のための重大な重要性の癌をターゲットとする薬剤の開発です。ただし、新しい抗がん剤の 90% 以上が臨床試験2で予期しない毒性と有効性の不足のため開発段階で失敗することが推定されます。理由の一部は、化合物のスクリーニング、医薬品探索2の次の段階の化合物の有効性と毒性の限られた予測値と結果を提供するための単純な二次元 (2 D) 細胞培養モデルの使用に帰することができます。,3,4. 近年、三次元 (3 D) 腫瘍回転楕円体モデルは抗癌性の薬剤の発見3,4,5 の臨床的に関連する生理学的および薬理学的データを提供するために開発されています。、6,7,8,9,10、11,12,13,14、 15,16,17,18,19,20,21,22,23、 24,25。以来、これらの回転楕円体は、生体内で腫瘍の組織に固有のプロパティをまねることができる、栄養や酸素など薬剤抵抗19、これらのモデルの使用と同様に、グラデーション、低酸素のコア潜在的短縮できる薬の発見のタイムライン投資のコストを削減しより効果的に患者に新しい薬をもたらします。3 D 腫瘍回転楕円体開発化合物の有効性を評価する重要な方法の 1 つは、回転楕円体の成長と治療9,26再発を監視することです。これを行うには、その直径と高解像度の画像診断装置では、ボリュームを含む腫瘍形態の定量的な特徴づけが不可欠であります。
明視野、位相コントラスト7,9,22,24, 蛍光顕微鏡8,9,16など、従来の画像診断装置 18,22回転楕円体の直径の測定を提供することができますが、3 D 空間で回転楕円体の全体的な構造を解決することはできません。多くの要因は、回転楕円体; プローブ光の浸透を含むこれらの制限に貢献します。回転楕円体に蛍光染料の拡散励起蛍光染料中または強い吸収と散乱のため回転楕円体の反対側の面からの発光の蛍光信号これらの深さ resolvability 画像診断。これは多くの場合不正確なボリューム計測に します。回転楕円体の壊死性のコアの開発は、生体内で腫瘍6,10,15,19,25で壊死を模倣します。この病理学的機能は、2 D セル文化19,25,27,28で再現可能性があります。回転楕円体サイズの 3 層の同心円構造、直径 500 μ m よりも大きい増殖細胞の外側の層、中間層休止期の細胞の壊死性コアなどで観察できる回転楕円体6,10 ,,1519,25酸素や栄養素の不足のため。ライブとデッド細胞蛍光イメージングは、壊死性のコアの境界にラベルを付ける標準的なアプローチです。しかし、再び、これらの蛍光染料と可視光の両方の侵入は、実際の形でその開発を監視する壊死性コアにプローブする可能性を妨げます。
画像モダリティ別 3 D、腫瘍スフェロイドを特徴付けるため光コヒーレンストモグラフィ (OCT) を導入します。10 月までからラベル無料、非破壊の 3 D データを取得することができる生物医学イメージングは、1-2 mm 深さ生体29,30,31,32,33 、34。10 月サンプルのさまざまな深さからの後方散乱信号を検出する低コヒーレンス干渉計を採用しています、ミクロン レベルの水平および垂直方向の空間分解能で再建された深さ分解画像を提供しています。10 月は、眼科35,36,37および血管造影38,39で広く採用されています。以前の研究では、基底膜マトリックス (例えばマトリゲル) で腫瘍を回転楕円体の in vitroの形態を観察し、光線力学療法40,41への応答を評価する 10 月を使用しています。最近では、当社グループは体系的に監視し、ウェル プレート42で 3 D の腫瘍を回転楕円体の成長カイネティクスの定量化に高スループット OCT イメージング プラットフォームを設立しました。アプローチおよび回転楕円体の光減衰のコントラストに基づくラベル無料壊死検出を数えるボクセルを用いた 3 D 腫瘍回転楕円体の正確な体積の数量を示した。本稿では、OCT イメージング プラットフォームを構築して採用腫瘍回転楕円体の高解像度の 3 D イメージを取得する方法の詳細について説明します。回転楕円体の直径およびボリュームの正確な測定を含む 3 D 腫瘍の回転楕円体の成長カイネティクスのステップバイ ステップによる定量的評価を説明します。また、光減衰コントラストに基づいて、OCT を使用して壊死領域の非破壊検出の手法を提案します。
腫瘍の活動は、その形態学的構造に関連性の高いです。2 D 細胞培養の特徴的な成長曲線を監視と同様に、3 D 腫瘍回転楕円体の成長曲線を追跡もです長期的な回転楕円体細胞進展挙動を特徴付けるための従来のアプローチ特に、我々 は腫瘍の低下や腫瘍の再成長成長曲線に直接反映を分析することによって薬剤反応を特徴付けることができます。したがって、腫瘍の 3 D 回転楕円体、サイズ?…
The authors have nothing to disclose.
この作品は、NSF によって支えられた IDBR (DBI-1455613)、PFI:AIR を付与-TT (IIP-1640707)、NIH 助成 R21EY026380、R15EB019704、R01EB025209、およびリーハイ大学スタートアップ基金。
Custom Spectral Domain OCT imaging system | Developed in our lab | ||
Superluminescent Diode (SLD) | Thorlabs | SLD1325 | light source |
2×2 single mode fused fiber coupler, 50:50 splitting ratio | AC Photonics | WP13500202B201 | |
Reference Arm | |||
Lens Tube | Thorlabs | ||
Adapter | Thorlabs | ||
Collimating Lens | Thorlabs | AC080-020-C | |
Focusing Lens | Thorlabs | ||
Kinematic Mirror Mount | Thorlabs | ||
Mirror | Thorlabs | ||
1D Translational Stage | Thorlabs | ||
Continuous neutral density filter | Thorlabs | ||
Pedestrial Post | Thorlabs | ||
Clamping Fork | Thorlabs | ||
Sample Arm | |||
Lens Tube | Thorlabs | ||
Adapter | Thorlabs | ||
Collimating Lens | Thorlabs | AC080-020-C | |
Galvanometer | Thorlabs | ||
Relay Lens | Thorlabs | AC254-100-C | two Relay lens to make a telescope setup |
Triangle Mirror Mount | Thorlabs | ||
Mirror | Thorlabs | ||
Objective | Mitutoyo | ||
Pedestrial Post | Thorlabs | ||
Clamping Fork | Thorlabs | ||
Polarization Controller | Thorlabs | ||
30mm Cage Mount | Thorlabs | ||
Cage Rod | Thorlabs | ||
Stage | |||
3D motorized translation stage | Beijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd. | JTH360XY | |
2D Tilting Stage | |||
Rotation Stage | |||
Plate Holder | 3D printed | ||
Spectrometer | |||
Lens Tube | Thorlabs | ||
Adapter | Thorlabs | ||
Collimating Lens | Thorlabs | AC080-020-C | |
Grating | Wasatch | G = 1145 lpmm | |
F-theta Lens | Thorlabs | FTH-1064-100 | |
InGaAs Line-scan Camera | Sensor Unlimited | SU1024-LDH2 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Cell Culture Component | |||
HCT 116 Cell line | ATCC | CCL-247 | |
Cell Culture Flask | SPL Life Sciences | 70025 | |
Pipette | Fisherbrand | 14388100 | |
Pipette tips | Sorenson Bioscience | 10340 | |
Gibco GlutaMax DMEM | Thermo Fisher Scientific | 10569044 | |
Fetal Bovine Serum, certified, US origin | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
Antibiotic-Antimycotic (100X) | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
Corning 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate | Corning | 7007 | |
Gibco PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
Gibco Trypsin-EDTA (0.5%) | Thermo Fisher Scientific | 15400054 | |
Forma Series II 3110 Water-Jacketed CO2 Incubators | Thermo Fisher Scientific | 3120 | |
Gloves | VWR | 89428-750 | |
Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793 | |
Transfer pipets | Globe Scientific | 138080 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5702 R | To centrifuge the 15 mL tube |
Centrifuge | NUAIRE | AWEL CF 48-R | To centrifuge the 96-well plate |
Microscope | Olympus | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Histology & IHC | |||
Digital slide scanner | Leica | Aperio AT2 | Obtain high-resolution histological images |
Histology Service | Histowiz | Request service for histological and immunohistological staining of tumor spheroid | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
List of Commerical OCTs | |||
SD-OCT system | Thorlabs | Telesto Series | |
SD-OCT system | Wasatch Photonics | WP OCT 1300 nm | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software for Data Analyses | |||
Basic Image Analysis | NIH | ImageJ | Fiji also works. |
3D Rendering | Thermo Fisher Scientific | Amira | Commercial software. Option 1 |
3D Rendering | Bitplane | Imaris | Commercial software. Option 2. Used in the protocol |
OCT acquisition software | custom developed in C++. | ||
Stage Control | Beijing Mao Feng Optoelectronics Technology Co., Ltd. | MRC_3 | Incorporated into the custom OCT acquisition code |
OCT processing software | custom developed in C++. Utilize GPU. Incorporated into the custom OCT acquisition code. | ||
Morphological and Physiological Analysis | custom developed in MATLAB |