التحليل الكمي لتكوينها الخلوي في الآفات تصلب الشرايين المتقدمة للعضلات الملساء خلية تتبع النسب الفئران
Summary
ونحن نقترح بروتوكول موحد لوصف تكوين الخلوية أواخر المرحلة مورين الآفات تصلب الشرايين بما في ذلك أساليب منهجية لتشريح الحيوان وتضمين الأنسجة، وتمزيقها، وتلطيخ، وتحليل الشرايين براتشيوسيفاليك من العضلات الملساء أثيروبروني خلية تتبع النسب الفئران.
Abstract
تصلب الشرايين ويظل السبب الرئيسي للوفاة في العالم، وعلى الرغم من عدد لا يحصى من الدراسات الإكلينيكية تصف الأهداف العلاجية الواعدة، التدخلات رواية ظل بعيد المنال. هذا المرجح يرجع، جزئيا، إلى اعتماد على نماذج السريرية منع التحقيق في آثار التلاعبات الجينية أو العلاجات الدوائية في تطوير تصلب الشرايين بدلاً من هذا المرض الراسخة. أيضا، ونتائج هذه الدراسات غالباً التباس بسبب استخدام تحليلات سطحية الآفة وعدم وجود توصيف الآفة خلية السكان. للمساعدة في التغلب على هذه العقبات متعدية الجنسيات، ونقترح زيادة اعتماد على نماذج التدخل التي توظف تحقيق تغيرات في التركيبة الخلوية على مستوى خلية واحدة تلطيخ إيممونوفلوريسسينت والفحص المجهري [كنفوكل]. وتحقيقا لهذه الغاية، نحن وصف بروتوكول لاختبار عامل علاجية المفترضة في نموذج تدخل مورين بما في ذلك اتباع نهج منتظم لتشريح الحيوان والتضمين، وتمزيقها، وتلطيخ والتحديد الكمي لآفات الشريان براتشيوسيفاليك. وبالإضافة إلى ذلك، نظراً لتنوع المظهرية من الخلايا ضمن المرحلة المتأخرة آفات تصلب الشرايين، يصف لنا أهمية استخدام النسب الخاصة بالخلية، إيندوسيبلي تتبع الماوس أنظمة وكيف هذا يمكن الاستدانة لتوصيف غير منحازة السكان خلية الآفة تصلب الشرايين. معا، هذه الاستراتيجيات يمكن أن تساعد علماء الأحياء والأوعية الدموية أكثر دقة نموذج التدخلات العلاجية وتحليل مرض تصلب الشرايين، ونأمل أن يترجم إلى ارتفاع معدل النجاح في التجارب السريرية.
Introduction
تصلب الشرايين هو السبب الرئيسي للاعتلال والوفيات في جميع أنحاء العالم الكامنة وراء الغالبية من مرض الشريان التاجي، وأمراض الشرايين، والسكتة الدماغية. تصلب الشرايين التاجية المرحلة المتأخرة يمكن أن يؤدي إلى مضاعفات خطيرة، بما في ذلك المحاسبة مخالفة احتشاء عضلة القلب لما يقرب من 16 في المائة من العالم السكان وفيات1،2. نظراً لتأثيرها المدمر على الصحة العامة، بذلت جهود كبيرة فك آليات القيادة تطور تصلب الشرايين، كذلك فيما يتعلق بوضع استراتيجيات علاجية جديدة. حتى الآن، أن معدل احتمال الموافقة (لوا) للتجارب السريرية لأمراض القلب والأوعية الدموية بين أدنى بالمقارنة مع غيرها من المجالات السريرية (فقط 8.7 في المائة للمرحلة الأولى)3. ويمكن تفسير ذلك جزئيا بالعديد من الحواجز أن تصلب الشرايين يطرح لتطوير الأدوية فعالة بما في ذلك طبيعتها تقريبا في كل مكان والتقدم صامتة سريرياً، والتغاير المرض كبيرة. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يعزى التصميم الأمثل للدراسات السريرية على الحيوانات أيضا لعدم النجاح في الترجمة السريرية. على وجه التحديد، ونحن نعتقد أنه من الضروري تنفيذ دراسات التدخل كلما كان ذلك ممكناً للتحقيق في مدى فعالية الاستراتيجيات العلاجية. كما أن هناك حاجة ماسة إلى القيام بإجراءات موحدة لتحليلات الآفة بما في ذلك توصيف متقدمة لتكوين الخلوية أواخر المرحلة تصلب الشرايين الآفة قبل تحديد مصير و phenotyping.
الغالبية العظمى من تصلب الشرايين دراسات تركز على نماذج لمنع تصلب الشرايين تتكون من المخدرات العلاج أو الجينات التلاعب (خروج المغلوب أو طريقة الكبس) في الفئران الصغار صحية، قبل بدء المرض والتقدم. وقد كشفت هذه الدراسات عدد كبير من الجينات والجزيئات مما يشير إلى أن تلعب دوراً في تطور تصلب الشرايين. ومع ذلك، فشل في معظم هذه الأهداف ترجمة للعلاجات الفعالة في الإنسان. والواقع أن من الصعب استقراء أثر علاج على الفئران الصغار صحية لكبار السن من المرضى الذين يعانون من آفات تصلب الشرايين المتقدمة. على هذا النحو، يوفر تنفيذ دراسات تدخل في خط الأنابيب التجريبي السريري المحتمل تصوير أكثر دقة لمدى أهمية وفعالية جديدة العلاجية. يدعم الفكرة آثار تباين لافت للنظر التي تعوق سيتوكين برو التحريضية انترلوكين-1β (إيل-1β) عند استخدام منع4،،من56 أو تدخل استراتيجية7. الاختلافات بين الوقاية والتدخل الدراسات تشير إلى أن العمليات الخلوية المختلفة تحدث في مراحل مختلفة من التنمية تصلب الشرايين، ويسلط الضوء على حقيقة أن دراسات الوقاية من المحتمل غير كافية لنموذج سيناريو السريري على نحو كاف.
جمعية القلب الأمريكية مؤخرا بنشر بيان علمية تفاصيل توصيات للتصميم التجريبي السليم وتوحيد الإجراءات، والتحليل والإبلاغ عن تصلب الشرايين الحيوان الدراسات8. أنه يسلط الضوء على فوائد وتقييدات الغالبة التقنيات المستخدمة في هذا المجال. على سبيل المثال، الوجه أون تلطيخ “السودان الرابع” من الشريان الاورطي يتم إجراء غالباً كقراءة أولى. على الرغم من en الوجه “الرابع السودان” تلطيخ ترسب الدهن طريقة مناسبة لتقييم عبء البلاك العالمية، أنه غير قادر على تمييز الآفات الانتصارات الدهنية في مرحلة مبكرة من آفات أواخر مرحلة أكثر تقدما. على هذا النحو، تفسير تلطيخ الوجه أون من الأحيان غامضة وسطحية9. تحليل دقيق من الأنسجة توفر المقاطع العرضية باستخدام معلمات مورفولوجك حجم السفينة والآفة، والتجويف والتحديد الكمي لمؤشرات الاستقرار الآفة إلى فهم أدق لتأثير تجربة.
وأخيراً، دراسات الأنسجة البشرية اقترح أن تكوين الخلوية مؤشرا أفضل لتمزق من حجم الآفة نفسها، مع الأغنياء في الضامة يجري أكثر عرضه لتمزق10، والفقراء الآفات في خلايا العضلات الملساء (SMC) 11. كانت هذه الملاحظات تستند إلى تلطيخ للعلامات المستخدمة تقليديا لتحديد الخلية (أي، ACTA2 SMC و LGALS3 أو CD68 الضامة). ومع ذلك، التعبير عن هذه العلامات غير مقيد تماما إلى نوع خلية مفردة في الآفات تصلب الشرايين سبب اللدونة الأنساب متعددة بما في ذلك SMC وخلايا بطانية وخلايا النقوي12. على وجه الخصوص، لا لبس فيها SMC داخل الآفة تصلب الشرايين وكان تحديد يكاد يكون من المستحيل حتى العقد الماضي بسبب الخاصية هذه الخلايا إلى ديديفيرينتياتي وقمع جيناتها العلامة الخاصة بالنسب (عملية يشار التبديل بين المظهرية) في السفن المتضررة أو المريضة13. وقد تم الالتفاف حول هذا القيد في تعريف SMC بوضع النسب التتبع7،14،15،16،،من1718، 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24-وهو يتألف من وضع العلامات بشكل دائم SMC وذرياتهم تتبع مصير وتطور المظهرية أثناء تطور تصلب الشرايين باستخدام مزيج من التعبير عن ريكومبيناسي لجنة المساواة العرقية التي يقودها المروجين SMC محددة (أي، Myh117،17،15،18،20،،من1921،،من2223 , 24،25، Acta226 و، SM22α14،16) والتنشيط للصحفيين (مثل البروتينات الفلورية، β-جالاكتوسيداسي) [استعرض في بينتزون وماجيسكي 27من 2018]. في واحدة من أولى الدراسات التي تستخدم تتبع النسب SMC خارج الإعداد امبريوجينيسيس، قدم سبير et al.14 أن SMC يمكن أن تعدل عن النمط الظاهري وترانسديفيرينتياتي إلى خلايا تشوندروجينيك أثناء تكلس الأوعية الدموية باستخدام الأدلة نموذج تتبع نسب “العرقية R26R لاكز” SM22α . على الرغم من أن هذه الدراسات كانت رائدة تتبع النسب SMC، كانوا جزئيا لبس في ذلك سوف يكون المسمى SM22α وإذ تعرب عن أي معطى غير SMC في الإعداد لهذا المرض حسب المراسل. قد تم تجاوز هذا الحد بتطوير واستخدام لجنة المساواة العرقية تاموكسيفين إيندوسيبلي ERT/لوكسب يسمح عنصر تحكم الزمانية لوسم الخلية. تسمية الخلية يحدث حصرا أثناء الولادة تاموكسيفين وستكون مقتصرة على الخلية معربا عن المروج نوع معين خلية القيادة التعبير المكون من لجنة المساواة العرقية في وقت التعرض تاموكسيفين، وتجنب اقتفاء أثر أنواع الخلايا البديلة تفعيل لجنة المساواة العرقية في الإعداد لتطور المرض. لتتبع النسب من SMC في تصلب الشرايين، تاموكسيفين-إيندوسيبلي Myh11-Cre/ERT2 التحوير المرتبطة مع الصحفيين الفلورسنت (ايفب7،15،،من1718 , 21، متمج19،25، حلويات20،،من2223 لدراسات التوسع في الاستنساخ) أثبتت كفاءة ملحوظة وخصوصية في وسم SMC وقد استخدمت لمصير السكان SMC الخريطة في الآفات تصلب الشرايين في الدراسات التي أجريت مؤخرا. الأهم من ذلك، كشفت هذه الدراسات عن أن: 1) 80% SMC متقدمة داخل هل الآفات تصلب الشرايين لم يعرب عن أي التقليدية SMC علامات (ACTA2، MYH11) المستخدمة في التحليل إيمونوهيستولوجيكال ولذلك سيكون قد أساءوا دون تتبع النسب 17؛ 2) مجموعات فرعية SMC التعبير عن علامات لأنواع الخلايا البديلة بما في ذلك علامات بلعم أو الخلايا الجذعية الوسيطة علامات16،،من1719؛ و 3) SMC الاستثمار وتعبئة الآفة تصلب الشرايين بالتوسع في أوليجوكلونال واستنساخ SMC الاحتفاظ اللدونة للانتقال إلى فئات سكانية مختلفة فينوتيبيكالي20،23. لتلخيص، من الواضح الآن أن خلايا العضلات الملساء تنوع المظهرية ملحوظا في الآفات تصلب الشرايين ويمكن أن يكون مفيداً أو ضاراً أدوار على الآفة المرضية تبعاً لطبيعة هذه التحولات المظهرية. وتمثل هذه الاكتشافات سبيلاً علاجية جديدة رائعة لاستهداف SMC عصيدة تعزيز التحولات المظهرية في أواخر المرحلة تصلب الشرايين.
هنا، فإننا نقترح على بروتوكول موحد لتحليل المرحلة المتأخرة مورين آفات تصلب الشرايين بما في ذلك أساليب منهجية لتشريح الحيوان والتضمين وتمزيقها، وتلطيخ والتحديد الكمي لآفات الشريان براتشيوسيفاليك. لتحديد تأثير تثبيط انترلوكين-1β على مصير SMC والنمط الظاهري، قمنا باستخدام النسب SMC تتبع الذين–/– الفئران تغذت غربي لمدة 18 أسبوعا قبل تلقي حقن أسبوعية للأجسام المضادة IL1β أو مطابقة ايستب مراقبة مفتش.
Protocol
Representative Results
Discussion
وعلى الرغم من عقود من البحث والتقدم التقني في دراسة تصلب الشرايين، الحقل تاريخاً مخيبة للآمال لترجمة النتائج العلمية للعلاج السريري34،35. ويمكن تفسير هذه الظاهرة في الجزء من التناقضات في نماذج حيوانية وتصاميم تجريبية، وتحليلات للآفة. وهنا، يصف لنا أنبوب تج?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونشكر المركز “التصوير البيولوجية” (بدعم من المعهد الوطني للصحة 1S10OD019973-01) في جامعة بيتسبرغ لمساعدتها. وأيد هذا العمل التي تدعمها “منحة التنمية العلمية” وأيده 15SDG25860021 من “جمعية القلب الأمريكية” للإدارة العامة R.A.B. المعاهد الوطنية للصحة منح F30 HL136188.
Materials
| 16% Paraformaldehyde aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | RT 15710 | Tissue perfusion and fixation |
| 23G butterfly needle | Fisher | BD367342 | |
| 25G needle | Fisher | 14-821-13D | |
| A1 Confocal microscope | Nikon | Confocal microscope | |
| ACTA2-FITC antibody (mouse) | Sigma Aldrich | F3777 | Primary Antibody |
| Alexa-647 anti goat | Invitrogen | A-21447 | Secondary antibody |
| Antigen Unmasking solution, Citric acid based | Vector Labs | H-3300 | Antigen retrieval solution |
| Chow Diet | Harlan Teklad | TD.7012 | |
| Coverslip | Fisher | 12-544-14 | Any 50 x 24 mm cover glass |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | Nucleus fluorescent counterstaining |
| Donkey Alexa-488 anti-rabbit | Invitrogen | A-21206 | Secondary antibody |
| Donkey Alexa-555 anti-rat | Abcam | ab150154 | Secondary antibody |
| DPBS 10X without Calcium and Magnesium | Gibco | 14200166 | PBS for solution dilutions and washes. Dilute to 1x in deionized water |
| Embedding cassette | Fisher | 15-182-701D | |
| ETDA vacuum tube | Fisher | 02-685-2B | |
| Ethanol 200 proof | Decon | 2701 | |
| Foam pad | Fisher | 22-222-012 | |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma Aldrich | G7765 | |
| GFP antibody (goat) | abcam | ab6673 | Primary antibody |
| goat IgG control | Vector Labs | I-5000 | IgG control |
| High Fat Diet | Harlan Teklad | TD.88137 | |
| ImageJ | NIH | Computer program https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| LGALS3 antibody (rat) | Cedarlane | CL8942AP | Primary antibody |
| LSM700 confocal microscope | Zeiss | Confocal microscope | |
| Microscope Slides, Superfrost Plus | Fisher | 12-550-15 | |
| Microtome blades | Fisher | 30-538-35 | |
| Mouse IgG control | Vector Labs | I-2000 | IgG control |
| NIS element imaging software | Nikon | Imaging software for z-stack image acquisition | |
| Normal Horse serum | Sigma Aldrich | H1270 | |
| Pap Pen | Fisher | 50-550-221 | |
| Peanut oil | Sigma | P2144 | |
| Prolong gold Antifade mountant | Invitrogen | P36930 | Mounting medium |
| Rabbit IgG control | Vector Labs | I-1000 | IgG control |
| Rat IgG control | Vector Labs | I-4000 | IgG control |
| RUNX2 antibody (rabbit) | Abcam | ab192256 | Primary Antibody |
| Syringe | BD | 309628 | 1 ml syringe |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Xylene | Fisher | X55K-4 | |
| Zen imaging software | Zeiss | Imaging software for z-stack image acquisition |
Riferimenti
- GBD DALYs and HALE Collaborators. Global, regional, and national disability-adjusted life-years (DALYs) for 315 diseases and injuries and healthy life expectancy (HALE), 1990-2015: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2015. Lancet. 388 (10053), 1603-1658 (2016).
- Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2018 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 137 (12), 67-92 (2018).
- Hay, M., Thomas, D. W., Craighead, J. L., Economides, C., Rosenthal, J. Clinical development success rates for investigational drugs. Nature Biotechnology. 32 (1), 40-51 (2014).
- Bhaskar, V., et al. Monoclonal antibodies targeting IL-1 beta reduce biomarkers of atherosclerosis in vitro and inhibit atherosclerotic plaque formation in Apolipoprotein E-deficient mice. Atherosclerosis. 216 (2), 313-320 (2011).
- Isoda, K., et al. Lack of interleukin-1 receptor antagonist modulates plaque composition in apolipoprotein E-deficient mice. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 24 (6), 1068-1073 (2004).
- Kirii, H., et al. Lack of interleukin-1beta decreases the severity of atherosclerosis in ApoE-deficient mice. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 23 (4), 656-660 (2003).
- Gomez, D., et al. Interleukin-1β has atheroprotective effects in advanced atherosclerotic lesions of mice. Nature Medicine. 24, 1418-1429 (2018).
- Daugherty, A., et al. Recommendation on Design, Execution, and Reporting of Animal Atherosclerosis Studies: A Scientific Statement From the American Heart Association. Circulation Research. 121 (6), 53-79 (2017).
- Baylis, R. A., Gomez, D., Owens, G. K. Shifting the Focus of Preclinical, Murine Atherosclerosis Studies From Prevention to Late-Stage Intervention. Circulation Research. 120 (5), 775-777 (2017).
- Kolodgie, F. D., et al. Pathologic assessment of the vulnerable human coronary plaque. Heart. 90 (12), 1385-1391 (2004).
- Virmani, R., Kolodgie, F. D., Burke, A. P., Farb, A., Schwartz, S. M. Lessons from sudden coronary death: a comprehensive morphological classification scheme for atherosclerotic lesions. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 20 (5), 1262-1275 (2000).
- Gomez, D., Owens, G. K. Smooth muscle cell phenotypic switching in atherosclerosis. Cardiovascular Research. 95 (2), 156-164 (2012).
- Owens, G. K., Kumar, M. S., Wamhoff, B. R. Molecular regulation of vascular smooth muscle cell differentiation in development and disease. Physiological Reviews. 84 (3), 767-801 (2004).
- Speer, M. Y., et al. Smooth muscle cells give rise to osteochondrogenic precursors and chondrocytes in calcifying arteries. Circulation Research. 104 (6), 733-741 (2009).
- Gomez, D., Shankman, L. S., Nguyen, A. T., Owens, G. K. Detection of histone modifications at specific gene loci in single cells in histological sections. Nature Methods. 10 (2), 171-177 (2013).
- Feil, S., et al. Transdifferentiation of vascular smooth muscle cells to macrophage-like cells during atherogenesis. Circulation Research. 115 (7), 662-667 (2014).
- Shankman, L. S., et al. KLF4-dependent phenotypic modulation of smooth muscle cells has a key role in atherosclerotic plaque pathogenesis. Nature Medicine. 21, 628 (2015).
- Cherepanova, O. A., et al. Activation of the pluripotency factor OCT4 in smooth muscle cells is atheroprotective. Nature Medicine. 22, 657 (2016).
- Albarran-Juarez, J., Kaur, H., Grimm, M., Offermanns, S., Wettschureck, N. Lineage tracing of cells involved in atherosclerosis. Atherosclerosis. 251, 445-453 (2016).
- Chappell, J., et al. Extensive Proliferation of a Subset of Differentiated, yet Plastic, Medial Vascular Smooth Muscle Cells Contributes to Neointimal Formation in Mouse Injury and Atherosclerosis Models. Circulation Research. 119 (12), 1313-1323 (2016).
- Newman, A. A., et al. Irradiation abolishes smooth muscle investment into vascular lesions in specific vascular beds. JCI Insight. 3 (15), (2018).
- Dobnikar, L., et al. Disease-relevant transcriptional signatures identified in individual smooth muscle cells from healthy mouse vessels. Nature Communications. 9 (1), 4567 (2018).
- Misra, A., et al. Integrin beta3 regulates clonality and fate of smooth muscle-derived atherosclerotic plaque cells. Nature Communications. 9 (1), 2073 (2018).
- Majesky, M. W., et al. Differentiated Smooth Muscle Cells Generate a Subpopulation of Resident Vascular Progenitor Cells in the Adventitia Regulated by Klf4. Circulation Research. 120 (2), 296-311 (2017).
- Herring, B. P., Hoggatt, A. M., Burlak, C., Offermanns, S. Previously differentiated medial vascular smooth muscle cells contribute to neointima formation following vascular injury. Vascular Cell. 6, 21 (2014).
- Sheikh, A. Q., Misra, A., Rosas, I. O., Adams, R. H., Greif, D. M. Smooth muscle cell progenitors are primed to muscularize in pulmonary hypertension. Science Translational Medicine. 7 (308), (2015).
- Bentzon, J. F., Majesky, M. W. Lineage tracking of origin and fate of smooth muscle cells in atherosclerosis. Cardiovascular Research. 114 (4), 492-500 (2018).
- Wirth, A., et al. G12-G13-LARG-mediated signaling in vascular smooth muscle is required for salt-induced hypertension. Nature Medicine. 14 (1), 64-68 (2008).
- Mattson, D. L. Comparison of arterial blood pressure in different strains of mice. American Journal of Hypertension. 14 (5), 405-408 (2001).
- Whitesall, S. E., Hoff, J. B., Vollmer, A. P., D’Alecy, L. G. Comparison of simultaneous measurement of mouse systolic arterial blood pressure by radiotelemetry and tail-cuff methods. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (6), 2408-2415 (2004).
- Durgin, B. G., et al. Smooth muscle cell-specific deletion of Col15a1 unexpectedly leads to impaired development of advanced atherosclerotic lesions. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 312 (5), 943-958 (2017).
- Durham, A. L., Speer, M. Y., Scatena, M., Giachelli, C. M., Shanahan, C. M. Role of smooth muscle cells in vascular calcification: implications in atherosclerosis and arterial stiffness. Cardiovascular Research. 114 (4), 590-600 (2018).
- Lin, M. E., et al. Runx2 Deletion in Smooth muscle Cells Inhibits Vascular Osteochondrogenesis and Calcification but not Atherosclerotic Lesion Formation. Cardiovascular Research. , (2016).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving Bioscience Research Reporting: The ARRIVE Guidelines for Reporting Animal Research. PLoS Biology. 8 (6), 1000412 (2010).
- Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490 (7419), 187-191 (2012).
- Nishioka, T., et al. Contribution of inadequate compensatory enlargement to development of human coronary artery stenosis: An in vivo intravascular ultrasound study. Journal of the American College of Cardiology. 27 (7), 1571-1576 (1996).
- Pasterkamp, G., et al. Paradoxical Arterial-Wall Shrinkage May Contribute to Luminal Narrowing of Human Atherosclerotic Femoral Arteries. Circulation. 91 (5), 1444-1449 (1995).
- Galkina, E., et al. Lymphocyte recruitment into the aortic wall before and during development of atherosclerosis is partially L-selectin dependent. The Journal of Experimental Medicine. 203 (5), 1273-1282 (2006).
- Venegas-Pino, D. E., Banko, N., Khan, M. I., Shi, Y., Werstuck, G. H. Quantitative analysis and characterization of atherosclerotic lesions in the murine aortic sinus. Journal of Visual Experiments. (82), 50933 (2013).
