Analyse quantitative de la Composition cellulaire dans les lésions athérosclérotiques avancées de Muscle lisse Cell Lineage-Tracing souris
Summary
Nous vous proposons un protocole normalisé afin de caractériser la composition cellulaire des stades des lésions athéroscléreuses murines y compris des méthodes systématiques de dissection animale, incorporation de tissus, coupes, coloration et analyse des artères brachiocéphalique atheroprone muscle lisse cell lineage traçage souris.
Abstract
L’athérosclérose demeure la principale cause de décès dans le monde et, malgré d’innombrables études précliniques décrivant des cibles thérapeutiques prometteuses, nouvelles interventions reste insaisissables. Cela s’explique probablement en partie, à un recours aux modèles précliniques de prévention portant sur les effets des manipulations génétiques ou des traitements pharmacologiques sur le développement de l’athérosclérose, plutôt que la maladie établie. Aussi, les résultats de ces études sont souvent confusion en raison de l’utilisation des analyses de lésion superficielle et l’absence de caractérisation de populations cellulaires de lésion. Pour aider à surmonter ces obstacles translationnelles, nous proposons un recours accru aux modèles d’intervention qui emploient l’enquête des changements dans la composition cellulaire au niveau unicellulaire par immunofluorescence et microscopie confocale. À cette fin, les auteurs décrivent un protocole pour tester un agent thérapeutique putatif dans un modèle murin d’intervention y compris une approche systématique pour la dissection animale, enrobage, coupes, coloration et quantification des lésions de l’artère brachiocéphalique. En outre, en raison de la diversité phénotypique des cellules à l’intérieur des stades de lésions athéroscléreuses, nous décrivons l’importance d’utiliser des systèmes de souris pour le traçage lignée cellulaire spécifique, inductible et comment cela peut être exploité pour la caractérisation objective des populations de cellules de lésion athéroscléreuse. Ensemble, ces stratégies peuvent aider les biologistes vasculaires plus précisément modéliser les interventions thérapeutiques et analyser la maladie athéroscléreuse et seront traduira si tout va bien un taux plus élevé de réussite dans les études cliniques.
Introduction
L’athérosclérose est la principale cause de morbidité et de mortalité dans le monde entier qui sous-tend la plupart des maladies des artères coronaires, maladies artérielles périphériques et les AVC. Stades de l’athérosclérose coronarienne peut entraîner des complications sévères, y compris la comptabilité d’infarctus du myocarde pour près de 16 % du monde population mortalité1,2. En raison de ses effets dévastateurs sur la santé publique, un effort important a été déposée auprès de décrypter les mécanismes conduisant la progression de l’athérosclérose, ainsi que de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Pourtant, le taux de probabilité d’approbation (LOA) d’essais cliniques pour les maladies cardiovasculaires est parmi les plus faibles comparativement aux autres domaines cliniques (seulement 8,7 % pour la phase I)3. Cela peut s’expliquer en partie par les nombreux obstacles que l’athérosclérose pose au développement de médicaments efficaces dont sa nature presque ubiquiste, cliniquement silencieuse progression et hétérogénéité significative de la maladie. En outre, la conception sous-optimal des études précliniques sur des animaux aussi peut s’expliquer le manque de succès dans la traduction clinique. Plus précisément, il nous paraît nécessaire mettre en œuvre des études d’intervention lorsque c’est possible d’étudier l’efficacité des stratégies thérapeutiques. En outre, il y a un besoin essentiel d’effectuer des procédures normalisées pour les analyses de lésion incluant la caractérisation avancée des composition cellulaire avancé lésion athéroscléreuse de phénotypage et cartographie sort.
La grande majorité des études de l’athérosclérose se concentrer sur les modèles de prévention de l’athérosclérose consistant en médicaments traitement ou gène manipulation (knockout ou knock-in) chez la souris jeunes, avant le déclenchement de la maladie et la progression. Ces études ont découvert un grand nombre de gènes et molécules de signalisation qui jouent un rôle dans le développement de l’athérosclérose. Toutefois, la plupart de ces objectifs ne se traduisent par des thérapies efficaces chez les humains. En effet, il est difficile d’extrapoler l’effet une thérapie sur jeune chez la souris pour les personnes âgées atteintes de lésions athéroscléreuses avancées. Ainsi, la mise en œuvre des études d’intervention dans le pipeline expérimental préclinique probable offre une représentation plus précise de la pertinence et l’efficacité d’une nouvelle thérapeutique. L’idée est soutenue par les effets très divergentes de l’inhibition de la cytokine pro-inflammatoire interleukine-1β (IL-1β) lorsque vous employez une prévention4,5,6 ou intervention stratégie7. Différences entre prévention et études d’intervention suggèrent que les différents processus cellulaires se produisent à différentes phases du développement de l’athérosclérose et met en évidence le fait que les études de prévention sont probables insuffisantes pour modéliser le scénario clinique adéquatement.
L’American Heart Association a récemment publié une déclaration scientifique détaillant les recommandations pour la conception expérimentale appropriée, normalisation procédurale, analyse et signalement des animaux athérosclérose études8. Il met en évidence les avantages et les limites des techniques prédominantes utilisées dans le domaine. Par exemple, visage en Soudan IV coloration de l’aorte est souvent interprétée comme une première lecture. Bien que le visage en Soudan IV coloration des dépôts de lipides est une méthode appropriée pour l’évaluation du fardeau global de plaque, il est incapable de distinguer les lésions de stade précoce gras strie de lésions de stades plus avancées. Par conséquent, l’interprétation de la coloration du visage en est souvent ambigu et superficielle9. Une analyse minutieuse des tissus, coupes à l’aide de la taille de navire, lésion et lumen paramètres morphologiques et la quantification des indices de stabilité de la lésion fournit une compréhension plus précise de l’effet d’une expérience.
Enfin, des études de histopathologie humaine ont suggéré que la composition cellulaire est un meilleur indicateur de rupture que la taille de lésion elle-même, avec les pauvres de lésions dans les cellules musculaires lisses (SMC) et riche en macrophages étant plus susceptibles de se rompre à10, 11. Ces observations étaient basées sur une coloration pour marqueurs classiquement utilisés pour l’identification de la cellule (c.-à-d. ACTA2 pour SMC et LGALS3 ou CD68 de macrophages). Toutefois, l’expression de ces marqueurs n’est pas strictement limitée aux cellules du même type dans les lésions athérosclérotiques en raison de la plasticité de multiples lignées y compris SMC, les cellules endothéliales et les cellules myéloïdes12. En particulier, l’identification sans ambiguïté du SMC au sein de la lésion athéroscléreuse était pratiquement impossible jusqu’à la dernière décennie en raison de la propriété de ces cellules de dédifférenciation et réprimer leurs gènes marqueur lignée spécifique (un processus appelé commutation phénotypique) dans les vaisseaux malades ou blessés,13. Cette limitation dans l’identification de la SMC a été contournée par le développement de la lignée traçage7,14,15,16,17,18, 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24. il se compose de l’étiquetage en permanence SMC et leur progéniture pour suivre leur destin et leur évolution phénotypique au cours de la progression de l’athérosclérose en utilisant une combinaison de l’expression de la recombinase Cre grâce aux promoteurs de SMC spécifiques (p. ex., Myh117,15,17,18,19,20,21,22,23 , 24, Acta225,26 et, SM22α14,16) et l’activation des reporters (protéines fluorescentes, β-galactosidase) [revu Bentzon et Majesky 201827]. Dans l’une des premières études employant traçage lignée SMC à l’extérieur de réglage de l’embryogenèse, Speer et coll.14 fourni la preuve que SMC peut moduler leur phénotype et se transdifférencier en cellules chondrogéniques au cours de la calcification vasculaire à l’aide de un modèle de suivi SM22α Cre R26R LacZ lignée. Bien que ces études pionnier de traçage de lignée SMC, ils sont partiellement équivoques que toute donnée non-SMC SM22α exprimant dans le cadre de la maladie serait étiqueté par le journaliste. Cette limitation a été contournée par le développement et l’utilisation de la Cre inductibles par tamoxifène ERT/LoxP permettant un contrôle temporel de l’étiquetage de la cellule. Marquage de cellules se produit uniquement lors de l’accouchement de tamoxifène et se limitera à la cellule exprimant le promoteur spécifique au type cellule conduite expression Cre ERT au moment de l’exposition de tamoxifène, évitant le traçage des types de cellules alternative activation Cre dans la définition de progression de la maladie. Pour le traçage de la lignée des SMC dans l’athérosclérose, le transgène de – Cre/ERT2 Myh11inductibles par tamoxifène associé à fluorescents reporters (eYFP7,15,17,18 , 21, mTmG19,25, confettis20,22,23 pour les études de l’expansion clonale) a démontré une efficacité remarquable et une spécificité dans l’étiquetage des SMC et a servi à devenir carte SMC populations dans les lésions athéroscléreuses dans des études récentes. Ce qui est important, ces études ont révélé que : 1) 80 % du SMC avancé dans les lésions athéroscléreuses pas exprès des marqueurs classiques de SMC (ACTA2, MYH11) utilisées dans l’analyse d’immunohistological et donc serait ont été confondues avec sans suivi de lignée 17; 2) sous-ensembles de SMC expriment des marqueurs de types de cellules remplaçant incluant des marqueurs de macrophages ou cellules souches mésenchymateuses marqueurs16,17,19; et 3) SMC investir et remplir la lésion athéroscléreuse en expansion oligoclonales et SMC clones conservent la plasticité à la transition à phénotypiquement différentes populations20,23. Pour résumer, il est clair désormais que les cellules musculaires lisses présentent une remarquable diversité phénotypique des lésions athéroscléreuses et peuvent avoir des rôles bénéfiques ou néfastes sur la pathogénie des lésions selon la nature de leurs transitions phénotypiques. Ces découvertes représentent une remarquable nouvelle voie thérapeutique pour le ciblage SMC athero-promotion phénotypiques transitions dans l’athérosclérose tardifs.
Dans les présentes, nous vous proposons un protocole standardisé pour l’analyse des stades des lésions athéroscléreuses murines y compris des méthodes systématiques pour la dissection animale, enrobage, coupes, coloration et quantification des lésions de l’artère brachiocéphalique. Pour déterminer l’effet d’inhibition de l’Interleukin-1β sur le devenir de la SMC et phénotype, nous avons utilisé lignée SMC traçage ApoE– / – souris soumises à un régime occidental pendant 18 semaines avant de recevoir des injections hebdomadaires d’un anticorps anti-IL1β ou d’isotype IgG témoins.
Protocol
Representative Results
Discussion
Malgré des décennies de recherche et de progrès techniques dans l’étude de l’athérosclérose, le domaine a une histoire décevante de traduire des résultats scientifiques aux thérapies cliniques34,35. Ce phénomène peut s’expliquer en partie par des différences dans les modèles animaux expérimentaux et analyses de la lésion. Ici, nous décrivons un pipeline expérimental que nous avons utilisé pour analyser la composition cellulaire dans les l?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le centre d’imagerie biologique (pris en charge par le NIH 1S10OD019973-01) à l’Université de Pittsburgh, pour leur aide. Ce travail a été soutenu par est pris en charge par bourse de développement scientifique 15SDG25860021 de l’American Heart Association à la D.G. R.A.B. a été pris en charge par NIH grant F30 HL136188.
Materials
| 16% Paraformaldehyde aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | RT 15710 | Tissue perfusion and fixation |
| 23G butterfly needle | Fisher | BD367342 | |
| 25G needle | Fisher | 14-821-13D | |
| A1 Confocal microscope | Nikon | Confocal microscope | |
| ACTA2-FITC antibody (mouse) | Sigma Aldrich | F3777 | Primary Antibody |
| Alexa-647 anti goat | Invitrogen | A-21447 | Secondary antibody |
| Antigen Unmasking solution, Citric acid based | Vector Labs | H-3300 | Antigen retrieval solution |
| Chow Diet | Harlan Teklad | TD.7012 | |
| Coverslip | Fisher | 12-544-14 | Any 50 x 24 mm cover glass |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | Nucleus fluorescent counterstaining |
| Donkey Alexa-488 anti-rabbit | Invitrogen | A-21206 | Secondary antibody |
| Donkey Alexa-555 anti-rat | Abcam | ab150154 | Secondary antibody |
| DPBS 10X without Calcium and Magnesium | Gibco | 14200166 | PBS for solution dilutions and washes. Dilute to 1x in deionized water |
| Embedding cassette | Fisher | 15-182-701D | |
| ETDA vacuum tube | Fisher | 02-685-2B | |
| Ethanol 200 proof | Decon | 2701 | |
| Foam pad | Fisher | 22-222-012 | |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma Aldrich | G7765 | |
| GFP antibody (goat) | abcam | ab6673 | Primary antibody |
| goat IgG control | Vector Labs | I-5000 | IgG control |
| High Fat Diet | Harlan Teklad | TD.88137 | |
| ImageJ | NIH | Computer program https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| LGALS3 antibody (rat) | Cedarlane | CL8942AP | Primary antibody |
| LSM700 confocal microscope | Zeiss | Confocal microscope | |
| Microscope Slides, Superfrost Plus | Fisher | 12-550-15 | |
| Microtome blades | Fisher | 30-538-35 | |
| Mouse IgG control | Vector Labs | I-2000 | IgG control |
| NIS element imaging software | Nikon | Imaging software for z-stack image acquisition | |
| Normal Horse serum | Sigma Aldrich | H1270 | |
| Pap Pen | Fisher | 50-550-221 | |
| Peanut oil | Sigma | P2144 | |
| Prolong gold Antifade mountant | Invitrogen | P36930 | Mounting medium |
| Rabbit IgG control | Vector Labs | I-1000 | IgG control |
| Rat IgG control | Vector Labs | I-4000 | IgG control |
| RUNX2 antibody (rabbit) | Abcam | ab192256 | Primary Antibody |
| Syringe | BD | 309628 | 1 ml syringe |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Xylene | Fisher | X55K-4 | |
| Zen imaging software | Zeiss | Imaging software for z-stack image acquisition |
Riferimenti
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