Количественный анализ клеточного состава в передовых атеросклеротическим поражением гладкомышечные клетки Lineage трассировки мышей
Summary
Мы предлагаем стандартизированный протокол характеризовать клеточного состава поздней стадии мышиных атеросклеротических поражений, включая систематические методы животных рассечение, встраивание ткани, секционирование, окрашивание и анализ плечеголовной артерии от atheroprone гладкомышечные клетки линии трассировки мышей.
Abstract
Атеросклероза остается ведущей причиной смерти во всем мире, и, несмотря на бесчисленные доклинические исследования, описывающие перспективных терапевтических целей, Роман мероприятия остаются недостижимой. Это, вероятно, частично, обусловлено опоры на доклинических предупреждения модели, изучение последствий генетических манипуляций или фармакологических препаратов по развитию атеросклероза, а не установленного заболевания. Кроме того результаты этих исследований часто смешанные из-за использования поверхностных поражений анализов и отсутствие характеристика поражения клеточных популяций. Чтобы помочь преодолеть эти поступательные препятствия, мы предлагаем растущая зависимость модели вмешательства, которые используют исследование изменения клеточного состава на уровне отдельной ячейки immunofluorescent окрашивание и confocal микроскопии. С этой целью мы описываем протокол для тестирования предполагаемый терапевтический агент в модели мышиных вмешательства, включая систематический подход для животных рассечение, встраивание, секционирование, окрашивание и количественной оценки поражения плечеголовной артерии. Кроме того вследствие фенотипического разнообразия клеток в поздней стадии атеросклеротических поражений, опишем важность использования конкретных ячеек, индуцибельной линии трассировки мыши систем и как это может быть использованы для объективной характеристики атеросклеротические поражения клеточных популяций. Вместе эти стратегии могут помочь сосудистой биологи более точно модель терапевтических вмешательств и анализировать атеросклеротического заболевания и многообещающе будет перевести на более высокий уровень успеха в клинических испытаниях.
Introduction
Атеросклероз является основной причиной заболеваемости и смертности во всем мире лежащие в основе большинства ишемической болезни сердца, заболевания периферических артерий, и инсульта. Поздней стадии коронарный атеросклероз может привести к тяжелых осложнений, включая учет миокарда нарушения почти 16% мирового населения смертности1,2. Из-за его разрушительное воздействие на общественное здравоохранение расшифровать механизмы вождения прогрессирование атеросклероза, а также разрабатывать новые терапевтические стратегии был достигнут значительные усилия. Тем не менее уровень вероятность утверждения (LOA) клинических испытаний для сердечно-сосудистых заболеваний является одним из самых низких по сравнению с другими клинических областях (только 8,7% для этапа I)3. Это можно объяснить отчасти многие барьеры, атеросклероз представляет для разработки эффективной лекарств, включая почти повсеместный характер, клинически молчаливый прогрессии и значительные болезни неоднородности. Кроме того субоптимальные дизайн доклинические исследования на животных также могут учитываться для отсутствие успеха в клинической перевода. В частности мы считаем, что это необходимо для осуществления вмешательства исследования возможности исследовать эффективность терапевтических стратегий. Кроме того ощущается насущная необходимость для выполнения стандартных процедур для поражения анализов, включая передовые характеристики поздней стадии атеросклеротических поражений клеточного состава судьба сопоставления и фенотип.
Подавляющее большинство исследований атеросклероза сосредоточиться на модели профилактики атеросклероза, состоящий из наркотиков лечения или гена манипуляций (нокаут или забивные) в здоровых молодых мышей, до начала болезни и прогрессии. Эти исследования обнаружили большое количество генов и сигнальных молекул, которые играют определенную роль в развитии атеросклероза. Однако большинство из этих целей не перевести на эффективной терапии в человека. Действительно трудно экстраполировать эффект терапии на здоровых молодых мышей для пожилых пациентов с передовых атеросклеротических поражений. Таким образом осуществление исследований вмешательства в доклинические экспериментальные конвейере вероятно обеспечивает более точное описание актуальность и эффективность нового терапевтического. Идея поддерживается поразительно различные эффекты ингибирующих провоспалительных цитокинов интерлейкина 1β (IL-1β) при найме предупреждения4,5,6 или вмешательства стратегия7. Различия между предотвращением и практические исследования показывают, что различные клеточные процессы происходят на разных этапах развития атеросклероза и подчеркивается тот факт, что предотвращение исследования, вероятно, недостаточно для моделирования клинических сценарий адекватно.
Американская ассоциация сердца недавно опубликовал научное заявление, подробно рекомендации для надлежащего экспериментальный дизайн, процедурные стандартизации, анализа и отчетности о животных атеросклероза исследования8. В нем освещаются преимущества и ограничения преобладающим методы, используемые в поле. Например en лицом Судан IV пятнать аорты часто выполняется как первого считывания. Хотя en лицом Судан IV пятнать липидов осаждения является подходящим методом для оценки глобальных налет бремя, она не может отличить ранней стадии жирных полоса поражений от более продвинутые поздней стадии поражения. Таким образом интерпретация en лицом окрашивание часто является двусмысленным и поверхностные9. Тщательный анализ ткани сечений, используя судно, поражения и Люмене размер морфологических параметров и количественной оценки показателей стабильности поражения обеспечивает более точное понимание последствий эксперимента.
Наконец человека гистопатология исследования показали, что клеточный состав является лучше предиктором разрыв чем сам, размер поражения с бедными поражений в клетках гладких мышц (SMC) и богатыми в макрофагах, которые более восприимчивы к разрыву10, 11. Эти замечания были основаны на окрашивание для маркеров, классически используется для идентификации клетки (то есть, ACTA2 для SMC и LGALS3 или CD68 для макрофагов). Однако выражение этих маркеров не является строго ограничивается одной ячейки типа в атеросклеротических поражений благодаря пластичности несколько линий, включая SMC, эндотелиальных клеток и миелоидных клеток12. В частности однозначной идентификации SMC в пределах атеросклеротического поражения было практически невозможно до последнего десятилетия из-за свойства этих клеток дедифференцироваться и подавления их линии конкретных маркерных генов (процесс называют Фенотипические переключение) в13раненых или больных сосудов. Это ограничение в SMC идентификации было обойти путем развития линии трассировки7,14,,1516,17,18, 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24. Он состоит из постоянно маркировки SMC и их потомства для отслеживания их судьба и фенотипические эволюции во время прогрессирование атеросклероза, используя комбинацию выражения рекомбиназа Cre, движимый SMC-конкретных промоутеров (т.е., Myh117,15,,1718,19,20,21,,2223 , 24,25, Acta226 и SM22α14,16) и активация журналистов (например, флуоресцентных белков, β-галактозидазы) [обзор в Bentzon и Majesky 201827]. В одном из первых исследований, используя SMC трассировки линии вне эмбриогенеза параметр Шпеер et al.14 представила доказательства того, что SMC может модулировать их фенотипа и transdifferentiate в хондрогенном клетки во время сосудистой кальцификации с помощью модель трассировки линии Cre R26R LacZ SM22α . Хотя эти исследования впервые трассировки линии SMC, они были частично двусмысленным в том, что выражая SM22α любого заданного номера SMC в параметре болезни будут обозначены репортер. Это ограничение было обойти путем разработки и использования тамоксифен индуцибельной Cre ERT/LoxP разрешительные временной контроль маркировки клеток. Маркировки клеток происходит исключительно во время доставки тамоксифен и будет ограничен в ячейку, выражая ячейки конкретного типа промоутер вождения Cre ERT выражение в то время экспозиции тамоксифен, избегая трассировки типов альтернативных клеток, активация КРР в Настройка прогрессирования заболевания. Для трассировки линии SMC в атеросклероза, тамоксифен индуцибельной Myh11– Cre/ERT2 трансген, связанные с журналистами флуоресцентные (eYFP7,15,17,18 , 21, mTmG19,25, конфетти20,,2223 клоновых расширения исследований) продемонстрировал замечательную эффективность и специфичность в SMC маркировки и имеет используется для населения SMC карта судьбы в атеросклеротических поражений в последних исследованиях. Важно отметить, что эти исследования показали, что: 1) 80% SMC в расширенный атеросклеротическим поражением ДУ не выразить любые обычные SMC маркеры (ACTA2, MYH11) используется в иммуногистохимического анализа и поэтому будет ошибочно без родословной трассировки 17; 2) подмножеств SMC Экспресс маркеры типов альтернативных клеток, включая маркеры макрофагов или мезенхимальных стволовых клеток маркеры16,,1719; и 3) SMC инвестировать и заполнить атеросклеротического поражения, расширение oligoclonal и SMC клоны сохраняют пластичности для перехода к фенотипически различных популяциях20,23. Итак, теперь ясно, что гладкомышечные клетки представляют замечательную фенотипического разнообразия в атеросклеротических поражений и может иметь положительное или ущерб роли в патогенезе поражений в зависимости от характера их фенотипические переходы. Эти открытия представляют собой замечательные новые терапевтические авеню для ориентации SMC athero содействие фенотипические переходы в поздней стадии атеросклероза.
Здесь мы предлагаем стандартный протокол для анализа поздней стадии мышиных атеросклеротических поражений, включая систематические методы для животных рассечение, встраивание, секционирование, окрашивание и количественной оценки поражения плечеголовной артерии. Чтобы определить влияние интерлейкинов 1β торможения на судьбу SMC и фенотип, мы использовали SMC линии отслеживания ароЕ– / – мышей кормили западной диеты в течение 18 недель до получения еженедельных инъекций антитела анти IL1β или управления IgG изотипа соответствием.
Protocol
Representative Results
Discussion
Несмотря на десятилетия научно-технические достижения в изучении атеросклероза поле имеет разочарование истории перевода научных выводов по клинической терапии34,35. Это явление может частично объяснить расхождения в животных моделях, экспериментальны…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим центр за биологическими Imaging (поддерживается низ 1S10OD019973-01) в университете Питтсбурга за их помощь. Эта работа была поддержана, поддерживается грантом научного развития 15SDG25860021 от Американской ассоциации сердца к R.A.B. д.г. была поддержана NIH Грант F30 HL136188.
Materials
| 16% Paraformaldehyde aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | RT 15710 | Tissue perfusion and fixation |
| 23G butterfly needle | Fisher | BD367342 | |
| 25G needle | Fisher | 14-821-13D | |
| A1 Confocal microscope | Nikon | Confocal microscope | |
| ACTA2-FITC antibody (mouse) | Sigma Aldrich | F3777 | Primary Antibody |
| Alexa-647 anti goat | Invitrogen | A-21447 | Secondary antibody |
| Antigen Unmasking solution, Citric acid based | Vector Labs | H-3300 | Antigen retrieval solution |
| Chow Diet | Harlan Teklad | TD.7012 | |
| Coverslip | Fisher | 12-544-14 | Any 50 x 24 mm cover glass |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | Nucleus fluorescent counterstaining |
| Donkey Alexa-488 anti-rabbit | Invitrogen | A-21206 | Secondary antibody |
| Donkey Alexa-555 anti-rat | Abcam | ab150154 | Secondary antibody |
| DPBS 10X without Calcium and Magnesium | Gibco | 14200166 | PBS for solution dilutions and washes. Dilute to 1x in deionized water |
| Embedding cassette | Fisher | 15-182-701D | |
| ETDA vacuum tube | Fisher | 02-685-2B | |
| Ethanol 200 proof | Decon | 2701 | |
| Foam pad | Fisher | 22-222-012 | |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma Aldrich | G7765 | |
| GFP antibody (goat) | abcam | ab6673 | Primary antibody |
| goat IgG control | Vector Labs | I-5000 | IgG control |
| High Fat Diet | Harlan Teklad | TD.88137 | |
| ImageJ | NIH | Computer program https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| LGALS3 antibody (rat) | Cedarlane | CL8942AP | Primary antibody |
| LSM700 confocal microscope | Zeiss | Confocal microscope | |
| Microscope Slides, Superfrost Plus | Fisher | 12-550-15 | |
| Microtome blades | Fisher | 30-538-35 | |
| Mouse IgG control | Vector Labs | I-2000 | IgG control |
| NIS element imaging software | Nikon | Imaging software for z-stack image acquisition | |
| Normal Horse serum | Sigma Aldrich | H1270 | |
| Pap Pen | Fisher | 50-550-221 | |
| Peanut oil | Sigma | P2144 | |
| Prolong gold Antifade mountant | Invitrogen | P36930 | Mounting medium |
| Rabbit IgG control | Vector Labs | I-1000 | IgG control |
| Rat IgG control | Vector Labs | I-4000 | IgG control |
| RUNX2 antibody (rabbit) | Abcam | ab192256 | Primary Antibody |
| Syringe | BD | 309628 | 1 ml syringe |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Xylene | Fisher | X55K-4 | |
| Zen imaging software | Zeiss | Imaging software for z-stack image acquisition |
Riferimenti
- GBD DALYs and HALE Collaborators. Global, regional, and national disability-adjusted life-years (DALYs) for 315 diseases and injuries and healthy life expectancy (HALE), 1990-2015: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2015. Lancet. 388 (10053), 1603-1658 (2016).
- Benjamin, E. J., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2018 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 137 (12), 67-92 (2018).
- Hay, M., Thomas, D. W., Craighead, J. L., Economides, C., Rosenthal, J. Clinical development success rates for investigational drugs. Nature Biotechnology. 32 (1), 40-51 (2014).
- Bhaskar, V., et al. Monoclonal antibodies targeting IL-1 beta reduce biomarkers of atherosclerosis in vitro and inhibit atherosclerotic plaque formation in Apolipoprotein E-deficient mice. Atherosclerosis. 216 (2), 313-320 (2011).
- Isoda, K., et al. Lack of interleukin-1 receptor antagonist modulates plaque composition in apolipoprotein E-deficient mice. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 24 (6), 1068-1073 (2004).
- Kirii, H., et al. Lack of interleukin-1beta decreases the severity of atherosclerosis in ApoE-deficient mice. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 23 (4), 656-660 (2003).
- Gomez, D., et al. Interleukin-1β has atheroprotective effects in advanced atherosclerotic lesions of mice. Nature Medicine. 24, 1418-1429 (2018).
- Daugherty, A., et al. Recommendation on Design, Execution, and Reporting of Animal Atherosclerosis Studies: A Scientific Statement From the American Heart Association. Circulation Research. 121 (6), 53-79 (2017).
- Baylis, R. A., Gomez, D., Owens, G. K. Shifting the Focus of Preclinical, Murine Atherosclerosis Studies From Prevention to Late-Stage Intervention. Circulation Research. 120 (5), 775-777 (2017).
- Kolodgie, F. D., et al. Pathologic assessment of the vulnerable human coronary plaque. Heart. 90 (12), 1385-1391 (2004).
- Virmani, R., Kolodgie, F. D., Burke, A. P., Farb, A., Schwartz, S. M. Lessons from sudden coronary death: a comprehensive morphological classification scheme for atherosclerotic lesions. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 20 (5), 1262-1275 (2000).
- Gomez, D., Owens, G. K. Smooth muscle cell phenotypic switching in atherosclerosis. Cardiovascular Research. 95 (2), 156-164 (2012).
- Owens, G. K., Kumar, M. S., Wamhoff, B. R. Molecular regulation of vascular smooth muscle cell differentiation in development and disease. Physiological Reviews. 84 (3), 767-801 (2004).
- Speer, M. Y., et al. Smooth muscle cells give rise to osteochondrogenic precursors and chondrocytes in calcifying arteries. Circulation Research. 104 (6), 733-741 (2009).
- Gomez, D., Shankman, L. S., Nguyen, A. T., Owens, G. K. Detection of histone modifications at specific gene loci in single cells in histological sections. Nature Methods. 10 (2), 171-177 (2013).
- Feil, S., et al. Transdifferentiation of vascular smooth muscle cells to macrophage-like cells during atherogenesis. Circulation Research. 115 (7), 662-667 (2014).
- Shankman, L. S., et al. KLF4-dependent phenotypic modulation of smooth muscle cells has a key role in atherosclerotic plaque pathogenesis. Nature Medicine. 21, 628 (2015).
- Cherepanova, O. A., et al. Activation of the pluripotency factor OCT4 in smooth muscle cells is atheroprotective. Nature Medicine. 22, 657 (2016).
- Albarran-Juarez, J., Kaur, H., Grimm, M., Offermanns, S., Wettschureck, N. Lineage tracing of cells involved in atherosclerosis. Atherosclerosis. 251, 445-453 (2016).
- Chappell, J., et al. Extensive Proliferation of a Subset of Differentiated, yet Plastic, Medial Vascular Smooth Muscle Cells Contributes to Neointimal Formation in Mouse Injury and Atherosclerosis Models. Circulation Research. 119 (12), 1313-1323 (2016).
- Newman, A. A., et al. Irradiation abolishes smooth muscle investment into vascular lesions in specific vascular beds. JCI Insight. 3 (15), (2018).
- Dobnikar, L., et al. Disease-relevant transcriptional signatures identified in individual smooth muscle cells from healthy mouse vessels. Nature Communications. 9 (1), 4567 (2018).
- Misra, A., et al. Integrin beta3 regulates clonality and fate of smooth muscle-derived atherosclerotic plaque cells. Nature Communications. 9 (1), 2073 (2018).
- Majesky, M. W., et al. Differentiated Smooth Muscle Cells Generate a Subpopulation of Resident Vascular Progenitor Cells in the Adventitia Regulated by Klf4. Circulation Research. 120 (2), 296-311 (2017).
- Herring, B. P., Hoggatt, A. M., Burlak, C., Offermanns, S. Previously differentiated medial vascular smooth muscle cells contribute to neointima formation following vascular injury. Vascular Cell. 6, 21 (2014).
- Sheikh, A. Q., Misra, A., Rosas, I. O., Adams, R. H., Greif, D. M. Smooth muscle cell progenitors are primed to muscularize in pulmonary hypertension. Science Translational Medicine. 7 (308), (2015).
- Bentzon, J. F., Majesky, M. W. Lineage tracking of origin and fate of smooth muscle cells in atherosclerosis. Cardiovascular Research. 114 (4), 492-500 (2018).
- Wirth, A., et al. G12-G13-LARG-mediated signaling in vascular smooth muscle is required for salt-induced hypertension. Nature Medicine. 14 (1), 64-68 (2008).
- Mattson, D. L. Comparison of arterial blood pressure in different strains of mice. American Journal of Hypertension. 14 (5), 405-408 (2001).
- Whitesall, S. E., Hoff, J. B., Vollmer, A. P., D’Alecy, L. G. Comparison of simultaneous measurement of mouse systolic arterial blood pressure by radiotelemetry and tail-cuff methods. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (6), 2408-2415 (2004).
- Durgin, B. G., et al. Smooth muscle cell-specific deletion of Col15a1 unexpectedly leads to impaired development of advanced atherosclerotic lesions. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 312 (5), 943-958 (2017).
- Durham, A. L., Speer, M. Y., Scatena, M., Giachelli, C. M., Shanahan, C. M. Role of smooth muscle cells in vascular calcification: implications in atherosclerosis and arterial stiffness. Cardiovascular Research. 114 (4), 590-600 (2018).
- Lin, M. E., et al. Runx2 Deletion in Smooth muscle Cells Inhibits Vascular Osteochondrogenesis and Calcification but not Atherosclerotic Lesion Formation. Cardiovascular Research. , (2016).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving Bioscience Research Reporting: The ARRIVE Guidelines for Reporting Animal Research. PLoS Biology. 8 (6), 1000412 (2010).
- Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490 (7419), 187-191 (2012).
- Nishioka, T., et al. Contribution of inadequate compensatory enlargement to development of human coronary artery stenosis: An in vivo intravascular ultrasound study. Journal of the American College of Cardiology. 27 (7), 1571-1576 (1996).
- Pasterkamp, G., et al. Paradoxical Arterial-Wall Shrinkage May Contribute to Luminal Narrowing of Human Atherosclerotic Femoral Arteries. Circulation. 91 (5), 1444-1449 (1995).
- Galkina, E., et al. Lymphocyte recruitment into the aortic wall before and during development of atherosclerosis is partially L-selectin dependent. The Journal of Experimental Medicine. 203 (5), 1273-1282 (2006).
- Venegas-Pino, D. E., Banko, N., Khan, M. I., Shi, Y., Werstuck, G. H. Quantitative analysis and characterization of atherosclerotic lesions in the murine aortic sinus. Journal of Visual Experiments. (82), 50933 (2013).
