Análisis cuantitativo de la composición celular en las lesiones ateroscleróticas avanzadas de músculo liso células linaje trazado ratones
Summary
Proponemos un protocolo estandarizado para caracterizar la composición celular de etapa tardía las lesiones ateroscleróticas murinas como métodos sistemáticos de disección animal, tejido inclusión, seccionamiento, tinción y análisis de las arterias braquiocefálicas de atheroprone músculo liso células linaje seguimiento ratones.
Abstract
Aterosclerosis es la principal causa de muerte en todo el mundo y, a pesar de innumerables estudios preclínicos que describe objetivos terapéuticos prometedores, nuevas intervenciones han permanecido esquivas. Esto es probablemente debido, en parte, a una dependencia de modelos preclínicos prevención investigando los efectos de la manipulación genética o tratamientos farmacológicos sobre el desarrollo de aterosclerosis en lugar de la enfermedad establecida. También, resultados de estos estudios son a menudo confusión debido al uso de análisis superficial de la lesión y la falta de caracterización de poblaciones de células de la lesión. Para ayudar a superar estos obstáculos traslacionales, proponemos una mayor dependencia en los modelos de intervención que emplean la investigación de los cambios en la composición celular a nivel unicelular por tinción de inmunofluorescencia y microscopía confocal. Para ello, se describe un protocolo para las pruebas de un supuesta agente terapéutico en un modelo murino de la intervención como un enfoque sistemático para la disección animal, inclusión, corte, coloración y cuantificación de las lesiones de la arteria braquiocéfala. Además, debido a la diversidad fenotípica de las células dentro de las lesiones ateroscleróticas de la tarde-etapa, describimos la importancia del uso de sistemas de linaje de la célula-específica, inducible calco ratón y cómo esto se puede aprovechar para la caracterización objetiva de poblaciones celulares de la lesión aterosclerótica. Juntos, estas estrategias pueden ayudar a los biólogos vasculares con mayor precisión las intervenciones terapéuticas del modelo y analizar la enfermedad aterosclerótica y que se traducirán en una mayor tasa de éxito en los ensayos clínicos.
Introduction
La ateroesclerosis es la principal causa de morbilidad y mortalidad en todo el mundo que la mayoría de las enfermedades coronarias, enfermedades de las arterias periféricas y accidente cerebrovascular. Aterosclerosis coronaria de etapa tardía pueden llevar a complicaciones severas, incluyendo la contabilidad de la infracción miocardio casi el 16% del mundo población mortalidad1,2. Debido a su impacto devastador en la salud pública, se han hecho esfuerzos importantes para descifrar los mecanismos de conducción de progresión de la aterosclerosis, así como para desarrollar nuevas estrategias terapéuticas. Sin embargo, la tasa de probabilidad de aprobación (LOA) de ensayos clínicos para la enfermedad cardiovascular es entre los más bajos en comparación con otros campos clínicos (sólo 8,7% para la fase I)3. Esto puede explicarse en parte por muchas barreras que ateroesclerosis plantea al desarrollo de drogas eficaces incluyendo su naturaleza casi omnipresente, clínicamente silenciosa progresión y heterogeneidad de la enfermedad significativa. Por otra parte, el diseño subóptimo de los estudios preclínicos en animales también puede explicarse por la falta de éxito en la traducción clínica. En concreto, creemos que es necesario implementar estudios de intervención siempre que sea posible investigar la eficacia de estrategias terapéuticas. Además, hay una necesidad crítica para llevar a cabo procedimientos estandarizados para el análisis de la lesión incluyendo caracterización avanzada de composición celular de la etapa tardía de la lesión aterosclerótica phenotyping y asignación de destino.
La gran mayoría de los estudios de aterosclerosis se centrará en modelos de prevención de la aterosclerosis consisten en drogas tratamiento gene manipulación o (golpe de gracia o knock-in) en los ratones jóvenes sanos, antes de la iniciación de la enfermedad y la progresión. Estos estudios han descubierto un gran número de genes y moléculas de señalización que juegan un papel en el desarrollo de aterosclerosis. Sin embargo, la mayoría de estos objetivos no se traducen en terapias eficaces en humanos. De hecho, es difícil extrapolar el efecto de que una terapia tiene en ratones jóvenes saludables a pacientes ancianos con lesiones ateroscleróticas avanzadas. Como tal, la realización de estudios de intervención en la preclínica experimental probablemente proporciona una representación más precisa de la pertinencia y la eficacia de una nueva terapéutica. La idea es apoyada por los efectos sorprendentemente divergentes de inhibición de la citocina proinflamatoria interleukina-1β (IL-1β) cuando emplee una prevención4,5,6 o intervención estrategia7. Diferencias entre prevención y estudios de intervención sugieren que diversos procesos celulares ocurren en diferentes fases de desarrollo de aterosclerosis y destaca el hecho de que están probables que estudios de prevención suficientes para modelar el escenario clínico adecuadamente.
La American Heart Association publicó recientemente una Declaración científica que detalla las recomendaciones para el diseño experimental apropiado procedimiento estandarización, análisis y reporting de ateroesclerosis animal estudios8. Se destacan los beneficios y limitaciones de las técnicas predominantes utilizadas en el campo. Por ejemplo, la cara en Sudán IV tinción de la aorta se realiza a menudo como una primera lectura. Aunque cara en tinción de Sudan IV de deposición de lípidos es un método adecuado para la evaluación de la carga global de la placa, es incapaz de distinguir las lesiones de la estría grasa incipiente de lesiones más avanzadas de última etapa. Como tal, la interpretación de la cara en la coloración es a menudo ambigua y superficial9. Análisis cuidadoso del tejido secciones utilizando el tamaño de buque, lesión y la luz de parámetros morfológicos y la cuantificación de los índices de estabilidad de la lesión proporciona una comprensión más precisa del efecto de un experimento.
Finalmente, estudios de histopatología humana han sugerido que la composición celular es un mejor predictor de la ruptura que el tamaño de la lesión, con pobres de lesiones en células de músculo liso (SMC) y ricos en macrófagos, siendo más susceptibles a la ruptura10, 11. Estas observaciones se basaron en coloración para marcadores clásicamente utilizados para la identificación de la célula (es decir, ACTA2 para SMC o LGALS3 CD68 de macrófagos). Sin embargo, la expresión de estos marcadores no está estrictamente restringida a un solo tipo de células en las lesiones ateroscleróticas debido a la plasticidad de los linajes múltiples incluyendo SMC, células endoteliales y células mieloides12. En particular, la identificación inequívoca del SMC en la lesión aterosclerótica fue prácticamente imposible hasta la última década debido a la característica de estas células para dedifferentiate y reprimir sus genes marcador de linaje específico (un proceso denominado fenotípica de la conmutación) en13de los vasos lesionados o enfermos. Esta limitación en la identificación de SMC ha sido burlada por el desarrollo del linaje seguimiento7,14,15,16,17,18, 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24. se compone de etiquetado permanentemente SMC y sus crías para seguir su destino y evolución fenotípica durante la progresión de aterosclerosis mediante la combinación de la expresión del recombinase de Cre impulsado por promotores específicos de SMC (es decir, Myh117,15,17,18,19,20,21,22,23 , 24,25,de Acta226 y SM22α14,16) y la activación de Reporteros (p. ej., proteínas fluorescentes, β-galactosidasa) [revisado en Bentzon y Majesky 201827]. En uno de los primeros estudios con seguimiento de linaje SMC fuera de ajuste de la embriogénesis, Speer et al.14 proporcionó evidencia que SMC puede modular su fenotipo y transdifferentiate en condrogénica de células durante la calcificación vascular mediante el uso de un modelo de seguimiento de linaje SM22α Cre R26R LacZ. Aunque estos estudios fue pionero en seguimiento del linaje SMC, que estaban parcialmente equívocos en que cualquier dado SMC no expresando su SM22α en el ajuste de la enfermedad sería marcado por el reportero. Esta limitación ha sido soslayada por el desarrollo y uso del tamoxifeno-inducible Cre ERT/LoxP que permite un control temporal de etiquetado de la célula. Celular se produce exclusivamente durante el parto de tamoxifeno y se limita a la célula expresando células específicas del tipo promotor conducir expresión Cre ERT en el momento de la exposición a tamoxifeno, evitando el trazado alternativo de tipos de células activando Cre en el ajuste de la progresión de la enfermedad. Seguimiento del linaje de SMC en la aterosclerosis, el tamoxifeno-inducible Myh11– Cre/ERT2 transgen asociado a reporteros fluorescentes (eYFP7,15,del17,18 , 21, mTmG19,25, confeti20,22,23 estudios de expansión clonal) ha demostrado una notable eficacia y especificidad en las SMC y ha utilizado para destino mapa SMC las poblaciones en las lesiones ateroscleróticas en estudios recientes. Lo importante, estos estudios revelaron que: 1) 80% de SMC dentro avanzado hacer lesiones ateroscleróticas no expresa ningún convencionales marcadores SMC (ACTA2, MYH11) utilizados en análisis immunohistological y por lo tanto habría sido identificado erróneamente sin seguimiento del linaje 17; 2) subconjuntos de SMC expresan marcadores alternativos tipos de células incluyendo marcadores de macrófagos o de células madre mesenquimales marcadores16,17,19; y 3) SMC invertir y rellenar la lesión aterosclerótica por expansión oligoclonal y clones SMC mantienen plasticidad a la transición a poblaciones fenotípicamente diferentes20,23. Para resumir, ahora está claro que las células musculares lisas presentan una notable diversidad fenotípica en las lesiones ateroscleróticas y pueden tener papeles beneficiosos o perjudiciales sobre la patogénesis de la lesión según la naturaleza de sus transiciones fenotípicas. Estos descubrimientos representan una nueva vía terapéutica notable para dirigidos a los SMC atero-promover fenotípica las transiciones en la última etapa de aterosclerosis.
En este documento, proponemos un protocolo estandarizado para el análisis de fase las lesiones ateroscleróticas murinas como métodos sistemáticos para la disección de animales, inclusión, seccionamiento, tinción y cuantificación de las lesiones de la arteria braquiocéfala. Para determinar el efecto de inhibición de la interleucina-1β en destino SMC y fenotipo, utilizamos el linaje SMC ApoE– / – ratones alimentados con una dieta occidental para 18 semanas antes de recibir inyecciones semanales de un anticuerpo anti-IL1β o emparejado de isotipo IgG control de seguimiento.
Protocol
Representative Results
Discussion
A pesar de décadas de investigación y los avances técnicos en el estudio de la aterosclerosis, el campo tiene una historia decepcionante de traducir los resultados científicos en terapias clínicas34,35. Este fenómeno puede explicarse en parte por las discrepancias en los modelos animales, diseños experimentales y análisis de la lesión. Adjunto, describimos un gasoducto experimental que se utilizó para analizar la composición celular en las lesiones ate…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos el centro de la proyección de imagen biológica (apoyado por NIH 1S10OD019973-01) en la Universidad de Pittsburgh por su asistencia. Este trabajo fue apoyado por es apoyado por científicos concesión de desarrollo 15SDG25860021 de la American Heart Association a D.G. R.A.B. fue apoyado por los NIH grant HL136188 F30.
Materials
| 16% Paraformaldehyde aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | RT 15710 | Tissue perfusion and fixation |
| 23G butterfly needle | Fisher | BD367342 | |
| 25G needle | Fisher | 14-821-13D | |
| A1 Confocal microscope | Nikon | Confocal microscope | |
| ACTA2-FITC antibody (mouse) | Sigma Aldrich | F3777 | Primary Antibody |
| Alexa-647 anti goat | Invitrogen | A-21447 | Secondary antibody |
| Antigen Unmasking solution, Citric acid based | Vector Labs | H-3300 | Antigen retrieval solution |
| Chow Diet | Harlan Teklad | TD.7012 | |
| Coverslip | Fisher | 12-544-14 | Any 50 x 24 mm cover glass |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | Nucleus fluorescent counterstaining |
| Donkey Alexa-488 anti-rabbit | Invitrogen | A-21206 | Secondary antibody |
| Donkey Alexa-555 anti-rat | Abcam | ab150154 | Secondary antibody |
| DPBS 10X without Calcium and Magnesium | Gibco | 14200166 | PBS for solution dilutions and washes. Dilute to 1x in deionized water |
| Embedding cassette | Fisher | 15-182-701D | |
| ETDA vacuum tube | Fisher | 02-685-2B | |
| Ethanol 200 proof | Decon | 2701 | |
| Foam pad | Fisher | 22-222-012 | |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma Aldrich | G7765 | |
| GFP antibody (goat) | abcam | ab6673 | Primary antibody |
| goat IgG control | Vector Labs | I-5000 | IgG control |
| High Fat Diet | Harlan Teklad | TD.88137 | |
| ImageJ | NIH | Computer program https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| LGALS3 antibody (rat) | Cedarlane | CL8942AP | Primary antibody |
| LSM700 confocal microscope | Zeiss | Confocal microscope | |
| Microscope Slides, Superfrost Plus | Fisher | 12-550-15 | |
| Microtome blades | Fisher | 30-538-35 | |
| Mouse IgG control | Vector Labs | I-2000 | IgG control |
| NIS element imaging software | Nikon | Imaging software for z-stack image acquisition | |
| Normal Horse serum | Sigma Aldrich | H1270 | |
| Pap Pen | Fisher | 50-550-221 | |
| Peanut oil | Sigma | P2144 | |
| Prolong gold Antifade mountant | Invitrogen | P36930 | Mounting medium |
| Rabbit IgG control | Vector Labs | I-1000 | IgG control |
| Rat IgG control | Vector Labs | I-4000 | IgG control |
| RUNX2 antibody (rabbit) | Abcam | ab192256 | Primary Antibody |
| Syringe | BD | 309628 | 1 ml syringe |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Xylene | Fisher | X55K-4 | |
| Zen imaging software | Zeiss | Imaging software for z-stack image acquisition |
Riferimenti
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