Quantitative Analyse der zellulären Zusammensetzung in fortgeschrittene atherosklerotische Läsionen der glatten Muskulatur Zelle Abstammung-Tracing Mäuse
Summary
Wir schlagen ein standardisiertes Protokoll zur Charakterisierung der zellulären Zusammensetzung der Spätphase murinen atherosklerotische Läsionen einschließlich systematische Methoden der tierischen Dissektion, Gewebe einbetten, schneiden, Färbung und Analyse der Brachiocephalic Arterien Atheroprone glatten Muskulatur Zelle Abstammung Ablaufverfolgung Mäuse.
Abstract
Atherosklerose ist die häufigste Todesursache weltweit und, trotz unzähligen präklinischen Studien vielversprechende therapeutische Ziele beschreiben, neue Interventionen blieben schwer. Dies ist wahrscheinlich wegen, unter anderem zu einer Abhängigkeit von präklinischen Prävention Modelle untersucht die Auswirkungen der genetischen Manipulationen oder pharmakologische Behandlungen auf die Atherosklerose-Entwicklung als die etablierten Krankheit. Ergebnisse dieser Studien sind oft durch die Verwendung von oberflächlichen Läsion Analysen und mangelnder Charakterisierung der Läsion Zellpopulationen verwirrende. Um diese translationalen Hürden überwinden zu helfen, schlagen wir eine erhöhte Abhängigkeit von der Intervention-Modelle, die Untersuchung von Veränderungen in der zellulären Zusammensetzung auf eine einzelne Zellenebene von immunofluorescent Färbung und konfokalen Mikroskopie beschäftigen. Zu diesem Zweck beschreiben wir ein Protokoll in einem murinen Interventionsmodell, einschließlich eines systematischen Ansatzes für tierische Dissektion, einbetten, schneiden, färben und Quantifizierung der Brachiocephalic Arterie Läsionen zu Testzwecken eine vermeintliche Therapeutikum. Darüber hinaus aufgrund der phänotypische Vielfalt von Zellen im Spätstadium atherosklerotische Läsionen beschreiben wir die Bedeutung des Einsatzes zellspezifische, induzierbaren Abstammung Ablaufverfolgung Maus Systeme und wie dies für unvoreingenommene Charakterisierung der genutzt werden kann atherosklerotischen Läsionen Zellpopulationen. Zusammen, diese Strategien können vaskuläre Biologen genauer therapeutische Interventionen zu modellieren und analysieren von atherosklerotischen Krankheit helfen und werden hoffentlich in eine höhere Erfolgsquote in klinischen Studien zu übersetzen.
Introduction
Atherosklerose ist die häufigste Ursache für Morbidität und Mortalität, die weltweit die Mehrheit der koronaren Herzkrankheit, periphere Arterie Erkrankungen und Schlaganfall zugrunde liegen. Spätstadium koronaren Atherosklerose führen zu schweren Komplikationen einschließlich myokardiale Verletzung Bilanzierung von fast 16 % der Welt Bevölkerung Mortalität1,2. Durch ihre verheerenden Auswirkungen auf die öffentliche Gesundheit wurden erheblicher Anstrengungen unternommen, zu entschlüsseln, die Mechanismen fahren Fortschreiten der Atherosklerose sowie neue therapeutische Strategien zu entwickeln. Allerdings ist die Wahrscheinlichkeit der Zulassung (LOA) bei klinischen Studien für Herz-Kreislauf-Krankheit zu den niedrigsten im Vergleich mit anderen klinischen Bereichen (nur 8,7 % für phase-I-)3. Dies lässt sich teilweise durch viele Hindernisse, dass Atherosklerose für effiziente Medikamentenentwicklung einschließlich fast allgegenwärtige Natur, klinisch stumm fortschreiten, und bedeutende Krankheit Heterogenität darstellt. Darüber hinaus kann die suboptimale Gestaltung der präklinischen Untersuchungen an Tieren auch für den mangelnden Erfolg in klinischen Übersetzung berücksichtigt werden. Speziell, glauben wir, dass Interventionsstudien wann immer möglich zu untersuchen, die Wirksamkeit der therapeutischen Strategien umsetzen muss. Außerdem gibt es standardisierte Verfahren für Läsion Analysen einschließlich erweiterte Charakterisierung der Spätphase atherosklerotischen Läsion zelluläre Zusammensetzung von Schicksal-Mapping und Phänotypisierung ausführen müssen.
Die überwiegende Mehrheit der Atherosklerose Studien konzentrieren sich auf Modelle der Atherosklerose Prävention bestehend aus Medikament Behandlung oder gen Manipulation (Ko oder Knock-in) bei gesunden jungen Mäusen, vor der Krankheit Initiation und Progression. Diese Studien haben eine große Anzahl von Genen und Signalmoleküle, die eine in der Entwicklung von Arteriosklerose Rolle entdeckt. Jedoch nicht die meisten dieser Ziele, um effiziente Therapien beim Menschen zu übersetzen. In der Tat ist es schwierig, den Effekt zu extrapolieren, die, den eine Therapie auf gesunde junge Mäuse an älteren Patienten mit fortgeschrittenen atherosklerotische Läsionen hat. Als solche bietet die Durchführung von Interventionsstudien in der präklinischen experimentelle Pipeline wahrscheinlich eine genauere Darstellung der Relevanz und Wirksamkeit eines neuen therapeutischen. Die Idee wird durch die auffallend unterschiedlichen Auswirkungen der Hemmung der Pro-inflammatorischen Zytokin Interleukin-1β (IL-1β) bei einer Prävention4,5,6 oder Intervention Strategie7unterstützt. Unterschiede zwischen Prävention und Interventionsstudien deuten darauf hin, dass verschiedene zelluläre Prozesse auftreten in verschiedenen Phasen der Entwicklung von Atherosklerose und betont, dass Vorbeugung Studien dürften nicht ausreicht, um die klinische Szenario modellieren angemessen.
Die American Heart Association veröffentlichte kürzlich eine wissenschaftliche Erklärung Empfehlungen für geeignete Versuchsanordnung, prozedurale Standardisierung, Analyse und Berichterstattung über tierische Atherosklerose Studien8Detaillierung. Es zeigt die vor- und Nachteile der vorherrschenden Techniken in der Praxis eingesetzt. De Gesicht Sudan IV Färbung der Aorta wird beispielsweise häufig als erste Auslesen durchgeführt. Obwohl de Gesicht Sudan IV Färbung Lipid Ablagerungsrate eine geeignete Methode zur Beurteilung der globalen Plaque Belastung ist, kann er Frühstadium fatty Streak Läsionen von fortgeschrittenen späten Läsionen zu unterscheiden. Als solche ist die Interpretation der En Gesicht Färbung oft mehrdeutig und oberflächliche9. Eine sorgfältige Analyse des Gewebes Querschnitte unter Verwendung der morphologischen Parameter Schiff, Läsion und Lumen Größe und Quantifizierung von Indizes der Läsion Stabilität ermöglicht ein genaueres Verständnis der Wirkung eines Experiments.
Schließlich haben menschliche histopathologische Studien vorgeschlagen, dass zelluläre Zusammensetzung ein besserer Prädiktor der Bruch als die Größe der Läsion, mit Läsionen Armen in glatten Muskelzellen (SMC) und reich an Makrophagen wird anfälliger ist für10Bruch, 11. Diese Beobachtungen beruhten auf Färbung für Markierungen, die klassisch für Zelle Identifikation verwendet (z.B. ACTA2 für SMC und LGALS3 oder CD68 für Makrophagen). Jedoch beschränkt sich der Ausdruck dieser Marker nicht streng auf eine einzelne Zelle in atherosklerotischen Läsionen aufgrund der Plastizität mehrere Linien wie SMC, Endothelzellen und myeloische Zellen12. Insbesondere war die eindeutige Identifizierung des SMC in atherosklerotischen Läsion praktisch unmöglich bis zu den letzten zehn Jahren aufgrund der Eigenschaft dieser Zellen zu Gewebestammzelle und zu unterdrücken ihre Abstammung-spezifische Markergene (ein Prozess bezeichnet als phänotypische Schaltung) verletzten oder erkrankten Gefäße13. Diese Einschränkung bei SMC Identifikation hat durch die Entwicklung der Linie Ablaufverfolgung7,14,15,16,17,18, umgangen worden 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24. es besteht aus dauerhaft Kennzeichnung SMC und deren Nachkommen, um ihr Schicksal und phänotypische Evolution während Progression der Atherosklerose zu verfolgen, durch eine Kombination des Ausdrucks der Cre-Rekombinase angetrieben von SMC-spezifische Promotoren (d. h. Myh117,15,17,18,19,20,21,22,23 , 24, Acta225,26 und SM22α14,16) und die Aktivierung der Reporter (z. B. fluoreszierende Proteine, β-Galaktosidase) [überprüft in Bentzon und Majesky 2018-27]. In einer der ersten Studien mit SMC Abstammung Ablaufverfolgung außerhalb der Embryogenese Einstellung lieferte Speer Et Al.14 Beweis, dass SMC ihren Phänotyp und Transdifferentiate in Chondrogenic Zellen während der Gefäßverkalkung mittels modulieren kann ein SM22α Cre R26R LacZ Abstammung Ablaufverfolgung Modell. Obwohl diese Studien SMC Abstammung Ablaufverfolgung Pionierarbeit geleistet, waren sie teilweise nicht eindeutig, dass bestimmten nicht-SMC mit dem Ausdruck ihrer SM22α in der Umgebung von der Krankheit des Reporters beschriftet werden würde. Diese Einschränkung hat durch die Entwicklung und Verwendung von Tamoxifen-induzierbaren Cre ERT/LoxP ermöglicht eine zeitliche Steuerung der Zelle Kennzeichnung umgangen wurden. Zelle Kennzeichnung tritt ausschließlich während Tamoxifen Lieferung und wird auf die Zelle mit dem Ausdruck des Zelle typspezifische Projektträgers fahren Cre ERT Ausdruck zum Zeitpunkt der Tamoxifen Exposition vermeiden Verfolgung alternativer Zelltypen aktivieren Cre in begrenzt sein, die Einstellung des Fortschreitens der Krankheit. Für die Linie Ablaufverfolgung des SMC in Atherosklerose, die Tamoxifen-induzierbaren Myh11– Cre/ERT2 Transgen verbunden mit fluoreszierenden Reporter (eYFP7,15,17,18 , 21, mTmG19,25, Konfetti20,22,23 für klonale Expansion Studien) zeigte eine bemerkenswerte Effizienz und Spezifität in SMC-labeling und hat zum Schicksal Karte SMC Populationen in atherosklerotischen Läsionen in neueren Studien verwendet worden. Wichtig ist, diese Studien ergab, dass: 1) 80 % der SMC in fortgeschrittene atherosklerotische Läsionen tun nicht ausdrücklich alle herkömmlichen SMC-Marker (ACTA2, MYH11) Immunohistologische Analyse verwendet und daher haben würde ohne Abstammung Ablaufverfolgung misidentified wurden 17; (2) Teilmengen von SMC express Marker für andere Zelltypen einschließlich Makrophagen Marker oder mesenchymalen Stammzell-Marker16,17,19; und 3) SMC investieren und bevölkern die atherosklerotische Läsion durch den Oligoclonal Ausbau und SMC Klone behalten Plastizität, Übergang zum phänotypisch verschiedenen Populationen20,23. Zusammenfassend lässt sich sagen, ist es nun klar, dass die glatten Muskelzellen in atherosklerotischen Läsionen eine bemerkenswerte phänotypische Vielfalt zu präsentieren und können vorteilhafte oder nachteilige Rollen auf Läsion Pathogenese abhängig von der Art ihrer phänotypischen Übergänge. Diese Entdeckungen sind eine bemerkenswerte neue therapeutische Allee für targeting SMC Athero-Förderung phänotypische Übergängen in fortgeschrittenen Atherosklerose.
Hier schlagen wir ein standardisiertes Protokoll für die Analyse der Spätphase murinen atherosklerotischer Läsionen einschließlich systematische Methoden für tierischen Dissektion, einbetten, schneiden, färben und Quantifizierung der Brachiocephalic Arterie Läsionen. Um die Wirkung von Interleukin-1β Hemmung auf SMC Schicksal und Phänotyp bestimmen, haben wir SMC Linie nachzeichnen ApoE– / – Mäusen eine westliche Diät gefüttert, für 18 Wochen vor Erhalt wöchentliche Injektionen eines Anti-IL1β Antikörper oder angepasst Isotype IgG-Steuerelements verwendet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Trotz jahrzehntelanger Forschung und technische Fortschritte in der Atherosklerose zu studieren hat das Feld eine enttäuschende Geschichte der Übersetzung wissenschaftlicher Erkenntnisse auf Therapien34,35. Dieses Phänomen kann teilweise durch Diskrepanzen in Tiermodellen, experimentellen Designs und Läsion Analysen erklärt werden. Hier beschreiben wir eine experimentelle-Pipeline, die wir, die zelluläre Zusammensetzung in fortgeschrittene atherosklerotisch…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken die Mitte für biologische Bildgebung (unterstützt von NIH 1S10OD019973-01) an der University of Pittsburgh für ihre Unterstützung. Diese Arbeit wurde unterstützt durch stützt sich auf wissenschaftliche Development Grant 15SDG25860021 von der American Heart Association, D.G. R.A.B wurde durch NIH gewähren F30 HL136188.
Materials
| 16% Paraformaldehyde aqueous solution | Electron Microscopy Sciences | RT 15710 | Tissue perfusion and fixation |
| 23G butterfly needle | Fisher | BD367342 | |
| 25G needle | Fisher | 14-821-13D | |
| A1 Confocal microscope | Nikon | Confocal microscope | |
| ACTA2-FITC antibody (mouse) | Sigma Aldrich | F3777 | Primary Antibody |
| Alexa-647 anti goat | Invitrogen | A-21447 | Secondary antibody |
| Antigen Unmasking solution, Citric acid based | Vector Labs | H-3300 | Antigen retrieval solution |
| Chow Diet | Harlan Teklad | TD.7012 | |
| Coverslip | Fisher | 12-544-14 | Any 50 x 24 mm cover glass |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | Nucleus fluorescent counterstaining |
| Donkey Alexa-488 anti-rabbit | Invitrogen | A-21206 | Secondary antibody |
| Donkey Alexa-555 anti-rat | Abcam | ab150154 | Secondary antibody |
| DPBS 10X without Calcium and Magnesium | Gibco | 14200166 | PBS for solution dilutions and washes. Dilute to 1x in deionized water |
| Embedding cassette | Fisher | 15-182-701D | |
| ETDA vacuum tube | Fisher | 02-685-2B | |
| Ethanol 200 proof | Decon | 2701 | |
| Foam pad | Fisher | 22-222-012 | |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma Aldrich | G7765 | |
| GFP antibody (goat) | abcam | ab6673 | Primary antibody |
| goat IgG control | Vector Labs | I-5000 | IgG control |
| High Fat Diet | Harlan Teklad | TD.88137 | |
| ImageJ | NIH | Computer program https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| LGALS3 antibody (rat) | Cedarlane | CL8942AP | Primary antibody |
| LSM700 confocal microscope | Zeiss | Confocal microscope | |
| Microscope Slides, Superfrost Plus | Fisher | 12-550-15 | |
| Microtome blades | Fisher | 30-538-35 | |
| Mouse IgG control | Vector Labs | I-2000 | IgG control |
| NIS element imaging software | Nikon | Imaging software for z-stack image acquisition | |
| Normal Horse serum | Sigma Aldrich | H1270 | |
| Pap Pen | Fisher | 50-550-221 | |
| Peanut oil | Sigma | P2144 | |
| Prolong gold Antifade mountant | Invitrogen | P36930 | Mounting medium |
| Rabbit IgG control | Vector Labs | I-1000 | IgG control |
| Rat IgG control | Vector Labs | I-4000 | IgG control |
| RUNX2 antibody (rabbit) | Abcam | ab192256 | Primary Antibody |
| Syringe | BD | 309628 | 1 ml syringe |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| Xylene | Fisher | X55K-4 | |
| Zen imaging software | Zeiss | Imaging software for z-stack image acquisition |
Riferimenti
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