स्तनधारी कोशिका चक्र के दौरान सक्रिय प्रोटीन काइनेज आरएनए के आरएनए इंटरएक्टर्स का अध्ययन
Summary
हम आरएनए-डबल-असहाय आरएनए बाइंडिंग प्रोटीन काइनेज आरएनए के interactors-सक्रिय (pkr) स्तनधारी कोशिका चक्र के दौरान हेला कोशिकाओं का उपयोग कर के अध्ययन के लिए प्रायोगिक दृष्टिकोण मौजूद हैं । इस विधि के लिए formaldehyde crosslink आरएनए-pkr परिसरों और immunopरेसिपिटेशन pkr-बाउंड rna को समृद्ध करने के लिए इस्तेमाल करता है । इन rnas आगे उच्च throughput अनुक्रमण या qrt-पीसीआर के माध्यम से विश्लेषण किया जा सकता है ।
Abstract
प्रोटीन काइनेज आरएनए-एक्टिवेट (pkr) जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्रोटीन का एक सदस्य है और वायरल rna के दोहरे असहाय द्वितीयक संरचना को पहचानता है । जब वायरल डबल-असहाय rnas (dsrnas) के लिए बाध्य, pkr dimerization और बाद ऑटोफॉस्फोरिलेशन से गुजरती है । फ़ॉस्फ़ाइलेटेड pkr (ppkr) सक्रिय हो जाता है और वैश्विक अनुवाद को दबाने के लिए यूकार्योटिक दीक्षा फैक्टर 2 (eIF2α) के अल्फा सबयूनिट के फॉस्लिलेशन को प्रेरित करता है । बढ़ती सबूत पता चलता है कि pkr जैसे कोशिका चक्र के दौरान या संक्रमण के बिना विभिंन तनाव की स्थिति के तहत शारीरिक स्थितियों के तहत सक्रिय किया जा सकता है । हालांकि, pkr के आरएनए activators के बारे में हमारी समझ एक मानकीकृत प्रयोगात्मक विधि की कमी के कारण सीमित है पर कब्जा करने और pkr-बातचीत dsrnas का विश्लेषण । यहां, हम एक प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करने के लिए विशेष रूप से समृद्ध और विश्लेषण कक्ष चक्र के दौरान pkr बाध्य rnas HeLa कोशिकाओं का उपयोग कर । हम formaldehyde के कुशल क्रॉसलिंकिंग गतिविधि pkr-आरएनए परिसरों को ठीक करने और immunopरेसिपिटेशन के माध्यम से उन्हें अलग करने के लिए उपयोग । pkr सह immunoprecipitated rnas फिर एक उच्च throughput अनुक्रमण पुस्तकालय उत्पन्न करने के लिए आगे संसाधित किया जा सकता है । pkr-इंटरैक्ट सेलुलर dsrnas का एक प्रमुख वर्ग mitochondrial rnas (mtrnas) है, जो भारी-किनारा और प्रकाश-किनारा rnas के बीच पूरक बातचीत के माध्यम से अंतराआण्विक dsrnas के रूप में मौजूद कर सकते हैं. इन द्वैध mtrnas के strandedness का अध्ययन करने के लिए, हम भी strand-विशिष्ट qrt-पीसीआर के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । हमारा प्रोटोकॉल pkr-बाउंड rnas के विश्लेषण के लिए ऑप्टिमाइज़ किया गया है, लेकिन यह अन्य dsrnas बाइंडिंग प्रोटीन के सेलुलर dsrnas या rnas-interactors का अध्ययन करने के लिए आसानी से संशोधित कर सकते हैं ।
Introduction
प्रोटीन काइनेज आरएनए-एक्टिवेट (pkr), जिसे यूकार्योटिक दीक्षा फैक्टर 2-अल्फा काइनेज 2 (EIF2AK2) के रूप में भी जाना जाता है, एक अच्छी तरह से विशेषता वाला प्रोटीन काइनेज है जो rna द्वारा प्रदान की गई जानकारी पहुंचाता है । यह यूकर्योटिक अनुवाद दीक्षा 2 सबयूनिट अल्फा (eIF2α) काइनेज परिवार और फॉस्फारिलेट के अंतर्गत आता है eIF2α सेरीन ५१ में संक्रमण के जवाब में वैश्विक अनुवाद को दबाने के लिए1. इस संदर्भ में, pkr वायरल डबल-असहाय rnas (dsrnas), जो pkr dimerization और ऑटोफॉस्फोरिलेशन2के लिए एक मंच प्रदान द्वारा सक्रिय है । eIF2α के अलावा, pkr भी p53 फॉस्फ़ायलेट कर सकते हैं, इंसुलिन रिसेप्टर सब्सट्रेट 1, अवरोधक κb, और सी-जून N-टर्मिनल काइनेज (jnk) कई संकेत पारक्रमण रास्ते की गतिविधि को विनियमित करने के लिए3,4,5, 6.
pkr मूल रूप से एक कळेनासे के रूप में पहचान की थी कि पोलियो वायरस संक्रमण के दौरान eIF2α ‘ पोलियो वायरस ‘ dsrnas7,8पहचानने से । pkr तेजी से प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया से परे बहुमुखी भूमिकाओं खेलने पाया है, और इसके ंयायपालिका सक्रियण या खराबी कई मानव रोगों में निहित है । सक्रिय/फॉसफोरिलेटेड pkr (ppkr) अक्सर एपोप्टोसिस के दौरान देखा जाता है और अपक्षयी रोगों, विशेष रूप से न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों जैसे कि हंटिंगटन, पार्किंसंस, और अल्जाइमर रोग 9 के साथ रोगियों की एक आम विशेषता है । ,10,11,12,13. इसके अलावा, pkr चयापचय तनाव और गर्मी सदमे के रूप में विभिंन तनाव की स्थिति के तहत सक्रिय है14,15,16,17। दूसरी ओर, वृद्धि हुई कोशिका प्रसार और यहां तक कि घातक परिवर्तन में pkr परिणाम के निषेध18,19। pkr समारोह भी सामांय मस्तिष्क समारोह में महत्वपूर्ण है और कोशिका चक्र के दौरान के रूप में ppkr के स्तर एम चरण20,21,22के दौरान ऊंचा है । इस संदर्भ में, ppkr वैश्विक अनुवाद को रोकता है और कुंजी समसूत्री संकेतन प्रणालियों के लिए cues प्रदान करता है कि उचित सेल प्रभाग20के लिए आवश्यक हैं । इसके अलावा, pkr के लंबे समय तक सक्रियण के परिणामस्वरूप G2 में चीनी हंसटर अंडाशय सेल23/ नतीजतन, pkr फ़ॉस्फायलीकरण को नकारात्मक प्रतिक्रिया लूप द्वारा विनियमित किया जाता है जिससे M/G1 संक्रमण21के दौरान तेजी से निष्क्रियण सुनिश्चित होता है ।
pkr समारोह की विस्तृत श्रृंखला के बावजूद, pkr सक्रियण की हमारी समझ एक मानकीकृत उच्च throughput प्रयोगात्मक दृष्टिकोण पर कब्जा करने के लिए और dsrnas कि pkr सक्रिय कर सकते है की पहचान की कमी के कारण सीमित है । पिछले अध्ययनों से पता चला है कि pkr दो उल्टे Alu दोहराता द्वारा गठित dsrnas के साथ बातचीत कर सकते हैं (iralus)20,24, लेकिन अतिरिक्त सेलुलर dsrnas के अस्तित्व की संभावना है कि सेल चक्र के दौरान या के तहत pkr सक्रिय कर सकते हैं मानव कोशिकाओं में तनाव की स्थिति बेरोज़गारी थी । एक आरएनए बाइंडिंग प्रोटीन (आरबीपी) के आरएनए-इंटरएक्टरों की पहचान करने के लिए पारंपरिक दृष्टिकोण यूवी प्रकाश का उपयोग करता है आरएनए-आरबीपी कॉम्प्लेक्स25,26,27। एक ताजा अध्ययन इस यूवी crosslinking दृष्टिकोण एक माउस प्रणाली में लागू किया है और पहचान की है कि छोटे nucleolar rnas चयापचय तनाव16के दौरान pkr सक्रियण को विनियमित कर सकते हैं । formaldehyde के उच्च crosslinking दक्षता का उपयोग करके, हम एक वैकल्पिक विधि हेला कोशिकाओं28में सेल चक्र के दौरान pkr बातचीत rnas की पहचान करने के लिए प्रस्तुत किया । एक समान दृष्टिकोण अन्य dsrbps जैसे staufen और drosha29,30,31का अध्ययन करने के लिए लागू किया गया है. हमने पाया है कि pkr noncoding rnas के विभिंन प्रकार के साथ बातचीत कर सकते है जैसे लघु interspersed परमाणु तत्व (ज्या), लंबी interspersed परमाणु तत्व (रेखा), अंतर्जात retrovirus तत्व (ERV), और यहां तक कि अल्फा उपग्रह rnas । इसके अलावा, हमने दिखाया है कि pkr mitochondrial rnas (mtrnas), जो भारी-किनारा और प्रकाश कतरा rnas28के बीच पूरक बातचीत के माध्यम से अंतराआण्विक dsrnas फार्म के साथ बातचीत कर सकते हैं । हाल ही में एक प्रकाशन आगे हमारे डेटा है कि कुछ mtrnas एक द्वैध रूप में मौजूद है और इस तरह के मेलेनोमा भेदभाव के रूप में dsrna सेंसर सक्रिय कर सकते है समर्थन किया-जुड़े प्रोटीन 5 इंटरपोरों३२प्रेरित करने के लिए । इससे भी महत्वपूर्ण बात, अभिव्यक्ति और mtrnas के subcellular स्थानीयकरण सेल चक्र के दौरान और विभिन्न तनाव, जो उनके pkr सक्रियण28को विनियमित करने की क्षमता में महत्वपूर्ण हो सकता है द्वारा संग्राहक रहे हैं ।
इस अनुच्छेद में, हम एक विस्तृत प्रोटोकॉल के लिए एक हाल ही में विकसित formaldehyde crosslinking और immunopरेसिसिटेशन (fclip) विधि को पकड़ने और विश्लेषण pkr-बातचीत rnas सेल चक्र के दौरान । हम कोशिका चक्र गिरफ्तारी के नमूनों को थाइमिडीन और नोकोडाज़ोल का उपयोग कर तैयार करने के लिए विधि का प्रदर्शन करते हैं । हम फिर fclip प्रक्रिया pkr-बाउंड rnas और इन rnas की पहचान करने के लिए उच्च-थ्रौपुट अनुक्रमण लायब्रेरी को तैयार करने के लिए एक विधि को अलग करने के लिए प्रस्तुत है । इसके अलावा, हम qrt-पीसीआर का उपयोग कर pkr-बाउंड rnas का विश्लेषण करने के लिए विस्तृत प्रक्रियाओं को चित्रित । विशेष रूप से, हम एक कतरा-विशिष्ट रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन प्रक्रिया के लिए mtrnas के strandedness का विश्लेषण प्रस्तुत करते हैं । वर्णित प्रोटोकॉल HeLa कोशिकाओं और pkr के लिए अनुकूलित है, लेकिन इस तरह के सेल चक्र नमूना, fclip, और कतरा-विशिष्ट qrt-पीसीआर विश्लेषण की तैयारी के रूप में महत्वपूर्ण कदम आसानी से सेलुलर dsrnas अध्ययन करने के लिए या अंय dsrnas के आरएनए interactors की पहचान संशोधित किया जा सकता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
एस या एम चरण-गिरफ्तार नमूनों को तैयार करने की प्रक्रिया चित्रा 1में सचित्र है । एस चरण में कोशिकाओं को गिरफ्तार करने के लिए, हम एक थाइमिडीन डबल ब्लॉक विधि का इस्तेमाल किया, जहां हम के बीच में ए?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम कोरिया के राष्ट्रीय अनुसंधान फाउंडेशन के माध्यम से बुनियादी विज्ञान अनुसंधान कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था (nrf) विज्ञान और आईसीटी के कोरियाई सरकार के मंत्रालय द्वारा वित्त पोषित (nrf-2016r1c1b2009886).
Materials
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9260G | |
| 1 M Tris, pH 7.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9855G | |
| 1 M Tris, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9855G | |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-175-C | |
| 10% Nonidet-p40 (NP-40) | Biosolution | BN015 | |
| 10% Urea-acrylamide gel solution | 7 M (w/v) Urea and 0.5X TBE, stored protected from light at 4 °C | ||
| 10X DNA loading buffer | TaKaRa | 9157 | |
| 15 mL conical tube | SPL | 50015 | |
| 3' adaptor | 5'-rApp NN NNT GGA ATT CTC GGG TGC CAA GG/3ddC/-3' | ||
| 3 M Sodium Acetate pH 5.5 | Thermo Fisher Scientific | AM9740 | |
| 5' adaptor | 5'-GUU CAG AGU UCU ACA GUC CGA CGA UCN NNN-3' | ||
| 5 M NaCl | Thermo Fisher Scientific | AM9760G | |
| 50 mL conical tube | SPL | 50050 | |
| Acid-phenol chloroform, pH 4.5 | Thermo Fisher Scientific | AM9722 | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic beads DNA/RNA clean up |
| Antarctic alkaline phosphatase | New England Biolabs | M0289S | |
| Anti-DGCR8 | Made in house | ||
| Anti-PKR (D7F7) | Cell signaling technology | 12297S | |
| Anti-PKR (Milli) | Millipore EMD | 07-151 | |
| ATP (100 mM) | GE Healthcare | GE27-2056-01 | |
| Bromophenol blue sodium salt | Sigma-aldrich | B5525 | |
| Calf intestinal alkaline phosphatase | TaKaRa | 2250A | |
| Cell scraper 25 cm 2-position | Sarstedt | 83.183 | |
| CMV promoter sequence | 5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3' | ||
| Dulbecco's modified eagle medium | Welgene | LM001-05 | |
| dNTP mixture (2.5 mM) | TaKaRa | 4030 | |
| Ethanol, Absolute, ACS Grade | Alfa-Aesar | A9951 | |
| Fetal bovine serum | Merck | M-TMS-013-BKR | |
| Formamide | Merck | 104008 | |
| Glycine | Bio-basic | GB0235 | |
| GlycoBlue coprecipitant (15 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | AM9516 | |
| Isopropanol | Merck | 8.18766.1000 | |
| NEBNext rRNA Depletion Kit | New England Biolabs | E6318 | rRNA Depletion Kit |
| Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404 | |
| Normal rabbit IgG | Cell signaling technology | 2729S | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 6148 | |
| PCR forward primer (RP1) | 5'-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GCG ATC TAC ACG TTC AGA GTT CTA CAG TCC GA-3' | ||
| PCR index reverse primer (RPI) | 5'-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT NNN NNN GTG ACT GGA GTT CCT TGG CAC CCG AGA ATT CCA-3' | ||
| PCR tubes with flat cap, 0.2 mL | Axygen | PCR-02-C | |
| Phosphate bufered saline (PBS) Tablet | TaKaRa | T9181 | |
| Phusion high-fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530 | High-fidelity polymerase |
| PlateFuge microcentrifuge with swing-out rotor | Benchmark | c2000 | |
| Polynucleotide kinase (PNK) | TaKaRa | 2021A | |
| Protease inhibitor cocktail set III | Merck | 535140-1MLCN | |
| Proteinase K, recombinant, PCR Grade | Sigma-Aldrich | 3115879001 | |
| qPCR primer sequence: CO1 Heavy | Forward/Reverse: 5′-GCCATAACCCAATACCAAACG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO1 Light | Forward/Reverse: 5′-TTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO2 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO2 Light | Forward/Reverse: 5′-GTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO3 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO3 Light | Forward/Reverse: 5′-CTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CYTB Heavy | Forward/Reverse: 5′-CAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CYTB Light | Forward/Reverse: 5′-GGATAGTAATAGGGCAAGGACG -3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: GAPDH | Forward/Reverse: 5′-CAACGACCACTTTGTCAAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND1 Heavy | Forward/Reverse: 5′-TCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND1 Light | Forward/Reverse: 5′-GTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND4 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CTCACACTCATTCTCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND4 Light | Forward/Reverse: 5′-TGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND5 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CTAGGCCTTCTTACGAGCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND5 Light | Forward/Reverse: 5′-TAGGGAGAGCTGGGTTGTTT-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND6 Heavy | Forward/Reverse: 5′-TCATACTCTTTCACCCACAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND6 Light | Forward/Reverse: 5′-TGCTGTGGGTGAAAGAGTATG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| Random hexamer | Thermo Fisher Scientific | SO142 | |
| Recombinant Dnase I (Rnase-free) (5 U/μL) | TaKaRa | 2270A | |
| Recombinant Rnase inhibitor (40 U/μL) | TaKaRa | 2313A | |
| Ribo-Zero rRNA Removal Kit | Illumina | MRZH116 | rRNA Removal Kit |
| Rotator | FINEPCR, ROTATOR AG | D1.5-32 | |
| RT primer sequence: CO1 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′ | ||
| RT primer sequence: CO1 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGCCATAACCCAATACCAAACG-3′ | ||
| RT primer sequence: CO2 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′ | ||
| RT primer sequence: CO2 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′ | ||
| RT primer sequence: CO3 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′ | ||
| RT primer sequence: CO3 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′ | ||
| RT primer sequence: CYTB Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGATAGTAATAGGGCAAGGACG-3′ | ||
| RT primer sequence: CYTB Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′ | ||
| RT primer sequence: GAPDH | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGAGCGATGTGGCTCGGCT-3′ | ||
| RT primer sequence: ND1 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND1 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND4 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND4 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTCACACTCATTCTCAACCC-3′ | ||
| RT primer sequence: ND5 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTTGGGTTGAGGTGATGATG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND5 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCATTGTCGCATCCACCTTTA-3′ | ||
| RT primer sequence: ND6 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGTTGAGGTCTTGGTGAGTG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND6 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCCATAATCATACAAAGCCCC-3′ | ||
| Siliconized polypropylene 1.5 mL G-tube | Bio Plas | 4167SLS50 | |
| Sodium dedecyl sulfate | Biosesang | S1010 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| SUPERase In Rnase inhibitor | Thermo Fisher Scientific | AM2694 | |
| SuperScript III reverse transcriptase | Thermo Fisher Scientific | 18080093 | Reverse transcriptase for library preparation |
| SuperScript IV reverse transcriptase | Thermo Fisher Scientific | 18090010 | Reverse transcriptase for qRT-PCR |
| SYBR gold nucleic acid gl stain | Thermo Fisher Scientific | S11494 | |
| T4 polynucleotide kinase | New England Biolabs | M0201S | |
| T4 RNA ligase 1 (ssRNA Ligase) | New England Biolabs | M0204 | |
| T4 RNA ligase 2, truncated KQ | New England Biolabs | M0373 | |
| Thermomixer | Eppendorf ThermoMixer C with ThermoTop | ||
| Thymidine | Sigma-Aldrich | T9250 | |
| Tris-borate-EDTA buffer (TBE) | TaKara | T9122 | |
| Triton X-100 | Promega | H5142 | |
| Ultralink Protein A sepharose beads | Thermo Fisher Scientific | 22810 | Protein A beads |
| Ultrasonicator | Bioruptor | ||
| Urea | Bio-basic | UB0148 | |
| Vortex mixer | DAIHAN Scientific | VM-10 | |
| Xylene cyanol | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| γ-32P-ATP (10 μCi/μL, 3.3 μM) | PerkinElmer | BLU502A100UC |
References
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