Summary
Vi presentiamo approcci sperimentali per studi interattori di RNA double-stranded RNA binding della chinasi di proteina RNA-attivato (PKR) durante il ciclo cellulare dei mammiferi utilizzando cellule HeLa. Questo metodo utilizza la formaldeide a crosslink RNA-PKR complessi e immunoprecipitazione per arricchire associato a PKR RNAs. Questi RNA possono essere ulteriormente analizzati mediante sequenziamento ad alte prestazioni o qRT-PCR.
Abstract
Protein chinasi attivata da RNA (PKR) è un membro della risposta immunitaria innata di proteine e riconosce la struttura secondaria del doppio filamento di RNA virale. Quando associato a virale RNA double-stranded (dsRNA), PKR subisce la dimerizzazione e successive autophosphorylation. PKR fosforilato (pPKR) diventa attivo e induce la fosforilazione della subunità alfa di fattore di iniziazione eucariotica 2 (eIF2α) per sopprimere traduzione globale. La prova aumentante suggerisce che PKR può essere attivato in condizioni fisiologiche, come durante il ciclo cellulare o in varie condizioni di stress senza infezione. Tuttavia, la nostra comprensione degli attivatori RNA di PKR è limitata a causa della mancanza di un metodo sperimentale standardizzata per acquisire e analizzare RNAds PKR-interazione. Qui, presentiamo un sperimentale protocollo specificamente arricchire e analizzare PKR associato RNAs durante il ciclo cellulare utilizzando cellule HeLa. Utilizziamo l'attività di reticolazione efficiente di formaldeide per risolvere complessi PKR-RNA e isolarli tramite immunoprecipitazione. PKR co-immunoprecipitate RNAs poi possono essere ulteriormente elaborati per generare una libreria di sequenziamento ad alte prestazioni. Una classe importante di PKR-interazione cellulare RNAds è RNA mitocondriale (mtRNAs), che può esistere come intermolecolari RNAds attraverso l'interazione complementare tra il pesante-strand e il RNAs luce-strand. Per studiare la strandedness di questi mtRNAs duplex, presentiamo anche un protocollo per la qRT-PCR strand-specific. Il nostro protocollo è ottimizzato per l'analisi di RNA associati a PKR, ma può essere facilmente modificato per studiare cellulare RNAds o RNA-interattori delle altre proteine che legano il dsRNA.
Introduction
Protein chinasi attivata da RNA (PKR), chinasi di iniziazione eucariotica noto anche come fattore 2-alfa 2 (EIF2AK2), è una chinasi di proteina ben caratterizzati che trasmette informazioni fornite da RNA. Appartiene all'alfa subunità iniziazione 2 traduzione negli eucarioti (eIF2α) famiglia delle chinasi fosforila eIF2α a serina 51 in risposta all'infezione di sopprimere traduzione globale1. In questo contesto, PKR è attivato da virale RNA double-stranded (dsRNA), che fornisce una piattaforma per PKR dimerizzazione e autophosphorylation2. Oltre a eIF2α, PKR anche può fosforilare p53, insulina recettore substrato 1, inibitore κB e c-Jun N-terminal kinase (JNK) di regolare l'attività di numerosi segnale trasduzione vie3,4,5, 6.
PKR è stata originariamente identificata come una chinasi che fosforilata eIF2α durante l'infezione del virus polio attraverso il riconoscimento RNAds7,8 dei virus polio. PKR è sempre trovato a giocare ruoli poliedrico oltre la risposta immunitaria, e la sua attivazione aberrante o malfunzionamento è implicato in numerose malattie umane. Attivato/Phosphorylated PKR (pPKR) è osservata frequentemente durante l'apoptosi ed è una caratteristica comune dei pazienti con di malattie degenerative, in particolare malattie neurodegenerative come il morbo di Huntington, morbo di Parkinson ed il morbo di Alzheimer di9 ,10,11,12,13. Inoltre, PKR è attivato in varie condizioni di stress come stress metabolico e calore shock14,15,16,17. D'altra parte, l'inibizione di PKR provoca aumento della proliferazione cellulare e trasformazione maligna anche18,19. Funzione PKR è importante anche nella funzione normale del cervello e durante il ciclo cellulare come il livello di pPKR è elevato durante la fase di M20,21,22. In questo contesto, pPKR sopprime traduzione globale e fornisce spunti per sistemi di segnalazione mitotic chiave necessari per la corretta divisione cellulare20. Inoltre, attivazione prolungata di PKR provocato dalla fase G2/M23celle di arresto del ciclo cellulare in ovaia cinese del criceto. Di conseguenza, la fosforilazione di PKR è regolata dal ciclo di feedback negativo per garantire la rapida disattivazione durante la transizione di G1/M21.
Nonostante la funzione di vasta gamma di PKR, la nostra comprensione dell'attivazione di PKR è limitata a causa della mancanza di un approccio sperimentale ad alta produttività standardizzato per catturare e identificare dsRNA che può attivare PKR. Precedenti studi hanno mostrato che PKR può interagire con RNAds formata da due invertito Alu ripetizioni (IRAlus)20,24, ma la possibilità dell'esistenza di ulteriori RNAds cellulare che può attivare PKR durante il ciclo cellulare o sotto condizioni di stress nelle cellule umane è stato esplorato. L'approccio convenzionale nell'identificare RNA-Interactiani di una proteina obbligatoria del RNA (RBP) utilizza la luce UV a crosslink RNA-RBP complessi25,26,27. Uno studio recente ha applicato questo approccio di reticolazione UV in un sistema di mouse e identificato che small nucleolar RNA può regolare l'attivazione di PKR durante lo sforzo metabolico16. Utilizzando la reticolazione ad alta efficienza di formaldeide, abbiamo presentato un metodo alternativo per identificare PKR-interacting RNA durante il ciclo cellulare di cellule HeLa28. Un approccio simile è stato applicato per studiare altri dsRBPs come Staufen e Drosha29,30,31. Abbiamo trovato che PKR può interagire con vari tipi di RNA non codificanti come breve elemento nucleare sparpagliato (SINE), lunga sparpagliato elemento nucleare (linea), elemento di retrovirus endogeno (ERV) e anche alfa-satellite RNAs. Inoltre, abbiamo mostrato che PKR può interagire con il RNA mitocondriale (mtRNAs), quale forma intermolecolari RNAds attraverso l'interazione complementare tra la luce e il pesante-strand filo RNAs28. Una recente pubblicazione supportata ulteriormente i nostri dati che alcuni mtRNAs esistere in una forma duplex e può attivare sensori di dsRNA come proteina di differenziazione-collegata del melanoma 5 per indurre gli interferoni32. Ancora più importante, l'espressione e la localizzazione subcellulare di mtRNAs sono modulati durante il ciclo cellulare e di vari fattori di stress, che può essere importante nella loro capacità di regolare l'attivazione di PKR28.
In questo articolo, presentiamo un protocollo dettagliato per una reticolazione formaldeide sviluppata di recente e immunoprecipitazione (fCLIP) metodo per acquisire e analizzare PKR-interacting RNA durante il ciclo cellulare. Dimostriamo il metodo per preparare campioni di arresto del ciclo cellulare usando timidina e nocodazole. Presentiamo quindi il processo di fCLIP per isolare associato a PKR RNAs e un metodo per preparare la biblioteca di sequenziamento ad alte prestazioni per identificare questi RNA. Inoltre, abbiamo delineare le procedure dettagliate per analizzare associato a PKR RNA mediante qRT-PCR. In particolare, presentiamo una procedura di trascrizione inversa strand-specifico per analizzare la strandedness di mtRNAs. Il protocollo descritto è ottimizzato per le cellule HeLa e PKR, ma passaggi chiave quali la preparazione del campione di ciclo cellulare, fCLIP e analisi specifiche del filo qRT-PCR possono essere facilmente modificati per studiare cellulare RNAds o per identificare gli interattori di RNA di altri dsRBPs.
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Protocol
1. soluzione e cella preparazione
- Preparazione della soluzione
- Per il mezzo di coltura cellulare, preparare il supporto per la coltura delle cellule HeLa aggiungendo 50 mL di siero bovino fetale (FBS) a 500 mL di Medium per volta dell'Aquila di Dulbecco (DMEM).
Nota: Gli antibiotici possono essere aggiunti al terreno di coltura delle cellule, ma non usiamo gli antibiotici. - Per il 0,1% di paraformaldeide, sciogliere paraformaldeide al 4% (p/v) in 1 x Phosphate-Buffered salino (PBS) con riscaldamento su un piatto caldo e diluire a fare 30 mL di 0,1% (v/v) paraformaldeide aggiungendo 1X PBS.
Attenzione: Eseguire tutti i passaggi in una cappa aspirante e fare attenzione a non far bollire la soluzione di paraformaldeide. Proteggere la soluzione 0,1% dalla luce e conservare a 4 ° C. Utilizzare la soluzione entro un mese.
Nota: Il pH della soluzione di paraformaldeide 0.1% (v/v) finale dovrebbe essere circa 7. - Preparare il tampone di lisi di fCLIP: 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 15 mM NaCl, 10 mM EDTA, 0.5% (v/v) nonidet-p40 (NP-40), 0.1% (v/v) X-100 Triton, 0.1% (v/v) sodio dodecil solfato (SDS) e 0,1% (p/v) sodio desossicolato. Aggiungere acqua distillata tripla (TDW) a 40 mL. Conservare a 4 ° C.
- Preparare il tampone di lavaggio di fCLIP: 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 0.1% (v/v) NP-40, 0.1% (v/v) Triton X-100, 0.1% (v/v) SDS e 0,1% (p/v) sodio desossicolato. Aggiungere TDW a 40 mL. Conservare a 4 ° C.
- Preparare 4 x buffer di PK: 400 mM Tris-HCl (pH 7.5), 200 mM NaCl, 40 mM EDTA e SDS 4% (v/v). Aggiungere TDW a 40 mL. Conservare a temperatura ambiente.
- Preparare il tampone di eluizione di fCLIP: 20 mL di buffer di PK, 21 g di urea e 8,5 mL di TDW: 4x. Preparare fresco.
- Preparare il tampone di eluizione di RNA: 0,3 M NaOAc e SDS 2% (p/v). Conservare a temperatura ambiente.
- Preparare 2 x tintura di caricamento del RNA: 0.025% (p/v) azzurro del bromofenolo, 0.025% (p/v) xilene cianolo, 5 mM di EDTA, 0,05% (p/v) SDS e formammide 95% (v/v). Conservare a-20 ° C.
- Preparare 1 x TBE tampone: 0.089 M Tris-borato e 0,002 M EDTA. Preparare 500 mL di tampone TBE.
- Per il mezzo di coltura cellulare, preparare il supporto per la coltura delle cellule HeLa aggiungendo 50 mL di siero bovino fetale (FBS) a 500 mL di Medium per volta dell'Aquila di Dulbecco (DMEM).
- Preparazione delle cellule di fase-arrestato S o M
- Seme ~ 750.000 o ~ 1.000.000 cellule di HeLa per campioni arrestato in fase S o M, rispettivamente. Crescere le cellule a 37 ° C e 5% di CO2 per 24 h.
- Trattare le cellule con timidina 2mm e incubare per 18 h a 37 ° C.
- Lavare le cellule due volte con PBS. Aggiungi media fresco e incubare per 9 h a 37 ° C.
- Per cellule di fase-arrestato S, trattare le cellule con timidina 2 mM. Per cellule di fase-arrestato M, trattare le cellule con 100 ng/mL nocodazole. Incubare per 15 h a 37 ° C e raccolto le cellule.
Nota: L'omogeneità dei campioni ciclo cellulare può essere controllato usando FACS.
2. formaldeide cross-linking e immunoprecipitazione
- Colture di cellule
- Per un esempio di fase S, raccogliere le cellule con un raschietto di cella e il trasferimento in una provetta conica da 15 mL. Per un esempio di fase M, tocca il lato della piastra di coltura cellulare per staccare le cellule di fase-arrestato M e trasferirli in una provetta conica da 15 mL.
Nota: Per aumentare l'omogeneità delle cellule M fase-arrestato, non usare un raschietto di cella. - Centrifugare le cellule a 380 x g a temperatura ambiente per 3 minuti rimuovere il surnatante e risospendere con 1 mL di PBS freddo e il trasferimento in una microcentrifuga da 1,5 mL.
- Centrifugare le cellule a 10.000 x g a 4 ° C per 30 s. rimuovere il surnatante completamente.
- Per un esempio di fase S, raccogliere le cellule con un raschietto di cella e il trasferimento in una provetta conica da 15 mL. Per un esempio di fase M, tocca il lato della piastra di coltura cellulare per staccare le cellule di fase-arrestato M e trasferirli in una provetta conica da 15 mL.
- Reticolazione di formaldeide
- Aggiungere 750 μL di 0,1% paraformaldeide per 10 min a temperatura ambiente per fissare le cellule.
- Aggiungere 250 µ l di 1 M glicina e incubare per altri 10 min a temperatura ambiente per placare la reazione. Centrifugare le cellule a 10.000 x g a 4 ° C per 30 s. rimuovere il surnatante completamente.
- Risospendere con 1 mL di PBS. Centrifugare le cellule a 10.000 x g a 4 ° C per 30 s e rimuovere il surnatante.
- Risospendere con 400 μL di tampone di lisi fCLIP completati con inibitore di proteasi di 0,2% (v/v) e del 2% (v/v) inibitore della RNAsi. Incubare in ghiaccio per 10 min e sottoporre ad ultrasuoni utilizzando un ultrasonicatore.
- Aggiungere 11 μL di 5 M di NaCl per regolare la concentrazione di NaCl a ~ 150 mM. Vortex brevemente e centrifugare a 21.130 x g a 4 ° C per 15 min. trasferire il surnatante in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL pre-refrigerati.
Nota: Conservare 40 μL del surnatante in una nuova provetta da centrifuga come l'esempio di input. Conservare il campione di ingresso a 4 ° C.
- Immunoprecipitazione
- Aggiungere 20 μL di perle di proteina A in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL.
- Lavare le perle con 400 μL di tampone di lisi di fCLIP. Centrifugare le perline a 1.000 x g a 4 ° C per 1 min. rimuovere il surnatante e aggiungere 400 μL di tampone di lisi fCLIP attentamente. Risospendere delicatamente le perline capovolgendo 3 ~ 4 volte.
- Ripetere il passaggio di lavare tre volte. Dopo il lavaggio finale, rimuovere il surnatante completamente.
- Risospendere le sfere in 300 μL di tampone di lisi di fCLIP. Aggiungere 8.3 μL di 5 M di NaCl per regolare la concentrazione di NaCl a ~ 150 mM. Aggiungere 10 μL di anticorpo PKR e incubare per 3 ore su un rotore a 4 ° C.
- Centrifugare le perline a 1.000 x g a 4 ° C per 1 min. rimuovere il surnatante e aggiungere 400 μL di tampone di lavaggio di fCLIP. Risospendere delicatamente le perline capovolgendo 3 ~ 4 volte.
- Ripetere il passaggio di lavaggio due volte. Dopo il lavaggio finale, rimuovere il surnatante completamente.
Nota: Non utilizzare mai un Vortex. Capovolgere la provetta delicatamente con le mani. - Aggiungere 300 μL di lisato e incubare per 3 ore a 4 ° C in un rotatore.
Nota: Tempo di incubazione più lungo può provocare aumento rilegatura. - Centrifugare le perline a 1.000 x g a 4 ° C per 1 min. rimuovere il surnatante e aggiungere 400 μL di tampone di lavaggio di fCLIP. Risospendere delicatamente le perline capovolgendo 3 ~ 4 volte.
- Ripetere il passaggio di lavare tre volte. Dopo il lavaggio finale, rimuovere il surnatante completamente.
- Aggiungere 300 μL di tampone di eluizione di fCLIP. Incubare in un thermomixer per 3 h a 25 ° C per eluire PKR dalle perle.
Nota: Preparare il fresco di tampone di eluizione fCLIP. - Centrifugare a 1.000 x g a temperatura ambiente e trasferire il surnatante in una provetta pulita siliconata.
Nota: Un tubo del microcentrifuge anche è ok, ma tubo siliconato è preferito per evitare l'evaporazione durante il passaggio di de-reticolazione (passaggio 2.3.12). - Aggiungere 300 μL di proteinasi K (20 mg/mL) e incubare per una notte a 65 ° C.
Nota: Utilizzare un thermomixer con coperchio riscaldato per evitare l'evaporazione.
- Estrazione del RNA
- Aggiungere 580 μL di acido-fenolo cloroformio e vortex per 30 s. Incubare a 37 ° C per 1 h.
- Vortexare per 30 s e centrifugare a 12.000 x g a temperatura ambiente per 10 min.
- Trasferire lo strato superiore in una microcentrifuga pulito 1,5 mL. Aggiungere 1/10 di volume di 3M NaOAc, 0,5 μL di coprecipitant (ad esempio, Glycoblue) e un uguale volume di isopropanolo. Incubare per una notte a-20 ° C.
- Precipitare pellet mediante centrifugazione a velocità massima a 4 ° C per 1 h.
Nota: Se non sono stati osservati il pellet di RNA/DNA, aggiungere un ulteriore 0,5 μL di coprecipitant e centrifugare per un ulteriore 1 h. continua questo passaggio fino a pellet di RNA/DNA sono osservati. - Rimuovere il supernatante e aggiungere 1 mL di alcool etilico al 75%. Centrifugare a 12.000 x g a 4 ° C per 5 min, ripetere la fase di lavaggio ancora una volta. Rimuovere il surnatante completamente ed asciugare il pellet a temperatura ambiente.
- Aggiungere 42 μL di TDW, 5 μL di dnasi buffer, 1 μL di RNAsi inibitore e 2 μL della dnasi I. Incubare a 37 ° C per 1 h.
- Aggiungere 150 μL di TDW e 200 μL di acido-fenolo cloroformio. Vortexare per 30 s. Centrifugare a 12.000 x g a temperatura ambiente per 10 min.
- Trasferire lo strato superiore in una microcentrifuga pulito 1,5 mL. Aggiungere 20 μL di 3 M NaOAc, 0,5 μL di coprecipitant e 1 mL di alcool etilico al 100%. Incubare per una notte a-80 ° C.
- Precipitare il pellet e lavare con alcool etilico al 75% come descritto nei passaggi 2.4.4 a 2.4.5.
- Risospendere in quantità adeguata di TDW.
3. sequenziamento libreria preparazione
- rimozione di rRNA
- Risospendere il pellet di RNA dal passaggio 2.4.10 con 28 μL di TDW.
Nota: La quantità massima di RNA totale dovrebbe essere meno di 5 μg. - Seguire le procedure previste dalla Guida di riferimento del kit rRNA rimozione rimuovere rRNA.
- Ripulire il rRNA impoverito RNAs aggiungendo 160 μL di biglie magnetiche.
- Mescolare pipettando ~ 15 volte e incubare a temperatura ambiente per 15 min.
- Fissare il tubo su una barra magnetica e rimuovere il surnatante.
- Aggiungere 300 μL di alcol etilico 80% mentre le perle sono ancora attaccate sulla barra magnetica ed incubare per 30 s.
- Sostituire l'alcool etilico con un fresco 300 μL di soluzione. Asciugare all'aria le perle sulla barra magnetica per 12 min a temperatura ambiente.
- Risospendere le sfere in 12 μL di TDW e mescolare pipettando 15 volte.
- Fissare le perline sulla barra magnetica e spostare il surnatante in una provetta pulita di PCR.
- Riducono i frammentato RNA ribosomiale (rRNA) seguendo le procedure fornite da rRNA svuotamento Kit.
- Ripulire il RNAs aggiungendo 110 µ l di biglie magnetiche e ripetuti passaggi 3.1.3.1 a 3.1.3.6.
- Risospendere il pellet di RNA dal passaggio 2.4.10 con 28 μL di TDW.
- Legatura di etichettatura e adattatore di RNA
- Il rRNA-vuotati RNAs, aggiungere 2 μL di tampone di x CIAP 10, 1 μL di inibitore di RNAsi e 2 μL di fosfatasi alcalina Antartico. Incubare a 37 ° C per 1 h e quindi a 65 ° C per 5 min inattivare la fosfatasi.
- Aggiungere 3 μL di tampone di x PNK 10, 1.5 μL di inibitore di RNasi, 1.5 μL di enzima T4 PNK, 0,8 μL di r-ATP e 1,7 μL di TDW. Incubare a 37 ° C per 50 min.
- Aggiungere 1,5 μL di 10 mM ATP e incubare a 37 ° C per altri 40 min.
- Fermare la reazione aggiungendo 170 μL di tampone di eluizione di RNA.
- Aggiungere 200 μL di acido-fenolo cloroformio e vortex per 30 s. Centrifugare a 12.000 x g a temperatura ambiente per 10 min.
- Trasferire lo strato superiore in una microcentrifuga pulito 1,5 mL. Aggiungere 20 μL di 3 M NaOAc, 0,5 μL di coprecipitant e 1 mL di alcool etilico al 100%. Incubare per una notte a-80 ° C.
- Precipitare il pellet di RNA e lavare con alcool etilico al 75% come descritto nei passaggi 2.4.4 a 2.4.5. Risospendere in 4,5 μL di TDW e aggiungere 9 μL di 2 x tintura di caricamento del RNA.
- Riscaldare il campione a 95 ° C per 5 min e carico su un gel di Urea-pagina 10%.
- Esegua il gel a 370 V per 40 min.
Nota: pre-Eseguire gel a 370 V per 90 min prima di caricare il campione. - Tagliare il gel alla regione del nucleotide ~ 100 – 500 e rompere il gel.
- Aggiungere 700 μL di 0,3 M di NaCl e incubare per una notte a 4 ° C in un rotatore.
- Trasferire la soluzione in una colonna e centrifugare a massima velocità a temperatura ambiente per 5 min.
- Trasferire l'eluato in una microcentrifuga pulito 1,5 mL. Aggiungere 1/10 di volume di 3M NaOAc, 0,5 μL di coprecipitant e un uguale volume di isopropanolo. Incubare per una notte a-20 ° C.
- 3' la legatura adattatore
- Precipitare il pellet di RNA e lavare con alcool etilico al 75% come descritto nei passaggi 2.4.4 a 2.4.5.
- Risospendere il pellet di RNA in 6,5 μL di TDW e aggiungere 1 μL di 10 3' adattatore di μM.
- Trasferire la soluzione in una provetta PCR e incubare a 70 ° C per 2 min.
- Aggiungere 1 μL di tampone di legatura 10 x 0,5 μL di inibitore di RNAsi e 1 μL di ligasi T4 RNA 2. Incubare a 28 ° C per 1 h, 25 ° C per 6 h e 22 ° C per 6 h.
- Aggiungere 12 μL di 2 x RNA loading dye e calore a 95 ° C per 5 min.
- Gel di purificare il 3' adattatore legato RNAs come descritto in 3.2.9 per 3.2.13.
- 5' la legatura adattatore
- Precipitare il pellet di RNA e lavare con alcool etilico al 75% come descritto nei passaggi 2.4.4 a 2.4.5.
- Risospendere il pellet di RNA in 4,2 μL di TDW e aggiungere 1 μL di adattatore 5' μM 5.
- Trasferire la soluzione in una provetta PCR e incubare a 70 ° C per 2 min.
- Aggiungere 0,8 μL di tampone di 10 x ligasi, 0,4 μL di inibitore di RNasi, 0,8 μL di 10 mM ATP, 0,8 μL della ligasi T4 RNA 1. Incubare a 28 ° C per 1 h, 25 ° C per 6 h e 22 ° C per 6 h.
- Trascrizione d'inversione e l'amplificazione di PCR
- Il 5' adattatore legati RNAs, aggiunga 1 μL di primer di trascrizione inversa 4 μM. Incubare a 70 ° C per 2 min e immediatamente raffreddare a 4 ° C.
- Aggiungere 4 μL di buffer di 5 x FS, 4 μL di 2,5 mM dNTP, 1 μL di DTT 0.1 M, 1 μL di inibitore di RNAsi e 1 μL della trascrittasi inversa. Incubare a 50 ° C per 1 h e 70 ° C per 15 min.
- Preparare l'amplificazione di PCR
- Mescolare 1 μL di prodotto di RT, 1 μL di primer RPI 25 μM, 1 μL di primer di RP1 25 μM, 10 μL di 5 x HF buffer, 4 μL di 2,5 mM dNTP, 32,5 μL di TDW e 0,5 μL della polimerasi ad alta fedeltà.
- Eseguire il programma PCR per 11 ~ 13 cicli.
Nota: Il programma per la PCR è: 98 ° C per 30 s per un avvio a caldo, 98 ° C per 10 s, 60 ° C per 30 s e 72 ° C per 45 s per l'amplificazione e 72 ° C per 5 min. Il passo di amplificazione viene ripetuto per 11-13 cicli.
- Ripulire i prodotti di PCR con 40 μL dei branelli magnetici e passaggi seguenti 3.1.3.1 a 3.1.3.6 ma utilizzando 10 μL di TDW per eluire il DNA.
- Aggiungere 2 μL di 10 della tintura di caricamento del DNA di x. Caricare il campione su un gel di acrilammide 6% ed eseguire a 200 V per 30 min.
- Macchia con Sybr gold (0,01% (v/v), 1 x TBE buffer) per 5 min a temperatura ambiente.
- De-macchia in 1 x TBE tampone per 5 min a temperatura ambiente.
- Tagliare il gel alla regione del nucleotide ~ 200 – 700 e rompere il gel.
- Aggiungere 700 μL di 0,3 M di NaCl e incubare per una notte a temperatura ambiente per eluire il DNA.
- Tutto il carico su una colonna e centrifugare a massima velocità a temperatura ambiente per 5 min.
- Trasferire l'eluato in una microcentrifuga pulito 1,5 mL. Aggiungere 1/10 di volume di 3M NaOAc, 0,5 μL di coprecipitant e un uguale volume di isopropanolo. Incubare per una notte a-20 ° C.
- Precipitare DNA pellet e lavare con alcool etilico al 75% come descritto nei passaggi 2.4.4 a 2.4.5. Risospendere in 20 μL di TDW.
- Analizzare il campione con un sequencer.
4. analisi di PKR-interacting RNA mediante qRT-PCR
- Metodo 1: Random hexamer trascrizione inversa
- Risospendere il pellet di RNA dal passaggio 2.4.10 con 8,5 μL di TDW e trasferire la soluzione in una provetta PCR.
- Aggiungere 0,5 μL di 100 μM random esameri e 4 μL di miscela del dNTP 2,5 mM.
- Calore la soluzione a 65 ° C per 5 min e immediatamente Incubare in ghiaccio per almeno 1 min.
- Fare la reazione della miscela: 4 μL di tampone di x SSIV 5, 1 μL di 100 mM DTT, 1 μL di RNAsi inibitore e 1 μL della trascrittasi inversa (200 U/μL). Aggiungere il mix di reazione per la soluzione di RNA.
- Incubare la miscela a 23 ° C per 10 min, 50 ° C per 10 min e 80 ° C per 10 min.
- Analisi del cDNA usando un sistema PCR in tempo reale.
Nota: Il programma per la PCR in tempo reale è: 95 ° C per 3 min per avviamento a caldo, 95 ° C per 5 s e 60 ° C per 10 s per amplificazione e 95 ° C per 30 s, 65 ° C per 30 s e 95 ° C per 30 s per fusione. Il passo di amplificazione viene ripetuto per 40 cicli.
- Metodo 2: Strand-specifiche trascrizione inversa
- Preparare un mix master di iniettori d'inversione: Mix uguali quantità di primer specifici d'inversione della trascrizione genica contenente la sequenza del promotore CMV seguita da ~ 20 nucleotidi di specifiche sequenze geniche.
Nota: La concentrazione combinata di tutti i primer specifici di RT gene è 4 μM. - Risospendere il pellet di RNA dal passaggio 2.4.10 con 8,5 μL di TDW e trasferire la soluzione in una provetta PCR.
- Aggiungere 0,5 μL di mix master di 4 μM di primers di trascrizione inversa e 4 μL di miscela del dNTP 2,5 mM.
- Calore la soluzione a 65 ° C per 5 min e immediatamente Incubare in ghiaccio per almeno 1 min.
- Preparare la soluzione di reazione con 4 μL di tampone di x SSIV 5, 1 μL di 100 mM DTT, 1 μL di RNAsi inibitore e 1 μL della trascrittasi inversa (200 U/μL). Aggiungere la soluzione di reazione per il mix di primer di RNA.
- Incubare la soluzione a 50 ° C per 10 min e 80 ° C per 10 min.
- Analisi del cDNA usando il sistema PCR in tempo reale.
Nota: Il programma per la PCR in tempo reale è uguale a quella descritta nel metodo 1.
- Preparare un mix master di iniettori d'inversione: Mix uguali quantità di primer specifici d'inversione della trascrizione genica contenente la sequenza del promotore CMV seguita da ~ 20 nucleotidi di specifiche sequenze geniche.
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Representative Results
Uno schema per il processo di arrestare le cellule HeLa nella fase S o M del ciclo cellulare è illustrato nella Figura 1. Per un esempio di fase-arrestato M, possiamo visualizzare chiaramente cellule rotonde a forma sotto il microscopio (Figura 2A). Per esaminare l'efficienza dell'arresto del ciclo cellulare, il contenuto nucleare della cellula possa essere analizzato usando FACS (Figura 2B). La figura 3 Mostra dati rappresentativi per la prova di efficienza di immunoprecipitazione, dove l'anticorpo D7F7 Mostra una capacità superiore a immunoprecipitate PKR. Questa differenza nell'efficienza immunoprecipitazione potrebbe essere stato riflesso nella discrepanza nella distribuzione classe delle librerie high throughput sequenziamento preparati utilizzando due anticorpi differenti PKR (Figura 4). La specificità dell'anticorpo D7F7 è ulteriormente confermata usando l'analisi occidentale della macchia tutta la PKR immunoprecipitate (Figura 5A) e la totale lysate delle cellule (figura 5B). Figura 6 Mostra il segnale del radioisotopo prima e dopo la rimozione del rRNA durante la preparazione della biblioteca di sequenziamento ad alte prestazioni. La figura 7 Mostra l'arricchimento di mtRNAs in RNA co-immunoprecipitate con PKR, ma non in RNA co-immunoprecipitate con coniglio IgG o DiGeorge regione cromosomica sindrome 8 (DGCR8). Figura 8 Mostra il filo rappresentanza specifiche analisi qRT-PCR di mtRNAs associato a PKR in S o M-fase arrestato campioni.
Figura 1: schema per i campioni di arresto del ciclo cellulare preparazione. (A, B) Schemi di preparazione di S (A) o M (B) fase-arrestato cellule HeLa. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: analisi del ciclo cellulare arrestato campioni. (A) fase immagini di contrasto dei campioni arrestato in fase S o M. Le barre indicano 250 μm. (B), FACS analisi mostrando il contenuto nucleare dei campioni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: prova di efficienza di immunoprecipitazione per gli anticorpi PKR. Per l'arricchimento di successo di RNA associati a PKR, deve essere utilizzato un anticorpo con un efficienza di immunoprecipitazione definitiva come l'anticorpo di D7F7. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: distribuzione di classe di RNA di librerie di sequenziamento preparati utilizzando anticorpi differenti PKR. Utilizzando anticorpi differenti PKR per fCLIP ha provocato una distribuzione diversa classe di sequenziamento mappata letture. La discrepanza è probabilmente dovuto le differenze dell'efficienza di immunoprecipitazione. Questa figura è stata modificata da Kim et al.28. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: specificità dell'anticorpo D7F7 PKR. (A, B) L'analisi occidentale della macchia tutto di PKR immunoprecipitated (A) o totale HeLa lisato (B) ha mostrato solamente una forte banda corrispondente alla dimensione di PKR, indicante che l'anticorpo D7F7 è altamente specifico nel riconoscere PKR. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: segnale del radioisotopo per PKR co-immunoprecipitate RNAs. (A) PKR co-immunoprecipitate RNAs potrebbe essere rilevata da etichettatura loro estremità 5' con r-ATP. (B) diminuzione del segnale di radioistope è stata osservata dopo la rimozione di successo del rRNA. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: convalida di PKR-mtRNA interazioni. 2 piega arricchimento di mtRNAs il login RNAs co-immunoprecipitate con anticorpi indicati. Il solo campione di RNA di co-immunoprecipitate PKR ha mostrato forte arricchimento di mtRNAs. Gli anticorpi IgG di coniglio e DGCR8 sono stati utilizzati come controlli negativi. Questa figura è stata modificata da Kim et al.28. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: analisi qRT-PCR specifico per Strand di PKR associato mtRNAs. (A, B) Trascrizione inversa Strand-specifico utilizzata per analizzare la strandedness di mtRNAs che erano co-immunoprecipitate con PKR per S (A) o cellule di fase-arrestato M (B). Questa figura è stata modificata da Kim et al.28. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il processo per preparare campioni di fase-arrestato S o M è illustrato nella Figura 1. Per arrestare le cellule in fase S, abbiamo usato un metodo di blocco doppio timidina dove abbiamo trattato le cellule con timidina due volte con un rilascio di 9 h in mezzo per garantire arresto ad alta efficienza (Figura 1A). Per arresto di fase M, abbiamo trattato le cellule una volta con timidina seguita da un rilascio di 9 h e poi applicato nocodazole alle cellule di blocco a prometafase (Figura 1B). Un passo fondamentale nella preparazione del campione di ciclo cellulare è il passo di rilascio dopo il primo blocco di timidina. Per rimuovere completamente la timidina, è fondamentale per lavare le cellule almeno due volte con PBS fresco. Un lavaggio scorretto e timidina residua può causare maggiore eterogeneità e attuabilità delle cellule in diminuzione. Il successo di arresto di fase di M può essere confermato visivamente base all'aumento del numero di cellule di forma circolare (Figura 2A). Tuttavia, il campione della fase M contiene ancora molte cellule di interfase, sulla base della loro morfologia. Per raccogliere solo la fase M arrestato cellule, abbiamo applicato la forza fisica per staccare le cellule di fase M dalla superficie. Il contenuto nucleare di cellule prelevate è stata ulteriormente esaminato mediante FACS, che ha mostrato un vasto picco tra 2n e 4n per la fase S e un picco acuto a 4n per il campione di fase-arrestato M (Figura 2B). Il protocollo presentato è ottimizzato per le cellule HeLa, che hanno un tempo di raddoppiamento di circa 24 h. L'idea del doppio blocco della timidina e della timidina-nocodazole può essere applicato ad altre linee cellulari, ma le durate di trattamento e rilascio di farmaco esatto necessario essere ottimizzato basato sul tempo di raddoppiamento delle cellule bersaglio.
Per identificare PKR-interacting RNA, abbiamo complessi reticolati PKR-RNA con formaldeide e li ha arricchiti attraverso immunoprecipitazione. Un fattore chiave che determina la precisione dell'analisi successiva è l'efficienza di immunoprecipitazione. Abbiamo testato numerosi anticorpi destinati a differenti epitopi della proteina PKR al fine di determinare l'anticorpo per la preparazione di biblioteca di sequenziamento ad alte prestazioni. Come mostrato nella Figura 3, abbiamo trovato che l'anticorpo di D7F7 che riconosce la regione linker tra i domini di legame di dsRNA e il dominio catalitico ha mostrato ottime capacità nel catturare PKR. L'altro anticorpo illustrato nella Figura 3 (Milli) riconosce la regione N-terminale, ma dimostra una scarsa capacità in immunoprecipitating PKR. Di conseguenza, la biblioteca di sequenziamento high throughput preparata usando l'anticorpo di Milli conteneva molte letture di sequenziamento di sfondo che sono dispersi in tutto il genoma, particolarmente in introni, senza accumulo di distinti alle regioni specifiche28 (Figura 4). Crediamo che le discrepanze nelle due librerie di sequenziamento sono per lo più a causa delle differenze nelle capacità degli anticorpi a catturare PKR durante il passaggio di immunoprecipitazione. Abbiamo esaminato ulteriormente la specificità dell'anticorpo D7F7 PKR attraverso le analisi occidentale della macchia tutta di immunoprecipitate (Figura 5A) e totale HeLa lisati (figura 5B). In entrambe le macchie, abbiamo osservato solo una banda forte che corrisponde al PKR. Questo indica che l'anticorpo D7F7 è altamente specifico e che i dati di sequenziamento ottenuti usando l'anticorpo D7F7 probabile riflettano veri interattori di RNA di PKR.
Un passaggio fondamentale durante la preparazione di biblioteca di sequenziamento ad alte prestazioni è la rimozione del rRNA. Dal momento che complessi RNA-RBP reticolato con formaldeide, abbiamo usato un ultrasonicatore per lisi completa delle cellule. Questo processo ha provocato la frammentazione del rRNA, che ha ridotto significativamente l'efficienza di rimozione di rRNA usando il rRNA Kit rimozione. Per risolvere questo problema, abbiamo usato prima il rRNA Kit rimozione seguita da rRNA svuotamento Kit (Vedi Tabella materiali), quali i rRNAs quasi completamente rimossi e meno dell'1% del sequenziamento totale legge sono stati associati a rRNA. Abbiamo usato questi due kit in sequenza perché il rRNA svuotamento Kit ha una capacità massima di soltanto 1 μg mentre il rRNA Kit rimozione ha una capacità massima di 5 μg. Abbiamo sperimentato che utilizzando più che la quantità raccomandata di RNA totale si traduce in notevole quantità di letture di sequenziamento mappato a rRNA. La rimozione di successo del rRNA può essere confermata dopo l'etichettatura il RNAs con r-ATP attraverso la reazione di PNK. Mentre il rRNA impoverito RNAs ha mostrato una fascia distinta intorno 150 nt, il campione prima rimozione di rRNA si presenta forte segnale in tutta la regione corrispondente al 50 ~ 300 nt (Figura 6).
Una limitazione di reticolazione di formaldeide è l'efficienza di immunoprecipitazione di diminuzione. Altre applicazioni di formaldeide reticolazione quali immunocitochimica in genere utilizzano soluzione paraformaldeide al 4% per la fissazione. Tuttavia, una tale condizione di fissaggio forte non può applicarsi per fCLIP esperimento perché diminuisce significativamente l'efficienza di immunoprecipitazione, che si traduce in una maggiore priorità bassa. Inoltre, complessi proteina-proteina di formaldeide fissazione reticolazioni oltre a complessi proteina-RNA. Pertanto, bisogna prestare attenzione nell'interpretare i dati di fCLIP.
Come riportato in precedenza, mtRNAs formare dsRNA intermolecolari che vengono riconosciuti da PKR28. In primo luogo abbiamo validato i nostri dati di sequenziamento esaminando PKR-mtRNA interazioni tramite qRT-PCR. Abbiamo usato il coniglio IgG e gli anticorpi DGCR8 come controllo negativo, che non ha mostrato alcun arricchimento di mtRNAs (Figura 7). Di nota, DGCR8 è stato usato come una proteina nucleare dsRNA che è fisicamente separata dalla mtRNAs. Allo stesso tempo, PKR co-immunoprecipitate RNAs ha mostrato forte arricchimento di mtRNAs (Figura 7).
Per analizzare ulteriormente le interazioni di PKR-mtRNA, abbiamo effettuato la trascrizione d'inversione strand specifici per distinguere il pesante-filo mtRNAs dalla mtRNAs di luce-strand (Figura 8). Abbiamo progettato la trascrizione inversa primer che hanno una sequenza del promotore CMV seguito da una sequenza di gene-specifico e quindi utilizzato una sequenza del promotore CMV come il primer sinistra e destra primer gene-specifico per l'analisi di qPCR. Abbiamo anche testato SP6 promotore e sequenze di primer di sequenziamento pGEX anziché la sequenza del promotore CMV. Abbiamo trovato che mentre pGEX e promotore CMV sequenze primer di sequenziamento ha mostrato buon risultato, utilizzando la sequenza del promotore SP6 non ha fatto. La differenza è a causa del basso contenuto di GC della sequenza del promotore SP6 (~ 33%) rispetto a quelli del promotore CMV (~ 67%) e il primer di sequenziamento pGEX (~ 65%) sequenze. Il regime proposto per trascrizione inversa strand-specifico può essere facilmente applicato ad altri RNAds intermolecolari, ma quando si progettano i primer di trascrizione inversa, il contenuto di GC deve essere presa in considerazione.
Nel complesso, abbiamo dimostrato la preparazione dei campioni di ciclo cellulare arrestato e l'arricchimento di PKR-interacting RNA attraverso la reticolazione di formaldeide e immunoprecipitazione. Utilizzando un anticorpo D7F7 altamente efficiente, abbiamo con successo isolato associato a PKR RNAs e identificato questi RNA generando e analizzando una biblioteca di sequenziamento ad alte prestazioni. Inoltre, per analizzare il strandedness di mtRNAs associato a PKR, abbiamo presentato un approccio di trascrizione inversa strand-specifici. Ci aspettiamo che il protocollo presentato può essere facilmente ottimizzato per studiare gli Interactiani di RNA di altri dsRBPs e strandedness di RNAds intermolecolari che si formano attraverso l'interazione complementare tra senso e trascritti antisenso.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dal programma di base scienza ricerca attraverso la National Research Foundation di Corea (NRF) finanziato dal governo coreano Ministero delle scienze e TIC (NRF-2016R1C1B2009886).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9260G | |
| 1 M Tris, pH 7.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9855G | |
| 1 M Tris, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9855G | |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-175-C | |
| 10% Nonidet-p40 (NP-40) | Biosolution | BN015 | |
| 10X DNA loading buffer | TaKaRa | 9157 | |
| 15 mL conical tube | SPL | 50015 | |
| 3' adaptor | 5'-rApp NN NNT GGA ATT CTC GGG TGC CAA GG/3ddC/-3' | ||
| 3 M Sodium Acetate pH 5.5 | Thermo Fisher Scientific | AM9740 | |
| 5' adaptor | 5'-GUU CAG AGU UCU ACA GUC CGA CGA UCN NNN-3' | ||
| 5 M NaCl | Thermo Fisher Scientific | AM9760G | |
| 50 mL conical tube | SPL | 50050 | |
| Acid-phenol chloroform, pH 4.5 | Thermo Fisher Scientific | AM9722 | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic beads DNA/RNA clean up |
| Antarctic alkaline phosphatase | New England Biolabs | M0289S | |
| Anti-DGCR8 | Made in house | ||
| Anti-PKR (D7F7) | Cell signaling technology | 12297S | |
| Anti-PKR (Milli) | Millipore EMD | 07-151 | |
| ATP (100 mM) | GE Healthcare | GE27-2056-01 | |
| Bromophenol blue sodium salt | Sigma-aldrich | B5525 | |
| Calf intestinal alkaline phosphatase | TaKaRa | 2250A | |
| Cell scraper 25 cm 2-position | Sarstedt | 83.183 | |
| CMV promoter sequence | 5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3' | ||
| Dulbecco's modified eagle medium | Welgene | LM001-05 | |
| dNTP mixture (2.5 mM) | TaKaRa | 4030 | |
| Ethanol, Absolute, ACS Grade | Alfa-Aesar | A9951 | |
| Fetal bovine serum | Merck | M-TMS-013-BKR | |
| Formamide | Merck | 104008 | |
| Glycine | Bio-basic | GB0235 | |
| GlycoBlue coprecipitant (15 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | AM9516 | |
| Isopropanol | Merck | 8.18766.1000 | |
| NEBNext rRNA Depletion Kit | New England Biolabs | E6318 | rRNA Depletion Kit |
| Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404 | |
| Normal rabbit IgG | Cell signaling technology | 2729S | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 6148 | |
| PCR forward primer (RP1) | 5'-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GCG ATC TAC ACG TTC AGA GTT CTA CAG TCC GA-3' | ||
| PCR index reverse primer (RPI) | 5'-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT NNN NNN GTG ACT GGA GTT CCT TGG CAC CCG AGA ATT CCA-3' | ||
| PCR tubes with flat cap, 0.2 mL | Axygen | PCR-02-C | |
| Phosphate bufered saline (PBS) Tablet | TaKaRa | T9181 | |
| Phusion high-fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530 | High-fidelity polymerase |
| PlateFuge microcentrifuge with swing-out rotor | Benchmark | c2000 | |
| Polynucleotide kinase (PNK) | TaKaRa | 2021A | |
| Proteinase K, recombinant, PCR Grade | Sigma-Aldrich | 3115879001 | |
| qPCR primer sequence: CO1 Heavy | Forward/Reverse: 5′-GCCATAACCCAATACCAAACG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO1 Light | Forward/Reverse: 5′-TTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO2 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO2 Light | Forward/Reverse: 5′-GTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO3 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO3 Light | Forward/Reverse: 5′-CTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CYTB Heavy | Forward/Reverse: 5′-CAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CYTB Light | Forward/Reverse: 5′-GGATAGTAATAGGGCAAGGACG -3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: GAPDH | Forward/Reverse: 5′-CAACGACCACTTTGTCAAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND1 Heavy | Forward/Reverse: 5′-TCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND1 Light | Forward/Reverse: 5′-GTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND4 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CTCACACTCATTCTCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND4 Light | Forward/Reverse: 5′-TGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND5 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CTAGGCCTTCTTACGAGCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND5 Light | Forward/Reverse: 5′-TAGGGAGAGCTGGGTTGTTT-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND6 Heavy | Forward/Reverse: 5′-TCATACTCTTTCACCCACAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND6 Light | Forward/Reverse: 5′-TGCTGTGGGTGAAAGAGTATG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| Random hexamer | Thermo Fisher Scientific | SO142 | |
| Recombinant Dnase I (Rnase-free) (5 U/μL) | TaKaRa | 2270A | |
| Recombinant Rnase inhibitor (40 U/μL) | TaKaRa | 2313A | |
| Ribo-Zero rRNA Removal Kit | Illumina | MRZH116 | rRNA Removal Kit |
| Rotator | FINEPCR, ROTATOR AG | D1.5-32 | |
| RT primer sequence: CO1 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′ | ||
| RT primer sequence: CO1 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGCCATAACCCAATACCAAACG-3′ | ||
| RT primer sequence: CO2 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′ | ||
| RT primer sequence: CO2 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′ | ||
| RT primer sequence: CO3 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′ | ||
| RT primer sequence: CO3 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′ | ||
| RT primer sequence: CYTB Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGATAGTAATAGGGCAAGGACG-3′ | ||
| RT primer sequence: CYTB Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′ | ||
| RT primer sequence: GAPDH | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGAGCGATGTGGCTCGGCT-3′ | ||
| RT primer sequence: ND1 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND1 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND4 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND4 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTCACACTCATTCTCAACCC-3′ | ||
| RT primer sequence: ND5 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTTGGGTTGAGGTGATGATG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND5 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCATTGTCGCATCCACCTTTA-3′ | ||
| RT primer sequence: ND6 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGTTGAGGTCTTGGTGAGTG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND6 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCCATAATCATACAAAGCCCC-3′ | ||
| Siliconized polypropylene 1.5 mL G-tube | Bio Plas | 4167SLS50 | |
| Sodium dedecyl sulfate | Biosesang | S1010 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| SUPERase In Rnase inhibitor | Thermo Fisher Scientific | AM2694 | |
| SuperScript III reverse transcriptase | Thermo Fisher Scientific | 18080093 | Reverse transcriptase for library preparation |
| SuperScript IV reverse transcriptase | Thermo Fisher Scientific | 18090010 | Reverse transcriptase for qRT-PCR |
| SYBR gold nucleic acid gl stain | Thermo Fisher Scientific | S11494 | |
| T4 polynucleotide kinase | New England Biolabs | M0201S | |
| T4 RNA ligase 1 (ssRNA Ligase) | New England Biolabs | M0204 | |
| T4 RNA ligase 2, truncated KQ | New England Biolabs | M0373 | |
| Thermomixer | Eppendorf ThermoMixer C with ThermoTop | ||
| Thymidine | Sigma-Aldrich | T9250 | |
| Tris-borate-EDTA buffer (TBE) | TaKara | T9122 | |
| Triton X-100 | Promega | H5142 | |
| Ultralink Protein A sepharose beads | Thermo Fisher Scientific | 22810 | Protein A beads |
| Ultrasonicator | Bioruptor | ||
| Urea | Bio-basic | UB0148 | |
| Vortex mixer | DAIHAN Scientific | VM-10 | |
| Xylene cyanol | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| γ-32P-ATP (10 μCi/μL, 3.3 μM) | PerkinElmer | BLU502A100UC |
References
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