Summary
我们提出了利用 hela 细胞研究哺乳动物细胞周期中双链 rna 结合蛋白激酶 rna 激活 (pkr) 的 rna 相互作用的实验方法。该方法利用甲醛对交联 rna-pkr 复合物和免疫沉淀进行富集 pkr 约束 rna。这些 rna 可以通过高通量测序或 qrt-pcr 进一步分析。
Abstract
蛋白激酶 rna 激活 (pkr) 是先天免疫反应蛋白的成员, 并能识别病毒 rna 的双链二级结构。当与病毒双链 rna (dsrna) 结合时, pkr 经历二聚化和随后的自磷酸化。磷酸化 pPKR (ppkr) 变得活跃, 并诱导真核起始因子 2 (eif2α) 的α亚基磷酸化, 以抑制全局平移。越来越多的证据表明, pkr 可以在生理条件下激活, 例如在细胞周期中或在各种压力条件下, 没有感染。然而, 由于缺乏捕获和分析 pkr 相互作用 dsrna 的标准化实验方法, 我们对 pkr rna 激活剂的理解有限。在这里, 我们提出了一个实验方案, 以专门丰富和分析 pkr 绑定 rna 在细胞周期中使用 hela 细胞。利用甲醛的有效交联活性固定 pkr-rna 复合物, 并通过免疫沉淀分离。然后可以进一步处理 pkr 联合免疫沉淀 rna, 以生成高通量测序库。pkr 相互作用的细胞 dsrna 的一个主要类别是线粒体 rna (mtrna), 它可以通过重链和光链 rna 之间的互补相互作用作为分子间 dsrna 存在。为了研究这些双工 mtrna 的散变性, 我们还提出了一种带特异性 qrt-pcr 的方案。我们的协议是针对 pkr 结合 rna 的分析而优化的, 但它可以很容易地进行修改, 以研究其他 dsrna 结合蛋白的细胞 dsrna 或 rna 相互体。
Introduction
蛋白激酶 rna 激活 (pkr), 也被称为真核起始因子2α激酶 2 (EIF2AK2), 是一种特征良好的蛋白激酶, 传输 rna 提供的信息。它属于真核翻译起始2亚基α (eif2α) 激酶家族和磷酸酯 eif2α在丝氨酸51响应感染,以抑制全球翻译1。在此背景下, pkr 被病毒双链 rna (dsrna) 激活, 为 pkr 二聚和自磷酸化2提供了一个平台。除了 eif2α, pkr 还可以磷酸化 p53, 胰岛素受体底物 1, 抑制剂 b, 和 c-jun n-端子激酶 (jnk) 调节活性的许多信号转导途径 3,4,5, 6。
pkr 最初被确定为一种在脊髓灰质炎病毒感染过程中磷酸化 eif2α的激酶, 通过识别脊髓灰质炎病毒的 dsrna 7,8。pkr 越来越多地被发现在免疫反应之外发挥着多方面的作用, 其异常激活或故障在许多人类疾病中都隐含着。在细胞凋亡过程中经常观察到活着的磷酸化 pPKR (ppkr), 是退行性疾病患者的共同特征, 尤其是亨廷顿病、帕金森症和阿尔茨海默病等神经退行性疾病9 10,11,12, 13.此外, pkr 在代谢应激和热休克等各种压力条件下被激活, 14、15、16、17。另一方面, pkr 的抑制导致细胞增殖甚至恶性转化的增加 18,19。pPKR 功能在正常大脑功能和细胞周期中也很重要, 因为在 m 期20、21、22 期间, ppkr 水平升高。在这种情况下, ppkr 抑制全局转换, 并为正确的细胞分裂20所需的关键有丝分裂信号系统提供提示。此外, 长时间激活 pkr 导致 g2m 相细胞周期停止在中国仓鼠卵巢 23.因此, pkr 磷酸化由负反馈回路调节, 以确保在 mg1 过渡期间快速失活21。
尽管 pkr 功能范围广泛, 但由于缺乏能够激活 pkr 的标准化高吞吐量实验方法来捕获和识别 dsrna, 我们对 pkr 激活的理解有限。先前的研究表明, pkr 可以与由两个倒置 alu 重复 (iralus)20、24形成的 dsrna 相互作用, 但存在额外的细胞 dsrna 的可能性, 这些细胞 dsrna 可以在细胞周期内或以下激活 pkr。人类细胞的应激条件尚未探索。识别 rna 结合蛋白 (rbp) rna 相互体的常规方法是利用紫外光将 rna-rbp 复合物交联 25、26、27。最近的一项研究将这种紫外交联方法应用于小鼠系统, 并确定小核子蛋白 rna 可以调节 pkr 激活在代谢应激16。利用甲醛的高交联效率, 提出了一种在 hela 细胞28细胞周期中识别 pkr 相互作用 rna 的替代方法。在其他 dsRBPs (如 staufen 和 drosha29、30、31) 的研究中也采用了类似的方法。我们发现 pkr 可以与各种类型的非编码 rna 相互作用, 如短插层核元件 (sine)、长穿插核元素 (line)、内源性逆转录病毒元素 (erv), 甚至α-卫星 rna。此外, 我们还表明 pkr 可以与线粒体 rna (mtrna) 相互作用, 线粒体 rna 通过重链和光链 rna28之间的互补相互作用形成分子间 dsrna。最近的一份出版物进一步支持了我们的数据, 即一些 mtrna 以双工形式存在, 并可以激活 dsrna 传感器, 如黑色素瘤差异相关的蛋白质 5, 以诱导干扰素32。更重要的是, mtrna 的表达和亚细胞定位在细胞周期和各种压力源中被调节, 这可能对它们调节 pkr 激活28的能力很重要。
在本文中, 我们提出了一个详细的协议, 最近开发的甲醛交联和免疫沉淀 (fCLIP) 方法来捕获和分析 pkr 相互作用的 rna 在细胞周期。我们演示了用胸苷和诺加唑制备细胞周期抑制样本的方法。然后, 我们提出了分离 pkr 绑定 rna 的 fclip 过程, 以及一种准备高吞吐量测序库以识别这些 rna 的方法。此外, 我们还描述了使用 qrt-pcr 分析 pkr 绑定 rna 的详细过程。具体而言, 我们提出了一个字符串特定的逆转录过程来分析 mtrna 的字符串。所述协议针对 hara 细胞和 pkr 进行了优化, 但可轻松修改细胞周期样本、fclip 和特异性 qrt-pcr 分析等关键步骤, 以研究细胞 dsrna 或识别其他 dsRNAs 的 rna 干扰体。
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Protocol
1. 溶液和细胞制备
- 解决方案准备
- 对于细胞培养培养基, 在杜尔贝科改良鹰培养基 (dmem) 的500毫升中加入50毫升的胎儿牛血清 (fbs), 制备平细胞培养培养基。
注: 抗生素可以添加到细胞培养基中, 但我们不使用抗生素。 - 对于0.1% 的甲醛, 在1x 磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 中溶解 4% (w/v), 在热板上加热并稀释, 通过添加 1x pbs 使30% 毫升的甲醛。
注意: 在烟罩中执行所有步骤, 并注意不要将甲醛溶液煮沸。保护0.1% 溶液不受光线的影响, 并存储在4°c。在一个月内使用该解决方案。
注: 最终 0.1% (v/v) 聚甲醛溶液的 ph 值应在7左右。 - 准备 fclip 裂解缓冲液:20 mm Tris-HCl (ph 7.5), 15 mm 氯化钠、10 mm edta、0.5% (v/v) 非偏数-p40 (np-40)、0.1% (v/v) triton x-100、0.1% (v/v) 十二烷基硫酸钠 (sds) 和 0.1% (w/v) 脱氧胆酸钠。将三重蒸馏水 (tdw) 加入40毫升。存放在4°c。
- 准备 fclip 洗涤缓冲液:20 mm Tris-HCl (ph 7.5)、150 mm 氯化钠、10 mm edta、0.1% (v/v) np-40、0.1% (v/v) triton x-100、0.1% (v2) sds 和 0.1% (w/v) 脱氧胆酸钠。加入 tdw 到40毫升。存放在4°c。
- 准备 4x pk 缓冲液: 400 mm Tris-HCl (ph 7.5)、200 mm 氯化钠、40 mm edta 和 4% (v/v) sds。加入 tdw 到40毫升。在室温下存放。
- 准备 fclip 洗脱缓冲液: 4 x pk 缓冲液20毫升, 尿素21克, tdw 8.5 毫升。准备新鲜的。
- 制备 rna 洗脱缓冲液: 0.3 m naoac 和 2% (w/v) sds。在室温下存放。
- 制备 2x rna 加载染料: 0.025 (w/v) 溴酚蓝, 0.025 (w/v) 二甲苯氰醇, 5 mm edta, 0.025 (w/v) sds, 95% (v/v) 甲酰胺。储存在-20°c。
- 准备 1x tbe 缓冲液: 0.089 mm Tris-Borate 和 0.002 m edta。准备500毫升的 tbe 缓冲器。
- 对于细胞培养培养基, 在杜尔贝科改良鹰培养基 (dmem) 的500毫升中加入50毫升的胎儿牛血清 (fbs), 制备平细胞培养培养基。
- s 或 m 相抑制细胞的制备
- 种子 ~ 750, 000 或 ~ 1, 000, 000, 000 平底细胞, 分别为 s 或 m 相抑制样本。在37°c 和 5% co2 下生长24小时细胞 。
- 用 2 mm 胸苷治疗细胞, 在37°c 孵育18小时。
- 用 pbs 清洗细胞两次。在37°c 下加入新鲜培养基并孵育9小时。
- 对于 s 相停止细胞, 用 2 mm 胸苷治疗细胞。对于 m 相抑制细胞, 用 100 ngml nocodazole 唑治疗细胞。在37°c 下孵化 15小时, 收获细胞。
注: 可以使用流式细胞仪检查细胞周期样本的均匀性。
2. 甲醛交联和免疫沉淀
- 细胞收获
- 对于 s 相样品, 用细胞刮刀收集细胞, 并转移到15毫升的锥形管中。对于 m 相样本, 点击细胞培养盘的一侧分离 m 相抑制细胞, 并将其转移到15毫升的锥形管中。
注: 为了增加 m 相抑制细胞的均匀性, 请不要使用细胞刮刀。 - 在室温下以 380 x克离心细胞 3分钟, 取出上清液, 用1毫升的冷 pbs 重新悬浮, 转移到 1.5 ml 的微离心管中。
- 在4°c 条件下, 以 10, 000 x g的温度离心细胞 30秒, 完全去除上清液。
- 对于 s 相样品, 用细胞刮刀收集细胞, 并转移到15毫升的锥形管中。对于 m 相样本, 点击细胞培养盘的一侧分离 m 相抑制细胞, 并将其转移到15毫升的锥形管中。
- 甲醛交联
- 在室温下加入 750μl 0.1% 的甲醛, 10分钟, 固定细胞。
- 加入250μl 的 1 m 甘氨酸, 在室温下额外孵育 10分钟, 以淬火反应。在4°c 条件下, 以 10, 000 x g的温度离心细胞 30秒, 完全去除上清液。
- 用1毫升的 pbs 重新暂停。在4°c 下以 10, 000 x g的温度离心细胞 30秒, 并去除上清液。
- 用400μl 的 fclip 裂解缓冲液重新悬浮, 辅以 0.2% (v/v) 蛋白酶抑制剂和 2% (v/v) rnase 抑制剂。在冰上加血 10分钟, 用超声波机进行声纳。
- 加入11μl 的5m 氯化钠, 将氯化钠浓度调整到 ~ 150 mm。旋涡短暂, 离心机在 21,130 x g在4°c 下 15分钟, 将上清液转移到预冷 1.5 ml 微离心管中。
注: 将40μl 上清液保留在新的离心管中作为输入样品。将输入样品存放在4°c。
- 免疫沉淀
- 在 1.5 ml 微离心管中加入20μl 的蛋白质 a 珠。
- 用400μl 的 fclip 裂解缓冲液清洗珠子。在4°c 条件下以 1, 000 x g离心珠子 1分钟, 取出上清液, 小心添加400μl 的 fclip 裂解缓冲液。通过倒置 3 ~ 4次轻轻重新悬浮珠子。
- 重复清洗步骤三次。最后清洗后, 完全取出上清液。
- 在300μl 的 fclip 裂解缓冲液中重新悬浮珠子。加入8.3μl 的 5 m 氯化钠, 将氯化钠浓度调整到 ~ 150 mm。加入10μl 的 pkr 抗体, 在4°c 的旋转器上孵育3小时。
- 在4°c 下以 1, 000 x g离心珠子 1分钟, 取出上清液, 加入400μl 的 fclip 洗涤缓冲液。通过倒置 3 ~ 4次轻轻重新悬浮珠子。
- 重复两次清洗步骤。最后清洗后, 完全取出上清液。
注: 切勿使用涡流混合器。用双手轻轻反转管子。 - 加入300μl 的裂解液, 在4°c 时在旋转器上孵育3小时。
注: 较长的孵育时间可能会导致背景结合增加。 - 在4°c 下以 1, 000 x g离心珠子 1分钟, 取出上清液, 加入400μl 的 fclip 洗涤缓冲液。通过倒置 3 ~ 4次轻轻重新悬浮珠子。
- 重复清洗步骤三次。最后清洗后, 完全取出上清液。
- 加入300μl 的 fclip 洗脱缓冲液。在25°c 的温度下在热敏器中培养 3小时, 从珠子中洗脱 pkr。
注: 准备新鲜的 fclip 洗脱缓冲液。 - 在室温下以 1, 000 x克离心, 并将上清液转移到干净的硅化管中。
注: 微离心管也是确定的, 但硅化管是首选, 以防止蒸发在交联步骤 (步骤 2.3.12)。 - 加入300μl 蛋白酶 k (20mg/ml), 在65°c 下孵育过夜。
注: 使用热敏管与加热盖, 以避免蒸发。
- rna 提取
- 加入580μl 的酸性-苯酚氯仿和涡旋, 在37°c 下进行1年的培养。
- 涡流为 30秒, 离心机在室温下为 12, 000 x g , 为10分钟。
- 将顶层转移到干净的 1.5 ml 微离心管中。加入 3 m naoac 的半容量, 0.5 微米的共沉淀剂 (如糖蓝), 以及等量的异丙醇。在-20°c 下过夜。
- 以最高速度在4°c 离心 1小时, 沉淀颗粒。
注: 如果没有观察到 rna\ dna 颗粒, 则再添加0.5μl 的共沉淀剂和离心机, 再增加 1小时, 继续这一步骤, 直至观察到 rna/dna 颗粒。 - 去除上清液, 加入75% 乙醇1毫升。在4°c 下以 12, 000 x g 离心5分钟. 再重复一次清洗步骤。完全取出上清液, 在室温下干燥颗粒。
- 加入42μl 的 tdw、5μl 的 dnase i 缓冲液、1μl 的 rnase 抑制剂和2μl 的 dnase i. 在37°c 下培养1小时。
- 加入150μl 的 tdw 和200μl 的酸性-苯酚氯仿。涡流为 30秒, 在室温下离心 10分钟.
- 将顶层转移到干净的 1.5 ml 微离心管中。加入20μl 的 3 m naoac, 0.5μl 的共沉淀剂, 和1毫升的100% 乙醇。在-80°c 下过夜。
- 沉淀颗粒和清洗与75% 乙醇如步骤所述 2.4.4 2.4.5。
- 以适当数量的 tdw 重新暂停。
3. 测序库准备
- rrna 去除
- 用28μl 的 tdw 从步骤2.4.10 重新悬浮 rna 颗粒。
注: 总 rna 的最大数量应小于5微克。 - 按照 rrna 去除试剂盒的参考指南提供的程序进行删除 rrna。
- 通过添加160μl 的磁珠来清理 rrna 耗尽的 rRNA。
- 通过移液量 ~ 15次混合, 在室温下孵育15分钟。
- 将管子连接在磁性棒上, 并取出上清液。
- 加入300μl 的80% 乙醇, 而珠子仍然附着在磁条上, 孵育30秒。
- 用新鲜的300μl 溶液取代乙醇。在室温下, 空气干燥磁棒上的珠子12分钟。
- 将珠子重新悬浮在12μl 的 tdw 中, 然后通过移液15次混合。
- 将磁珠连接在磁条上, 并将上清液移动到干净的 pcr 管上。
- 按照 rrna 消耗试剂盒提供的程序, 检测分散的核糖体 rna (rrna)。
- 通过添加110μl 磁珠和重复步骤 3.1.3.1 3.1.3.6 来清洁 rna。
- 用28μl 的 tdw 从步骤2.4.10 重新悬浮 rna 颗粒。
- rna 标记和适应剂结扎
- 在 rra-耗尽 rna 上, 加入2μl 的 10倍 ciap 缓冲液、1μl 的 rnase 抑制剂和2μl 的南极碱性磷酸酶。在37°c 下孵化 1小时, 然后在65°c 下孵化5分钟以激活磷酸酶。
- 加入3μl 的 10倍 pnk 缓冲液、1.5μl 的 rnase 抑制剂、1.5μl 的 t4 pnk 酶、0.8μl 的 r-atp 和1.7μl 的 tdw。在37°c 下孵化50分钟。
- 加入1.5 μl 的 10 mm atp, 在37°c 孵育, 再延长40分钟。
- 通过添加170μl 的 rna 洗脱缓冲液来停止反应。
- 加入200μl 的酸性苯酚氯仿和涡旋, 30s. 在室温下离心 10分钟, 离心时间为 12, 000 x 克。
- 将顶层转移到干净的 1.5 ml 微离心管中。加入20μl 的 3 m naoac, 0.5μl 的共沉淀剂, 和1毫升的100% 乙醇。在-80°c 下过夜。
- 沉淀 rna 颗粒, 并在 2.4.4 2.4.5 的步骤中所述, 用75% 的乙醇进行洗涤。在 tdw 的4.5μl 中重新悬浮, 并加入9μl 的 2x rna 加载染料。
- 在95°c 下加热样品 5分钟, 并在 10% urea-page 凝胶上加载。
- 在 370 v 处运行凝胶40分钟。
注: 在加载样品之前, 请将凝胶在 370 v 处预置90分钟。 - 在 ~ 100–500核苷酸区域切割凝胶并破坏凝胶。
- 加入 300μl 0.3 m 氯化钠, 在4°c 下旋转孵育过夜。
- 在室温下以最高速度将溶液转移到色谱柱和离心机上5分钟。
- 将洗脱液转移到干净的 1.5 ml 微离心管中。加入 3 m naoac 的半体积, 0.5μl 的共沉淀剂, 和等量的异丙醇。在-20°c 下过夜。
- 3 ' 适配器结扎
- 沉淀 rna 颗粒, 并在 2.4.4 2.4.5 的步骤中所述, 用75% 的乙醇进行洗涤。
- 在6.5μl 的 tdw 中重新悬浮 rna 颗粒, 并添加 1μl 10μm3 的适配器。
- 将溶液转移到 pcr 管, 在70°c 孵育2分钟。
- 加入1μl 的10倍结扎缓冲液, 0.5μl 的 rnase 抑制剂, 1μl 的 t4 rna 连接酶2。在28°c 下培养 1小时, 25°c 6小时, 22°c 6年。
- 加入12μl 的 2x rna 加载染料, 并在95°c 下加热5分钟。
- 凝胶净化 3 ' 适配器结扎的 rna, 如3.2.9 所述, 以3.2.13。
- 5 ' 适配器结扎
- 沉淀 rna 颗粒, 并在 2.4.4 2.4.5 的步骤中所述, 用75% 的乙醇进行洗涤。
- 在 tdw 的4.2μl 中重新悬浮 rna 颗粒, 并添加 1μl 5μm 5 的适配器。
- 将溶液转移到 pcr 管, 在70°c 孵育2分钟。
- 加入0.8μl 的10倍连接酶缓冲液, 0.4μl 的 rnase 抑制剂, 0.8μl 的 10 mm atp, 0.8μl 的 t4 rna 连接酶1。在28°c 下培养 1小时, 25°c 6小时, 22°c 6年。
- 逆转录酶和 pcr 扩增
- 在 5 ' 适配器连接 rna 上, 加入 1μl 4μm 逆转录引物。在70°c 下孵化 2分钟, 立即冷却至4°c。
- 加入4μl 的 5x fs 缓冲液、4μl 的 2.5 mm dntp、1μl 的 0.1 m dNTP、1μl 的 rnase 抑制剂和1μl 的逆转录酶。在50°c 下孵化 1小时, 70°c 孵化15分钟。
- 准备 pcr 扩增
- 混合 rt 产品的1μl、25μm rpi 底漆的1μl、25μm rp1 底漆的1μl、5xhf 缓冲液的10μl、2.5 mm dntp 的4μl、32.5μl 的 tdw 和0.5μl 的高保真聚合物酶。
- 运行 pcr 程序 11 ~ 13个周期。
注: pcr 程序为: 98°c 为 30秒, 98°c 为 10秒, 60°c 为 30秒, 72°c 为 45秒, 72°c 为5分钟。放大步骤重复11-13 周期。
- 使用40μl 的磁珠清洁 pcr 产品, 并按照以下步骤 3.1.3.1 3.1.3.6 但使用10μl 的 tdw 来清除 dna。
- 加入2μl 的 10倍 dna 加载染料。将样品装上6% 的丙烯酰胺凝胶, 以 200 v 的速度运行30分钟。
- 在室温下, 用 sybr 金染色 5分钟 (1x tbe 缓冲液中的 0.01% (v/v)。
- 在室温下在 1x tbe 缓冲液中脱层5分钟。
- 在 ~ 200–700核苷酸区域切割凝胶并破坏凝胶。
- 加入 300μl 0.3 m 氯化碳, 在室温下孵育一夜, 以洗脱 dna。
- 在室温下, 以最高速度将所有内容加载到立柱和离心机上, 时间为5分钟。
- 将洗脱液转移到干净的 1.5 ml 微离心管中。加入 3 m naoac 的半体积, 0.5μl 的共沉淀剂, 和等量的异丙醇。在-20°c 下过夜。
- 如 2.4.4 2.4.5 的步骤所述, 用75% 的乙醇沉淀 dna 颗粒并进行洗涤。在20μl 的 tdw 中重新悬浮。
- 使用排序器分析示例。
4. 利用 qrt-pcr 分析 pkr 相互作用的 rna
- 方法 1: 随机六边形逆转录酶
- 用8.5μl 的 tdw 从步骤2.4.10 重新悬浮 rna 颗粒, 并将溶液转移到 pcr 管中。
- 加入0.5μl 的100μm 随机高架, 加入4μl 的 2.5 mm dntp 混合。
- 在65°c 下加热溶液 5分钟, 并立即在冰上孵育至少1分钟。
- 反应混合: 5x ssiv 缓冲液的4μl、100 mm dtt 的1μl、rnase 抑制剂的1μl 和逆转录酶的 1μl (200uμ-l)。将反应混合物添加到 rna 溶液中。
- 将混合物在23°c 下培养 10分钟, 50°c 10分钟, 80°c, 10分钟。
- 使用实时 pcr 系统分析 cdna。
注: 实时 pcr 程序为: 95°c 为热启动 3分钟, 95°c 为 5秒, 60°c 为 10秒, 95°c 为 30秒, 65°c 为 30秒, 95°c 为熔体。放大步骤重复40个周期。
- 方法 2: 征方特异性逆转录酶
- 制备反向引物的主混合物: 混合含有 cmv 启动子序列的基因特异性逆转录引物的等量, 然后是基因特异性序列的 ~ 20个核苷酸。
注: 所有基因特异性 rt 引物的联合浓度为4μm。 - 用8.5μl 的 tdw 从步骤2.4.10 重新悬浮 rna 颗粒, 并将溶液转移到 pcr 管中。
- 加入0.5μl 的4μm 主混合逆转录酶引物和 4μl 2.5 mm dntp 混合。
- 在65°c 下加热溶液 5分钟, 并立即在冰上孵育至少1分钟。
- 通过混合4μl 的 5倍 ssiv 缓冲液、1μl 的 100 mm dtt、1μl 的 rnase 抑制剂和1μl 的逆转录酶 (200 ueμl) 来制备反应溶液。将反应溶液添加到 rna 底漆混合物中。
- 在50°c 下将溶液生也就是 10分钟, 在80°c 下孵化10分钟。
- 利用实时 pcr 系统对 cdna 进行分析。
注: 实时 pcr 程序与方法1中描述的程序相同。
- 制备反向引物的主混合物: 混合含有 cmv 启动子序列的基因特异性逆转录引物的等量, 然后是基因特异性序列的 ~ 20个核苷酸。
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Representative Results
图 1显示了在细胞周期的 s 或 m 阶段逮捕 hela 细胞的过程示意图。对于 m 相抑制样本, 我们可以在显微镜下清楚地显示圆形细胞 (图 2a)。为了检查细胞周期抑制的效率, 可以使用流式细胞仪分析细胞的核含量 (图 2b)。图 3显示了免疫沉淀效率测试的代表性数据, d7f7 抗体显示出优于免疫沉淀 pkr 的能力。免疫沉淀效率的这种差异可能反映在使用两种不同的 pkr 抗体制备的高通量测序库的类别分布的差异上 (图 4)。d7f7 抗体的特异性进一步证实了使用整个 blot 西方分析的 pkr 免疫沉淀 (图 5a) 和总细胞裂解物 (图 5A)。图 6显示了在高通量测序库准备过程中去除 rrna 前后的放射性同位素信号。图 7显示了 rna 中 mtrna 的富集与 pkr 共同沉淀, 但不在 rna 中的富集与兔 igg 或 diorge 综合征染色体区域 8 (dgcr8) 共同免疫沉淀。图 8显示了 s 或 m 相夹紧样本中 pkr 约束 mtrna 的代表性链特异性 qrt-pcr 分析。
图 1: 制备细胞周期抑制样本的示意图.(A、B)准备 s (a) 或 m (b) 相环被捕的 hela 细胞的原理图。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 细胞周期被抑制样本的分析.(a) s 或 m 相抑制样本的相位对比图像。条形图为250微米。(b) 显示样品核含量的流式细胞仪分析。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: pkr 抗体的免疫沉淀效率试验.为了成功地丰富 pkr 结合 rna, 应使用具有明确免疫沉淀效率的抗体, 如 d7f7 抗体。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 使用不同 pkr 抗体制备的测序库的 rna 类分布.使用不同的 pkr 抗体进行 fCLIP 导致了不同的映射测序读取类分布。这种差异可能是由于免疫沉淀效率的差异造成的。这一数字已从 kim 等人 28人的报告中修改。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5: d7f7 pkr 抗体的特异性。(A、B)对 pkr 免疫沉淀 (a) 或总热拉裂解液 (b) 的全 blot 西方分析显示, 只有一个与 pkr 大小相对应的强带, 表明 d7f7 抗体在识别 pkr 方面具有高度的特异性。请点击这里查看此图的较大版本.
图 6: pkr 共免疫沉淀 rna 的放射性同位素信号.(a) pkr 联合免疫沉淀 rna 可以通过标记其 5 ' 端标记为 r-atp 来检测。(b) 在成功去除 rrna 后, 观察到放射性信号减少。请点击这里查看此图的较大版本.
图 7: 验证 pkr-mrna 相互作用.记录 2倍富集 mtrna 在 rna 共同免疫沉淀与指示抗体。只有 pkr 联合免疫沉淀 rna 样本显示出强的 mtrna 富集。用家兔 igg 和 dgcr8 抗体作为阴性对照。这一数字已从 kim 等人 28人的报告中修改。请点击这里查看此图的较大版本.
图 8: pkr-trna 的应变特异性 qrt-pcr 分析.(A、B)利用应变特异性逆转录酶分析了 s (a) 或 m (b) 相抑制细胞与 pkr 共同免疫沉淀的 mtrna 的狭窄性。这一数字已从 kim 等人 28人的报告中修改。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
图 1显示了制备 s 或 m 相抑制样本的过程。为了在 s 期的细胞中, 我们使用了胸苷双块法, 我们用胸苷对细胞进行了两次处理, 中间释放了 9小时, 以确保较高的逮捕效率 (图 1 a)。对于 m 期停止, 我们用胸苷治疗细胞一次, 然后释放 9小时, 然后应用诺康唑在启动基中阻断细胞 (图 1b)。准备细胞周期样本的一个关键步骤是在第一个胸苷块之后的释放步骤。要完全去除胸苷, 用新鲜的 pbs 至少清洗细胞两次是至关重要的。不适当的洗涤和残留的胸苷会导致异质性的增加和细胞活力的降低。m 相停止的成功可以根据圆形细胞数量的增加在视觉上得到证实 (图 2 a)。然而, m 相样品仍然包含许多基于其形态的相间细胞。为了只收集 m 相被捕细胞, 我们施加了物理力, 将 m 相细胞从表面分离。利用流式细胞仪进一步检测了收获细胞的核含量, facs 显示 s 相的核含量在2n 至4n 之间, m 相抑制样本的核含量在4n 之间达到了尖锐的峰值 (图 2n)。所提出的协议针对 hela 细胞进行了优化, 其加倍时间约为24小时。双胸苷和胸苷-诺加唑阻滞的想法可应用于其他细胞系, 但需要根据目标细胞的加倍时间来优化确切的药物治疗和释放时间。
为了识别 pkr 相互作用的 rna, 我们将 pkr-rna 配合物与甲醛交联, 并通过免疫沉淀进行富集。决定后续分析准确性的一个关键因素是免疫沉淀的效率。我们测试了许多针对 pkr 蛋白不同表位的抗体, 以确定高通量测序库制备的抗体。如图 3所示, 我们发现, 识别 dsrna 结合域和催化域之间的链接器区域的 d7f7 抗体在捕获 pkr 方面表现出了优越的能力。图 3 (milli) 中显示的其他抗体识别 n 端区, 但在免疫沉淀 pkr 方面表现出较差的能力。因此, 使用 milli 抗体制备的高通量测序库包含许多分布在整个基因组中的背景测序读数, 特别是在内含子中, 在特定区域没有明显的累积 28(图 4)。我们认为, 这两个测序库中的差异主要是由于抗体在免疫沉淀步骤中捕获 pkr 的能力不同。通过对免疫沉淀 (图 5a) 和总 hela 裂解物 (图 5A) 的全模糊西方分析, 进一步考察了 d7f7 pkr 抗体的特异性。在这两个印迹中, 我们只观察到一个与 pkr 相对应的强带。这表明 d7f7 抗体具有高度的特异性, 使用 d7f7 抗体获得的测序数据可能反映了 pkr 的真实 rna 相互关系。
在高吞吐量测序库准备过程中的一个关键步骤是删除 rrna。由于我们将 rna-rbp 复合物与甲醛交联, 我们使用了超声对细胞进行完全裂解。这一过程导致了 rrna 的碎片化, 从而显著降低了使用 rrna 去除试剂盒去除 rrna 的效率。为了解决这个问题, 我们首先使用了 rrna 去除工具包, 然后是 rrna 消耗套件 (见材料表), 该工具几乎完全去除了 rrna, 不到1% 的测序读取被映射到 rrna。我们按顺序使用这两个试剂盒, 因为 rrna 消耗试剂盒的最大容量只有 1μg, 而 rrna 去除试剂盒的最大容量为5μg。我们已经经历过, 使用超过推荐量的总 rna 会产生大量的测序读数映射到 rrna。通过 pnk 反应用 r-atp 标记 rRNA 后, 可以成功地去除 rrna。当 rrna 耗尽 rRNA 显示一个明显的带在 150 nt, 样本在 rRNA 去除之前显示强信号在整个区域对应的 50 ~ 300 nt (图 6)。
甲醛交联的一个局限性是免疫沉淀效率的降低。甲醛交联的其他应用, 如免疫细胞化学, 通常使用4% 的甲醛溶液进行固定。然而, 这种强的固定条件不能应用于 fclip 实验, 因为它显著降低了免疫沉淀效率, 从而导致更高的背景。此外, 甲醛固定交叉蛋白质蛋白复合物, 以及蛋白质-rna 复合物。因此, 在解释 fclip 数据时需要谨慎。
正如前面所报道的, mtrna 形成了 pkr28所识别的分子间 dsrna。我们首先通过 qrt-pcr 检查 pkr-mtrna 相互作用来验证测序数据。我们使用兔子 igg 和 dgcr8 抗体作为阴性对照, 这没有显示任何丰富的 mtrna (图 7)。值得注意的是, dgcr8 被用作从 mtrna 物理分离的核 dsrna 结合蛋白。同时, pkr 联合免疫沉淀 rna 显示出强的 mtrna 富集 (图 7)。
为了进一步分析 pkr-mrna 相互作用, 我们进行了链特异性逆转录酶, 以区分重链 mtrna 和轻链 mtrna (图 8)。我们设计了具有 cmv 启动子序列的逆转录引物, 然后使用 cmv 启动子序列作为左引物和基因特异性右引物进行 qpcr 分析。我们还测试了 sp6 启动子和 pGEX 测序引物序列, 而不是 cmv 启动子序列。我们发现, 虽然 cmv 启动子和 pGEX 测序引物序列显示出良好的结果, 但使用 sp6 启动子序列没有。差异的原因是 sp6 启动子序列的 gc 含量较低 (~ 33%)与 cmv 启动子相比 (~ 67%)和 pGEX 测序引物 (~ 65%)序列。提出的特异性逆转录酶方案可以很容易地应用于其他分子间 dsrna, 但在设计逆转录引物时, 需要考虑 gc 含量。
总体而言, 我们通过甲醛交联和免疫沉淀法, 展示了细胞周期抑制样本的制备和 pkr 相互作用的 rna 的富集。利用高效的 d7f7 抗体, 我们成功地分离了 pkr 绑定 rna, 并通过生成和分析高吞吐量测序库来识别这些 rna。此外, 为了分析与 pkr 结合的 mtrna 的散强性, 我们提出了一种特带特异性逆转录酶方法。我们期望所提出的协议可以很容易地优化, 以研究其他 dsrpn 的 rna 相互作用和分子间 dsRBPs 的矛盾, 这些相互作用是通过感觉和反义转录之间的互补相互作用而形成的。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了韩国国家研究基金会通过韩国政府科学和信息通信技术部资助的韩国国家研究基金会 (nrf-2016r1c1b29886) 的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9260G | |
| 1 M Tris, pH 7.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9855G | |
| 1 M Tris, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9855G | |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-175-C | |
| 10% Nonidet-p40 (NP-40) | Biosolution | BN015 | |
| 10X DNA loading buffer | TaKaRa | 9157 | |
| 15 mL conical tube | SPL | 50015 | |
| 3' adaptor | 5'-rApp NN NNT GGA ATT CTC GGG TGC CAA GG/3ddC/-3' | ||
| 3 M Sodium Acetate pH 5.5 | Thermo Fisher Scientific | AM9740 | |
| 5' adaptor | 5'-GUU CAG AGU UCU ACA GUC CGA CGA UCN NNN-3' | ||
| 5 M NaCl | Thermo Fisher Scientific | AM9760G | |
| 50 mL conical tube | SPL | 50050 | |
| Acid-phenol chloroform, pH 4.5 | Thermo Fisher Scientific | AM9722 | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic beads DNA/RNA clean up |
| Antarctic alkaline phosphatase | New England Biolabs | M0289S | |
| Anti-DGCR8 | Made in house | ||
| Anti-PKR (D7F7) | Cell signaling technology | 12297S | |
| Anti-PKR (Milli) | Millipore EMD | 07-151 | |
| ATP (100 mM) | GE Healthcare | GE27-2056-01 | |
| Bromophenol blue sodium salt | Sigma-aldrich | B5525 | |
| Calf intestinal alkaline phosphatase | TaKaRa | 2250A | |
| Cell scraper 25 cm 2-position | Sarstedt | 83.183 | |
| CMV promoter sequence | 5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3' | ||
| Dulbecco's modified eagle medium | Welgene | LM001-05 | |
| dNTP mixture (2.5 mM) | TaKaRa | 4030 | |
| Ethanol, Absolute, ACS Grade | Alfa-Aesar | A9951 | |
| Fetal bovine serum | Merck | M-TMS-013-BKR | |
| Formamide | Merck | 104008 | |
| Glycine | Bio-basic | GB0235 | |
| GlycoBlue coprecipitant (15 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | AM9516 | |
| Isopropanol | Merck | 8.18766.1000 | |
| NEBNext rRNA Depletion Kit | New England Biolabs | E6318 | rRNA Depletion Kit |
| Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404 | |
| Normal rabbit IgG | Cell signaling technology | 2729S | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 6148 | |
| PCR forward primer (RP1) | 5'-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GCG ATC TAC ACG TTC AGA GTT CTA CAG TCC GA-3' | ||
| PCR index reverse primer (RPI) | 5'-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT NNN NNN GTG ACT GGA GTT CCT TGG CAC CCG AGA ATT CCA-3' | ||
| PCR tubes with flat cap, 0.2 mL | Axygen | PCR-02-C | |
| Phosphate bufered saline (PBS) Tablet | TaKaRa | T9181 | |
| Phusion high-fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530 | High-fidelity polymerase |
| PlateFuge microcentrifuge with swing-out rotor | Benchmark | c2000 | |
| Polynucleotide kinase (PNK) | TaKaRa | 2021A | |
| Proteinase K, recombinant, PCR Grade | Sigma-Aldrich | 3115879001 | |
| qPCR primer sequence: CO1 Heavy | Forward/Reverse: 5′-GCCATAACCCAATACCAAACG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO1 Light | Forward/Reverse: 5′-TTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO2 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO2 Light | Forward/Reverse: 5′-GTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO3 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO3 Light | Forward/Reverse: 5′-CTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CYTB Heavy | Forward/Reverse: 5′-CAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CYTB Light | Forward/Reverse: 5′-GGATAGTAATAGGGCAAGGACG -3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: GAPDH | Forward/Reverse: 5′-CAACGACCACTTTGTCAAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND1 Heavy | Forward/Reverse: 5′-TCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND1 Light | Forward/Reverse: 5′-GTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND4 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CTCACACTCATTCTCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND4 Light | Forward/Reverse: 5′-TGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND5 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CTAGGCCTTCTTACGAGCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND5 Light | Forward/Reverse: 5′-TAGGGAGAGCTGGGTTGTTT-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND6 Heavy | Forward/Reverse: 5′-TCATACTCTTTCACCCACAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND6 Light | Forward/Reverse: 5′-TGCTGTGGGTGAAAGAGTATG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| Random hexamer | Thermo Fisher Scientific | SO142 | |
| Recombinant Dnase I (Rnase-free) (5 U/μL) | TaKaRa | 2270A | |
| Recombinant Rnase inhibitor (40 U/μL) | TaKaRa | 2313A | |
| Ribo-Zero rRNA Removal Kit | Illumina | MRZH116 | rRNA Removal Kit |
| Rotator | FINEPCR, ROTATOR AG | D1.5-32 | |
| RT primer sequence: CO1 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′ | ||
| RT primer sequence: CO1 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGCCATAACCCAATACCAAACG-3′ | ||
| RT primer sequence: CO2 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′ | ||
| RT primer sequence: CO2 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′ | ||
| RT primer sequence: CO3 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′ | ||
| RT primer sequence: CO3 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′ | ||
| RT primer sequence: CYTB Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGATAGTAATAGGGCAAGGACG-3′ | ||
| RT primer sequence: CYTB Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′ | ||
| RT primer sequence: GAPDH | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGAGCGATGTGGCTCGGCT-3′ | ||
| RT primer sequence: ND1 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND1 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND4 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND4 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTCACACTCATTCTCAACCC-3′ | ||
| RT primer sequence: ND5 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTTGGGTTGAGGTGATGATG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND5 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCATTGTCGCATCCACCTTTA-3′ | ||
| RT primer sequence: ND6 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGTTGAGGTCTTGGTGAGTG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND6 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCCATAATCATACAAAGCCCC-3′ | ||
| Siliconized polypropylene 1.5 mL G-tube | Bio Plas | 4167SLS50 | |
| Sodium dedecyl sulfate | Biosesang | S1010 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| SUPERase In Rnase inhibitor | Thermo Fisher Scientific | AM2694 | |
| SuperScript III reverse transcriptase | Thermo Fisher Scientific | 18080093 | Reverse transcriptase for library preparation |
| SuperScript IV reverse transcriptase | Thermo Fisher Scientific | 18090010 | Reverse transcriptase for qRT-PCR |
| SYBR gold nucleic acid gl stain | Thermo Fisher Scientific | S11494 | |
| T4 polynucleotide kinase | New England Biolabs | M0201S | |
| T4 RNA ligase 1 (ssRNA Ligase) | New England Biolabs | M0204 | |
| T4 RNA ligase 2, truncated KQ | New England Biolabs | M0373 | |
| Thermomixer | Eppendorf ThermoMixer C with ThermoTop | ||
| Thymidine | Sigma-Aldrich | T9250 | |
| Tris-borate-EDTA buffer (TBE) | TaKara | T9122 | |
| Triton X-100 | Promega | H5142 | |
| Ultralink Protein A sepharose beads | Thermo Fisher Scientific | 22810 | Protein A beads |
| Ultrasonicator | Bioruptor | ||
| Urea | Bio-basic | UB0148 | |
| Vortex mixer | DAIHAN Scientific | VM-10 | |
| Xylene cyanol | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| γ-32P-ATP (10 μCi/μL, 3.3 μM) | PerkinElmer | BLU502A100UC |
References
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