Summary
نقدم النهج التجريبي لدراسة الحمض النووي الريبي-التمثيلات من مزدوجة-الذين تقطعت بهم السبل الحمض النووي الريبي ملزمة البروتين كيناز تنشيط الحمض النووي الريبي (PKR) أثناء دورة الخلية الثديية باستخدام خلايا هيلا. ويستخدم هذا الأسلوب فورمالدهايد مجمعات التشعب الجيش الملكي النيبالي-روبية باكستانية وإيمونوبريسيبيتيشن لإثراء الكشف روبية باكستانية زمنياً. يمكن تحليل هذه الكشف كذلك من خلال التسلسل الفائق أو قرة-بكر.
Abstract
كيناز البروتين المنشط الحمض النووي الريبي (PKR) هو عضو من البروتينات الاستجابة المناعية الفطرية ويعترف هيكل الفيروسية الكشف الثانوي مزدوجة-الذين تقطعت بهم السبل. عندما تلتزم بالكشف مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل الفيروسية (دسرناس)، يخضع روبية باكستانية ثنائي وأوتوفوسفوريلاتيون لاحقاً. فوسفوريلاتيد روبية باكستانية (بكر) تصبح نشطة، ويستحث الفسفرة فرعية ألفا عامل بدء حقيقية النواة 2 (eIF2α) لقمع الترجمة العالمية. أدلة متزايدة تشير إلى أن يمكن تنشيط روبية باكستانية تحت الظروف الفسيولوجية مثل أثناء دورة الخلية أو تحت ظروف الإجهاد المختلفة دون الإصابة. فهمنا لتفعيل الجيش الملكي النيبالي من روبية باكستانية غير محدودة بسبب عدم وجود أسلوب موحد التجريبية التقاط وتحليل التفاعل روبية باكستانية دسرناس. هنا، فإننا نقدم تجريبية البروتوكول تحديداً إثراء وتحليل روبية باكستانية ملزمة الكشف أثناء دورة الخلية باستخدام خلايا هيلا. فنحن نستخدم نشاط crosslinking كفاءة فورمالدهايد إصلاح المجمعات روبية باكستانية-الجيش الملكي النيبالي، وعزلها عن طريق إيمونوبريسيبيتيشن. يمكن ثم معالجة PKR co-إيمونوبريسيبيتاتيد الكشف كذلك إنشاء مكتبة تسلسل الفائق. فئة رئيسية واحدة من التفاعل روبية باكستانية دسرناس الخلوية هو الكشف الميتوكوندريا (مترناس)، التي يمكن أن توجد دسرناس الجزيئات من خلال التفاعل التكميلية بين الثقيلة-حبلا والكشف حبلا الضوء. لدراسة سترانديدنيس لهذه مترناس المزدوجة، نقدم أيضا بروتوكولا لمحددة حبلا qRT-PCR. أن البروتوكول هو الأمثل للتحليل للكشف روبية باكستانية زمنياً، ولكن يمكن تعديلها بسهولة لدراسة دسرناس الخلوية أو التمثيلات الحمض النووي الريبي للبروتينات ملزمة دسرنا الأخرى.
Introduction
كيناز البروتين المنشط الحمض النووي الريبي (PKR)، بدء التوكسينات تعرف أيضا باسم عامل 2-ألفا كيناز 2 (EIF2AK2)، هو كيناز بروتين تتسم جيدا أن ينقل المعلومات المقدمة من الكشف. وهو ينتمي إلى ترجمة حقيقية النواة بدء 2 ألفا فرعية (eIF2α) الأسرة كيناز وفوسفوريلاتيس eIF2α في سيرين 51 استجابة للعدوى لقمع الترجمة العالمي1. وفي هذا السياق، يتم تفعيل الكشف مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل الفيروسية (دسرناس)، التي توفر منبرا لروبية باكستانية ثنائي وأوتوفوسفوريليشن2روبية باكستانية. بالإضافة إلى eIF2α، يمكن أيضا أن فوسفوريلاتي روبية باكستانية كيناز ج-ن يونيو--المحطة الطرفية (جنك) بتنظيم أنشطة عديدة إشارة توصيل مسارات3،،من45، و κB المانع، p53 والركيزة مستقبلات الأنسولين 1 6.
واعتبرت روبية باكستانية الأصل كيناز التي فوسفوريلاتيد eIF2α أثناء الإصابة بفيروس شلل الأطفال بالاعتراف بفيروس شلل الأطفال دسرناس7،8. متزايدة وجدت روبية باكستانية لتلعب أدواراً متعددة الأوجه تتجاوز الاستجابة المناعية، وضمنا التنشيط الشاذة أو عطل في العديد من الأمراض البشرية. تنشيط فوسفوريلاتيد روبية باكستانية (بكر) وكثيراً ما لوحظ خلال المبرمج وهو سمة مشتركة للمرضى الذين يعانون من الأمراض التنكسية، لا سيما أمراض الأعصاب مثل هنتنغتون، باركنسون في، ومرض الزهايمر9 ،،من1011،،من1213. وبالإضافة إلى ذلك، يتم تنشيط روبية باكستانية تحت ظروف الإجهاد المختلفة مثل الإجهاد الأيضية والحرارة صدمة14،15،،من1617. من ناحية أخرى، يؤدي تثبيط روبية باكستانية في الخلية زيادة الانتشار والتحول الخبيث حتى18،19. مهم أيضا في وظيفة المخ المعتادة الدالة روبية باكستانية وأثناء دورة الخلية كمستوى بكر هو مرتفعة خلال المرحلة م20،،من2122. وفي هذا السياق، بكر يمنع الترجمة العالمية ويوفر إشارات إلى نظم الإشارات الانقسامية الرئيسية اللازمة لانقسام الخلايا السليمة20. وعلاوة على ذلك، أدى التنشيط المطول من روبية باكستانية المرحلة G2/M زنزانات الاعتقال دورة الخلية في مبيض الهمستر الصيني23. ونتيجة لذلك، ينظم حلقة ردود الفعل السلبية لضمان التعطيل السريع خلال مرحلة انتقالية M/G121الفسفرة روبية باكستانية.
على الرغم من وظيفة طائفة واسعة من روبية باكستانية، فهمنا للتنشيط روبية باكستانية محدودة بسبب عدم وجود نهج موحد تجريبي الفائق لالتقاط وتحديد دسرناس التي يمكن تنشيط روبية باكستانية. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن بكر يمكن أن تتفاعل مع دسرناس التي شكلتها المقلوب الو يكرر (إيرالوس)،من2024، ولكن إمكانية وجود دسرناس الخلوية الإضافية التي يمكن تنشيط روبية باكستانية خلال دورة الخلية أو تحت وكانت ظروف الإجهاد في الخلايا البشرية لم تكتشف بعد. ويستخدم النهج التقليدية في تحديد الحمض النووي الريبي-التمثيلات بروتين الحمض النووي الريبي (الممارسات التجارية التقييدية) الأشعة فوق البنفسجية إلى التشعب الجيش الملكي النيبالي-الممارسات التجارية التقييدية مجمعات25،،من2627. دراسة أجريت مؤخرا تطبيق هذا النهج crosslinking الأشعة فوق البنفسجية في نظام ماوس وحدد أن الكشف النوية الصغيرة يمكن أن تنظم التنشيط روبية أثناء الإجهاد الأيضي16. عن طريق استخدام كفاءة عالية crosslinking فورمالدهايد، قدمنا طريقة بديلة لتحديد الكشف التفاعل روبية باكستانية خلال دورة الخلية في خلايا هيلا28. طبق نهج مماثل لدراسة أخرى دسرببس مثل شتاوفن ودروشا29،،من3031. ووجدنا أن بكر يمكن أن تتفاعل مع أنواع مختلفة من الكشف فضله مثل قصيرة العنصر النووي اينتيرسبيرسيد (شرط)، طويلة ويتخلل العنصر النووي (الخط)، وعنصر لفي الذاتية (ايرف)، والكشف حتى ألفا-الأقمار الصناعية. وباﻹضافة إلى ذلك، أظهرنا أن بكر يمكن أن تتفاعل مع الكشف الميتوكوندريا (مترناس)، الذي شكل دسرناس الجزيئات من خلال التفاعل التكميلية بين الثقيلة-حبلا وعلى ضوء حبلا الكشف28. كذلك أيد منشور صدر مؤخرا البيانات المتوفرة لدينا أن بعض مترناس موجودة في نموذج الطباعة على الوجهين ويمكن تنشيط أجهزة الاستشعار دسرنا مثل سرطان الجلد المرتبط بالتمايز البروتين 5 لحمل تداخلين32. الأهم من ذلك، التعبير والترجمة سوبسيلولار من مترناس يتم التضمين أثناء دورة الخلية، وعوامل الإجهاد المختلفة، التي قد تكون هامة في قدرتها على تنظيم روبية باكستانية التنشيط28.
في هذه المقالة، نقدم بروتوكول مفصل crosslinking فورمالدهايد المطورة حديثا وإيمونوبريسيبيتيشن (فكليب) طريقة التقاط وتحليل التفاعل روبية باكستانية الكشف أثناء دورة الخلية. علينا أن نظهر الأسلوب لإعداد دورة الخلية اعتقال العينات باستخدام thymidine ونوكودازولي. ثم نقدم عملية فكليب لعزل الكشف روبية باكستانية زمنياً وطريقة إعداد مكتبة التسلسل الفائق لتحديد هذه الكشف. وعلاوة على ذلك، نحن تحدد الإجراءات التفصيلية لتحليل الكشف روبية باكستانية زمنياً باستخدام PCR قرة. على وجه التحديد، فإننا نعرض إجراء نسخ عكسي حبلا محددة لتحليل سترانديدنيس مترناس. وصف البروتوكول هو الأمثل لخلايا هيلا وروبية باكستانية، ولكن يمكن تعديل الخطوات الرئيسية مثل إعداد نموذج دورة الخلية، فكليب، وتحليل محددة حبلا qRT-PCR بسهولة لدراسة دسرناس الخلوية أو لتحديد التمثيلات الحمض النووي الريبي لأخرى دسرببس.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-حل وخلية إعداد
- إعداد الحل
- لخلية الثقافة المتوسطة، إعداد المتوسطة لثقافة الخلية هيلا بإضافة 50 مل مصل البقري الجنين (FBS) إلى 500 مل من المتوسطة (دميم "تعديل النسر" دولبيكو).
ملاحظة: يمكن إضافة المضادات الحيوية إلى مستنبت الخلية، ولكن نحن لا نستخدم المضادات الحيوية. - بارافورمالدهيد 0.1%، يحل بارافورمالدهيد 4% (w/v) في 1 × فوسفاتيبوفيريد المالحة (PBS) مع تدفئة على طبق ساخن وتمييع جعل 30 مل بارافورمالدهيد 0.1% (v/v) عن طريق إضافة 1 x PBS.
تنبيه: تنفيذ كافة الخطوات في غطاء دخان، ويجب الحرص على عدم غلى الحل بارافورمالدهيد. حماية الحل 0.1% من الضوء وتخزينها في 4 درجات مئوية. استخدام الحل في غضون شهر واحد.
ملاحظة: يجب أن يكون الرقم الهيدروجيني للحل النهائي بارافورمالدهيد 0.1% (v/v) حوالي 7. - إعداد المخزن المؤقت لتحلل فكليب: 20 مم تريس-HCl (درجة الحموضة 7.5)، 15 ملم كلوريد الصوديوم، 10 مم يدتا، 0.5% (v/v) نونيديت-p40 (NP-40)، 0.1% (v/v) X-100 تريتون، 0.1% (v/v) الصوديوم دوديسيل كبريتات (SDS)، وديوكسيتشولاتي الصوديوم 0.1% (w/v). إضافة الماء المقطر الثلاثي (إصلاح) إلى 40 مل. مخزن في 4 درجات مئوية.
- إعداد المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي فكليب: 20 مم تريس-HCl (درجة الحموضة 7.5)، 150 مم 0.1% (v/v) NP-40 كلوريد الصوديوم، يدتا 10 ملم، و 0.1% (v/v) X-100 تريتون، 0.1% (v/v) الحزب الديمقراطي الصربي و 0.1% (w/v) ديوكسيتشولاتي الصوديوم. إضافة إصلاح إلى 40 مل. مخزن في 4 درجات مئوية.
- إعداد 4 × PK المخزن المؤقت: 400 مم تريس-HCl (درجة الحموضة 7.5)، 200 ملم كلوريد الصوديوم، يدتا 40 مم، والحزب الديمقراطي الصربي 4% (v/v). إضافة إصلاح إلى 40 مل. تخزين في درجة حرارة الغرفة.
- إعداد المخزن المؤقت شطف فكليب: 20 مل 4 × PK المخزن المؤقت، 21 غم من اليوريا، ومل 8.5 من إصلاح. إعداد جديدة.
- إعداد المخزن المؤقت شطف الحمض النووي الريبي: 0.3 متر نواك، والحزب الديمقراطي الصربي 2% (w/v). تخزين في درجة حرارة الغرفة.
- إعداد 2 × الجيش الملكي النيبالي تحميل صبغ: 0.025% (w/v) بروموفينول الأزرق، زايلين زيلين نفط 0.025% (w/v)، يدتا 5 مم، 0.05% (w/v) الحزب الديمقراطي الصربي، وميثلامين 95% (v/v). مخزن في-20 درجة مئوية.
- إعداد المخزن المؤقت x TBE 1: 0.089 يدتا م تريس-بورات و 0.002 M. إعداد 500 مل TBE العازلة.
- لخلية الثقافة المتوسطة، إعداد المتوسطة لثقافة الخلية هيلا بإضافة 50 مل مصل البقري الجنين (FBS) إلى 500 مل من المتوسطة (دميم "تعديل النسر" دولبيكو).
- إعداد الخلايا القبض على المرحلة S أو M
- ~ 750,000 البذور أو ~ 1,000,000 هيلا الخلايا لعينات القبض على المرحلة S أو M، على التوالي. تنمو الخلايا في 37 درجة مئوية و 5% CO2 ل 24 ساعة.
- علاج الخلايا مع thymidine 2 مم واحتضانها ح 18 عند 37 درجة مئوية.
- تغسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني. إضافة وسائط جديدة واحتضانها ح 9 عند 37 درجة مئوية.
- للخلايا القبض على المرحلة S، يعامل الخلايا مع thymidine 2 مم. للخلايا م القبض على المرحلة، يعامل الخلايا مع 100 نانوغرام/مل نوكودازولي. احتضانها ح 15 في الخلايا 37 درجة مئوية والحصاد.
ملاحظة: يمكن فحص تجانس العينات دورة الخلية باستخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية.
2-فورمالدهايد العابرة للربط وإيمونوبريسيبيتيشن
- الحصاد الخلية
- لنموذج مرحلة S، جمع الخلايا مكشطة الخلية ونقل إلى أنبوب مخروطي 15 مل. لنموذج مرحلة M، اضغط على جانب الطبق ثقافة الخلية فصل الخلايا م القبض على المرحلة وتحويلها إلى أنبوب مخروطي 15 مل.
ملاحظة: لزيادة تجانس الخلايا مرحلة القبض م، لا تستخدم مكشطة خلية. - الطرد المركزي الخلايا في 380 x ز في درجة حرارة الغرفة للحد الأدنى 3 إزالة المادة طافية وإعادة تعليق مع 1 مل من برنامج تلفزيوني ونقل إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل الباردة.
- الطرد المركزي الخلايا في س 10,000 ز عند 4 درجة مئوية لإزالة س. 30 المادة طافية تماما.
- لنموذج مرحلة S، جمع الخلايا مكشطة الخلية ونقل إلى أنبوب مخروطي 15 مل. لنموذج مرحلة M، اضغط على جانب الطبق ثقافة الخلية فصل الخلايا م القبض على المرحلة وتحويلها إلى أنبوب مخروطي 15 مل.
- كروسلينكينج فورمالدهايد
- إضافة 750 ميكروليتر من بارافورمالدهيد 0.1% لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة إصلاح الخلايا.
- إضافة 250 ميكروليتر من جليكاين م 1 واحتضان مين 10 إضافية في درجة حرارة الغرفة إخماد رد فعل. الطرد المركزي الخلايا في س 10,000 ز عند 4 درجة مئوية لإزالة س. 30 المادة طافية تماما.
- إعادة تعليق مع 1 مل من برنامج تلفزيوني. الطرد المركزي الخلايا 10 آلاف س ز في 4 درجات مئوية عن 30 ثانية وإزالة المادة طافية.
- إعادة تعليق مع 400 ميكروليتر من المخزن المؤقت لتفسخ فكليب يكمل مع مثبط البروتياز 0.2% (v/v) و 2% (v/v) المانع رناسي. احتضان على الجليد لمدة 10 دقائق، و sonicate باستخدام أولتراسونيكاتور.
- إضافة ميكروليتر 11 من كلوريد الصوديوم م 5 لضبط تركيز كلوريد الصوديوم ~ 150 مم. ودوامه بإيجاز وأجهزة الطرد المركزي في س 21,130 ز في 4 درجات مئوية عن 15 دقيقة نقل المادة طافية إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي مبردة مسبقاً 1.5 مل.
ملاحظة: يحتفظ 40 ميكروليتر من المادة طافية في أنبوب الطرد مركزي جديدة كنموذج الإدخال. تخزين العينة الإدخال عند 4 درجة مئوية.
- إيمونوبريسيبيتيشن
- إضافة 20 ميكروليتر من البروتين بالخرز في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل.
- أغسل حبات مع 400 ميكروليتر من المخزن المؤقت لتحلل فكليب. الطرد المركزي الخرز في س 1,000 ز عند 4 درجة مئوية للحد الأدنى 1 إزالة المادة طافية وإضافة 400 ميكروليتر من المخزن المؤقت لتحلل فكليب بعناية. بلطف إعادة تعليق الخرز بعكس 3 ~ 4 مرات.
- كرر الخطوة يغسل ثلاث مرات. بعد الغسيل النهائي، إزالة المادة طافية تماما.
- إعادة تعليق الخرز في 300 ميكروليتر من المخزن المؤقت لتحلل فكليب. إضافة ميكروليتر 8.3 من كلوريد الصوديوم م 5 لضبط تركيز كلوريد الصوديوم ~ 150 مم. إضافة 10 ميكروليتر من جسم روبية باكستانية واحتضانها ح 3 في دوار عند 4 درجة مئوية.
- الطرد المركزي الخرز في س 1,000 ز عند 4 درجة مئوية للحد الأدنى 1 إزالة المادة طافية وإضافة 400 ميكروليتر من المخزن المؤقت للغسيل فكليب. بلطف إعادة تعليق الخرز بعكس 3 ~ 4 مرات.
- كرر الخطوة يغسل مرتين. بعد الغسيل النهائي، إزالة المادة طافية تماما.
ملاحظة: ابدأ استخدام خلاط دوامة. عكس الأنبوب بلطف بيديه. - إضافة 300 ميكروليتر من ليستي واحتضانها ح 3 في 4 درجات مئوية في دوار.
ملاحظة: قد يؤدي فترة حضانة أطول في خلفية زيادة الربط. - الطرد المركزي الخرز في س 1,000 ز عند 4 درجة مئوية للحد الأدنى 1 إزالة المادة طافية وإضافة 400 ميكروليتر من المخزن المؤقت للغسيل فكليب. بلطف إعادة تعليق الخرز بعكس 3 ~ 4 مرات.
- كرر الخطوة يغسل ثلاث مرات. بعد الغسيل النهائي، إزالة المادة طافية تماما.
- إضافة 300 ميكروليتر فكليب شطف المخزن المؤقت. احتضان في ثيرموميكسير على ح 3 عند 25 درجة مئوية الوت روبية باكستانية من الخرز.
ملاحظة: إعداد المخزن المؤقت شطف فكليب الطازجة. - الطرد المركزي في 1,000 س ز في درجة حرارة الغرفة ونقل المادة طافية إلى أنبوب سيليكونيزيد نظيفة.
ملاحظة: أنبوب ميكروسينتريفوجي أيضا طيب، ولكن يفضل أنبوب سيليكونيزيد لمنع التبخر أثناء الخطوة دي-كروسلينكينج (الخطوة 2.3.12). - إضافة 300 ميكروليتر من البروتيناز ك (20 ملغ/مل) واحتضان بين عشية وضحاها في 65 درجة مئوية.
ملاحظة: استخدم ثيرموميكسير مع غطاء ساخن لتجنب التبخر.
- استخراج الحمض النووي الريبي
- إضافة ميكروليتر 580 حمض الفينول كلوروفورم ودوامه لإينكوباتي س. 30 في 37 درجة مئوية ح 1.
- دوامة 30 ثانية وأجهزة الطرد المركزي في س 12,000 ز في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
- نقل الطبقة العليا في أنبوب ميكروسينتريفوجي مل 1.5 نظيفة. إضافة إلى حجم 1/10 م 3 نواك، ميكروليتر 0.5 من كوبريسيبيتانت (مثلاً، جليكوبلوي)، ووحدة تخزين متساوية من الكحول. تبني بين عشية وضحاها في-20 درجة مئوية.
- يعجل بالكريات التي سينتريفوجينج بأقصى سرعة ممكنة عند 4 درجة مئوية عن ح 1.
ملاحظة: إذا لم تراع الكريات الحمض النووي الريبي/الحمض النووي، إضافة ميكروليتر 0.5 إضافية كوبريسيبيتانت والطرد المركزي حاء – 1 إضافية متابعة هذه الخطوة حتى تحترم الكريات الحمض النووي الريبي/الحمض النووي. - إزالة المادة طافية وإضافة 1 مل كحول الاثيلي 75%. أجهزة الطرد المركزي في 12,000 س ز عند 4 درجة مئوية للحد الأدنى 5 كرر الخطوة يغسل مرة أخرى. إزالة المادة طافية تماما وجاف بيليه في درجة حرارة الغرفة.
- إضافة ميكروليتر 42 إصلاح 5 ميكروليتر من الدناز أنا المخزن المؤقت، 1 ميكروليتر من "مثبط رناسي" وميكروليتر 2 "احتضان الدناز أولاً" في 37 درجة مئوية ح 1.
- إضافة ميكروليتر 150 من إصلاح و 200 ميكروليتر من حمض الفينول كلوروفورم. دوامة للطرد المركزي س. 30 في س 12,000 ز في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
- نقل الطبقة العليا في أنبوب ميكروسينتريفوجي مل 1.5 نظيفة. إضافة 20 ميكروليتر من 3 م نواك، 0.5 ميكروليتر من كوبريسيبيتانت، و 1 مل من الكحول الاثيلي 100%. تبني بين عشية وضحاها في-80 درجة مئوية.
- يعجل بالكريات وتغسل بالكحول الاثيلي 75% كما هو موضح في الخطوات 2.4.4 إلى 2.4.5.
- إعادة تعليق في المقدار المناسب من إصلاح.
3-تسلسل إعداد المكتبة
- إزالة الرنا الريباسي
- إعادة تعليق الكريات الجيش الملكي النيبالي من الخطوة 2.4.10 مع 28 ميكروليتر من إصلاح.
ملاحظة: يجب أن يكون الحد الأقصى لمجموع الجيش الملكي النيبالي أقل من 5 ميكروغرام. - اتبع الإجراءات المقدمة من مجموعة أدوات إزالة الرنا الريباسي دليل مرجعي لإزالة الرنا الريباسي.
- تنظيف الرنا الريباسي المستنفد الكشف عن طريق إضافة 160 ميكروليتر من حبات مغناطيسية.
- مزيج من بيبيتينج 15 مرة ~ واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
- إرفاق الأنبوب على شريط مغناطيسي وإزالة المادة طافية.
- إضافة 300 ميكروليتر من الكحول الاثيلي 80% بينما هي لا تزال تعلق على شريط مغناطيسي الخرز واحتضان لمدة 30 ثانية.
- يستعاض عن الكحول الاثيلي بحل 300 ميكروليتر طازجة. الهواء الجاف الخرز على شريط مغناطيسي لمدة 12 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- إعادة تعليق الخرز في 12 ميكروليتر من إصلاح ومزيج من بيبيتينج 15 مرة.
- إرفاق الخرز على شريط مغناطيسي ونقل المادة طافية إلى أنبوب بكر نظيفة.
- تستنفد الكشف الريباسي مجزأة (ررناس) المقدمة من الرنا الريباسي طقم استنفاد الإجراءات التالية.
- تنظيف الكشف عن طريق إضافة 110 ميكروليتر الخرز المغناطيسي وتكرار الخطوات 3.1.3.1 إلى 3.1.3.6.
- إعادة تعليق الكريات الجيش الملكي النيبالي من الخطوة 2.4.10 مع 28 ميكروليتر من إصلاح.
- ربط وضع العلامات ومحول الحمض النووي الريبي
- في الكشف المنضب الرنا الريباسي، إضافة 2 ميكروليتر من المخزن المؤقت x CIAP 10 و 1 ميكروليتر من مثبط رناسي 2 ميكروليتر من أنتاركتيكا الفوسفاتيز القلوية. احتضان في 37 درجة مئوية ح 1، ثم في 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لإلغاء تنشيط في الفوسفاتيز.
- إضافة ميكروليتر 3 من 10 x PNK العازلة، 1.5 ميكروليتر من مثبط رناسي، ميكروليتر 1.5 الإنزيم وميكروليتر 0.8 للبحث والتطوير-ATP ميكروليتر 1.7 من إصلاح بنك T4. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 50 دقيقة.
- إضافة ميكروليتر 1.5 ملم 10 ATP واحتضان في 37 درجة مئوية لإضافية 40 دقيقة.
- وقف رد الفعل بإضافة 170 ميكروليتر من المخزن المؤقت شطف الحمض النووي الريبي.
- إضافة 200 ميكروليتر من حمض الفينول كلوروفورم ودوامه للطرد المركزي س. 30 في س 12,000 ز في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
- نقل الطبقة العليا في أنبوب ميكروسينتريفوجي مل 1.5 نظيفة. إضافة 20 ميكروليتر من 3 م نواك، 0.5 ميكروليتر من كوبريسيبيتانت، و 1 مل من الكحول الاثيلي 100%. تبني بين عشية وضحاها في-80 درجة مئوية.
- يعجل بالحمض النووي الريبي الكريات وتغسل بالكحول الاثيلي 75% كما هو موضح في الخطوات 2.4.4 إلى 2.4.5. إعادة تعليق في ميكروليتر 4.5 من إصلاح وإضافة 9 ميكروليتر من 2 × صبغ تحميل الجيش الملكي النيبالي.
- حرارة العينة عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق والتحميل على جل يوريا-صفحة 10%.
- تشغيل الهلام في 370 الخامس لمدة 40 دقيقة.
ملاحظة: قبل تشغيل الهلام في 370 الخامس لمدة 90 دقيقة قبل تحميل النموذج. - قطع الهلام في منطقة النوكليوتيدات ~ 100-500 وكسر الهلام.
- إضافة 700 ميكروليتر من 0.3 M كلوريد الصوديوم واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في دوار.
- نقل الحل إلى عمود وأجهزة الطرد المركزي بأقصى سرعة في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
- نقل النذرة في أنبوب ميكروسينتريفوجي مل 1.5 نظيفة. إضافة إلى حجم 1/10 م 3 ناواك، ميكروليتر 0.5 من كوبريسيبيتانت، ووحدة تخزين متساوية من الكحول. تبني بين عشية وضحاها في-20 درجة مئوية.
- محول ربط 3 '
- يعجل بالحمض النووي الريبي الكريات وتغسل بالكحول الاثيلي 75% كما هو موضح في الخطوات 2.4.4 إلى 2.4.5.
- إعادة تعليق الكريات الجيش الملكي النيبالي في ميكروليتر 6.5 من إصلاح وإضافة 1 ميكروليتر من 10 ميكرومترات 3 ' محول.
- نقل الحل إلى أنبوب بكر واحتضان عند 70 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة.
- إضافة ميكروليتر 1 x 10 ربط المخزن المؤقت وميكروليتر 0.5 من مثبط رناسي ميكروليتر 1 من الجيش الملكي النيبالي T4 ليجاسى 2. تبني في 28 درجة مئوية ح 1، 25 درجة مئوية ح 6، و 22 درجة مئوية ح 6.
- إضافة 12 ميكروليتر من 2 × الجيش الملكي النيبالي تحميل صبغ والحرارة عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- هلام تنقية 3 ' محول متصلة الكشف كما هو موضح في 3.2.9 إلى 3.2.13.
- محول ربط 5 '
- يعجل بالحمض النووي الريبي الكريات وتغسل بالكحول الاثيلي 75% كما هو موضح في الخطوات 2.4.4 إلى 2.4.5.
- إعادة تعليق الكريات الجيش الملكي النيبالي في ميكروليتر 4.2 لإصلاح وإضافة 1 ميكروليتر من 5 ميكرومترات 5 ' محول.
- نقل الحل إلى أنبوب بكر واحتضان عند 70 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة.
- إضافة ميكروليتر 0.8 x 10 ليجاسى المخزن المؤقت، 0.4 ميكروليتر من رناسي المانع، ميكروليتر 0.8 ملم 10 ATP، 0.8 ميكروليتر من الجيش الملكي النيبالي T4 ليجاسى 1. تبني في 28 درجة مئوية ح 1، 25 درجة مئوية ح 6، و 22 درجة مئوية ح 6.
- عكس النسخ والتضخيم بكر
- في 5 ' محول إضافة الكشف الواصلة، ميكروليتر 1 من 4 ميكرومترات النسخ العكسي التمهيدي. احتضان عند 70 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة وبارد فورا إلى 4 درجات مئوية.
- إضافة ميكروليتر 4 x 5 خ المخزن المؤقت، 4 ميكروليتر من دنتب 2.5 ملم، 1 ميكروليتر DTT و 1 ميكروليتر من مثبط رناسي 1 ميكروليتر من المنتسخة العكسية 0.1 متر. احتضان عند 50 درجة مئوية ح 1 و 70 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
- إعداد التضخيم بكر
- ميكروليتر 1 مزيج من المنتج RT 1 ميكروليتر من 25 ميكرو RPI التمهيدي، ميكروليتر 1 من 25 ميكرو RP1 التمهيدي، 10 ميكروليتر من 5 × العازلة ذات التردد العالي، 4 ميكروليتر من دنتب 2.5 ملم، 32.5 ميكروليتر من إصلاح وميكروليتر 0.5 من بوليميريز عالية الدقة.
- قم بتشغيل برنامج PCR ل 11 ~ دورات 13.
ملاحظة: هذا البرنامج لبكر: 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية لبدء ساخنة، 98 درجة مئوية لمدة 10 s، 60 درجة مئوية لمدة 30 s و 72 درجة مئوية ل 45 s للتضخيم، و 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. يتم تكرار الخطوة التضخيم لدورات 11-13.
- تنظيف المنتجات PCR استخدام 40 ميكروليتر المغناطيسي الخرز والخطوات التالية 3.1.3.1 إلى 3.1.3.6 ولكن باستخدام 10 ميكروليتر من إصلاح الوتي الحمض النووي.
- إضافة 2 ميكروليتر من الحمض الخلوي الصبغي x 10 تحميل صبغ. تحميل العينة في هلام اكريلاميد 6% وتشغيل 200 الخامس لمدة 30 دقيقة.
- وصمة عار مع سيبر الذهب (0.01% (v/v) في المخزن المؤقت x TBE 1) لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة وصمة عار في المخزن المؤقت x TBE 1 لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- قطع الهلام في منطقة النوكليوتيدات ~ 200-700 وكسر الهلام.
- إضافة 700 ميكروليتر من 0.3 M كلوريد الصوديوم واحتضان بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة الوت الحمض النووي.
- تحميل كل شيء على العمود، وأجهزة الطرد المركزي بأقصى سرعة في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
- نقل النذرة في أنبوب ميكروسينتريفوجي مل 1.5 نظيفة. إضافة إلى حجم 1/10 م 3 نواك، 0.5 ميكروليتر من كوبريسيبيتانت، ووحدة تخزين متساوية من الكحول. تبني بين عشية وضحاها في-20 درجة مئوية.
- يعجل بالكريات الحمض النووي وتغسل بالكحول الاثيلي 75% كما هو موضح في الخطوات 2.4.4 إلى 2.4.5. إعادة تعليق في 20 ميكروليتر من إصلاح.
- تحليل العينة التسلسل باستخدام.
4-تحليل التفاعل روبية باكستانية الكشف باستخدام PCR قرة
- الأسلوب 1: هيكسامير عشوائي عكس النسخ
- إعادة تعليق الكريات الجيش الملكي النيبالي من الخطوة 2.4.10 مع ميكروليتر 8.5 من إصلاح ونقل الحل إلى أنبوب PCR.
- إضافة ميكروليتر 0.5 من 100 ميكرومتر عشوائي hexamers و 4 ميكروليتر من مزيج دنتب 2.5 ملم.
- احتضان الحرارة الحل عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وعلى الفور على الجليد لمدة 1 دقيقة على الأقل.
- جعل رد فعل مزيج: 4 ميكروليتر من المخزن المؤقت x SSIV 5، 1 ميكروليتر من 100 مم DTT، 1 ميكروليتر من "مثبط رناسي"، وميكروليتر 1 من المنتسخة العكسية (يو 200/ميكروليتر). إضافة مزيج رد فعل لحل الجيش الملكي النيبالي.
- احتضان هذا الخليط في 23 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، 50 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، و 80 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
- تحليل كدنا استخدام نظام PCR الوقت الحقيقي.
ملاحظة: برنامج PCR الوقت الحقيقي: 95 درجة مئوية لمدة 3 دقيقة لبداية ساخنة، 95 درجة مئوية 5 s و 60 درجة مئوية لمدة 10 s للتضخيم، و 95 درجة مئوية لمدة 30 ق، 65 درجة مئوية لمدة 30 s، و 95 درجة مئوية لمدة 30 ق تذوب. يتم تكرار الخطوة التضخيم لدورات 40.
- الأسلوب 2: النسخ العكسي حبلا على حدة
- إعداد مزيج رئيسي عكس كبسولة تفجير: مزيج من كميات متساوية من الجينات المحددة النسخ العكسي الإشعال تحتوي على تسلسل مروج CMV تليها النيوكليوتيدات ~ 20 من جينات تسلسل معين.
ملاحظة: تركيز مجتمعة جميع الجينات محددة RT كبسولة تفجير 4 ميكرومتر. - إعادة تعليق الكريات الجيش الملكي النيبالي من الخطوة 2.4.10 مع ميكروليتر 8.5 من إصلاح ونقل الحل إلى أنبوب PCR.
- إضافة ميكروليتر 0.5 4 ميكرومترات مزيج الرئيسي النسخ العكسي كبسولة تفجير وميكروليتر 4 من مزيج دنتب 2.5 ملم.
- احتضان الحرارة الحل عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وعلى الفور على الجليد لمدة 1 دقيقة على الأقل.
- تحضير حل رد فعل بخلط 4 ميكروليتر من المخزن المؤقت x SSIV 5, 1 ميكروليتر من 100 مم DTT، 1 ميكروليتر من "مثبط رناسي"، وميكروليتر 1 من المنتسخة العكسية (يو 200/ميكروليتر). إضافة حل رد فعل إلى مزيج الحمض النووي الريبي التمهيدي.
- احتضان الحل عند 50 درجة مئوية لمدة 10 دقائق و 80 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
- تحليل كدنا استخدام نظام PCR الوقت الحقيقي.
ملاحظة: البرنامج لبكر في الوقت الحقيقي نفسه كالموضحة في "الطريقة الأولى".
- إعداد مزيج رئيسي عكس كبسولة تفجير: مزيج من كميات متساوية من الجينات المحددة النسخ العكسي الإشعال تحتوي على تسلسل مروج CMV تليها النيوكليوتيدات ~ 20 من جينات تسلسل معين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويرد في الشكل 1تخطيطي لعملية إلقاء القبض على خلايا هيلا إلى المرحلة S أو M من دورة الخلية. لنموذج القبض على المرحلة M، نحن وضوح تصور الخلايا على شكل جولة تحت المجهر (الشكل 2A). دراسة كفاءة القبض على دورة الخلية، يمكن تحليل محتوى الخلية النووية باستخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية (الشكل 2). ويبين الشكل 3 بيانات تمثيلية لاختبار كفاءة إيمونوبريسيبيتيشن، حيث يظهر جسم D7F7 قدرة فائقة على إيمونوبريسيبيتاتي روبية باكستانية. وهذا الاختلاف في كفاءة إيمونوبريسيبيتيشن قد انعكست في التفاوت في توزيع فئة المكتبات التسلسل الفائق المعدة باستخدام اثنين من أجسام روبية باكستانية مختلفة (الشكل 4). أكد خصوصية جسم D7F7 استخدام تحليل كامل وصمة عار الغربية إيمونوبريسيبيتاتي روبية باكستانية (الشكل 5A) وخلية الإجمالي ليستي (الشكل 5 (ب)). ويبين الشكل 6 إشارة النظائر المشعة قبل وبعد إزالة ررناس أثناء إعداد المكتبة التسلسل الفائق. يبين الشكل 7 في إثراء مترناس في الكشف co-إيمونوبريسيبيتاتيد مع روبية باكستانية، ولكن ليس في الكشف co-إيمونوبريسيبيتاتيد مع أرنب مفتش أو DiGeorge متلازمة الصبغية المنطقة 8 (DGCR8). ويبين الشكل 8 حبلا الممثل محددة تحليل qRT-بكر مترناس بكر زمنياً في S أو M-مرحلة القبض على عينات.
رقم 1: التخطيطي لإعداد دورة الخلية اعتقال العينات. (أ وب) الخطط لإعداد S (A) أو خلايا هيلا القبض على المرحلة م (ب). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: تحليل لدورة الخلية اعتقال عينات. (أ) المرحلة الصور على النقيض من عينات القبض على المرحلة S أو M. أشرطة تشير إلى 250 ميكرومتر. (ب) نظام مراقبة الأصول الميدانية التحليل يظهر المحتوى النووي للعينات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: اختبار الكفاءة إيمونوبريسيبيتيشن للأجسام المضادة PKR- لنجاح التخصيب للكشف روبية باكستانية زمنياً، ينبغي استخدام جسم مضاد مع كفاءة إيمونوبريسيبيتيشن نهائي مثل جسم D7F7. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: التوزيع فئة الحمض النووي الريبي لمكتبات تسلسل إعدادها باستخدام الأجسام المضادة روبية باكستانية مختلفة. استخدام الأجسام المضادة روبية باكستانية مختلفة عن فكليب أدى إلى توزيع فئة مختلفة من تسلسل معين على ما يلي. ومن المرجح التفاوت بسبب الاختلافات في الكفاءة إيمونوبريسيبيتيشن. وقد تم تعديل هذا الرقم من كيم وآخرون28. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: خصوصية جسم D7F7 PKR. (أ وب) وأظهر تحليل كلها وصمة عار الغربية إيمونوبريسيبيتاتيد روبية باكستانية (A) أو مجموع هيلا ليستي (ب) الفرقة قوية واحدة فقط المقابلة لحجم روبية باكستانية، مشيراً إلى أن جسم D7F7 محددة للغاية في الاعتراف بروبية باكستانية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 6: إشارة النظائر المشعة للكشف co-إيمونوبريسيبيتاتيد PKR- (A) روبية باكستانية إيمونوبريسيبيتاتيد co الكشف يمكن الكشف عنها بواسطة وسم غاياتهم 5 ' مع r-ATP. (ب) انخفاض في إشارة راديويستوبي لوحظ عند إزالة الرنا الريباسي ناجحة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 7: التحقق تفاعلات روبية باكستانية-مترنا. سجل2 إضعاف تخصيب اليورانيوم من مترناس في الكشف co-إيمونوبريسيبيتاتيد مع الأجسام المضادة المشار إليها. وأظهرت فقط روبية باكستانية إيمونوبريسيبيتاتيد co الحمض النووي الريبي العينة تخصيب قوية من مترناس. واستخدمت الأجسام المضادة مفتش الأرانب و DGCR8 كعناصر سلبية. وقد تم تعديل هذا الرقم من كيم وآخرون28. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 8: تحليل qRT PCR حبلا على حدة مترناس روبية باكستانية زمنياً. (أ وب) واستخدمت النسخ العكسي حبلا على حدة لتحليل سترانديدنيس مترناس التي كانت إيمونوبريسيبيتاتيد co مع PKR S (A) أو الخلايا مرحلة القبض م (ب). وقد تم تعديل هذا الرقم من كيم وآخرون28. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويتضح في عملية إعداد العينات القبض على المرحلة S أو M في الشكل 1. إلقاء القبض على الخلايا في مرحلة ثانية، استخدمنا أسلوب كتلة مزدوجة thymidine حيث أننا تعامل الخلايا مع thymidine مرتين مع إطلاق سراح 9 ح بينهما لضمان اعتقال عالية الكفاءة (الشكل 1A). م مرحلة الاعتقال، نحن تعامل الخلايا مرة واحدة مع thymidine متبوعاً بإطلاق سراح ح 9 ومن ثم تطبيق نوكودازولي إلى كتلة الخلايا في بروميتافاسي (الشكل 1B). خطوة رئيسية في إعداد نموذج دورة الخلية هي خطوة الإفراج بعد أول كتلة thymidine. لإزالة thymidine تماما، من الضروري غسل الخلايا مرتين على الأقل مع برنامج تلفزيوني جديد. الغسيل غير لائق والتريتيوم المتبقية يمكن أن ينتج في زيادة التباين واستمرارية انخفاض الخلية. يمكن تأكيد نجاح م مرحلة الاعتقال بصريا استناداً إلى الزيادة في عدد الخلايا مستدير (الشكل 2A). ومع ذلك، لا يزال عينة المرحلة م يحتوي على العديد من خلايا الطور البيني استناداً على مورفولوجيا. جمع فقط مرحلة م القبض على الخلايا، قمنا بتطبيق القوة البدنية لفصل الخلايا المرحلة م من على سطح الأرض. كذلك دراسة محتوى الخلايا المقطوع النووية باستخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية، التي أظهرت ذروتها واسعة بين 2n و 4n لمرحلة ثانية، وذروة حادة في 4n للعينة م القبض على المرحلة (الشكل 2). البروتوكول المقدم هو الأمثل لخلايا هيلا، التي لها وقت مضاعفة ما يقرب من 24 ساعة. يمكن تطبيق فكرة مزدوجة كتلة thymidine و thymidine-نوكودازولي على خطوط الخلايا الأخرى، ولكن بحاجة إلى المدد المعاملة والإفراج عن المخدرات الضبط الأمثل على أساس الوقت مضاعفة الخلايا المستهدفة.
لتحديد الكشف التفاعل روبية باكستانية، نحن مجمعات كروسلينكيد روبية باكستانية-الجيش الملكي النيبالي مع فورمالدهايد وإغناء لهم عن طريق إيمونوبريسيبيتيشن. عوامل رئيسية التي تحدد دقة التحليل اللاحق هو كفاءة إيمونوبريسيبيتيشن. قد اختبرنا العديد من الأجسام المضادة التي تستهدف مختلف [ابيتوبس] من البروتين روبية باكستانية من أجل تحديد جسم لإعداد مكتبة التسلسل الفائق. كما هو موضح في الشكل 3، وجدنا أن جسم D7F7 يعترف بمنطقة رابط بين المجالات الملزمة دسرنا والمجال الحفاز وأظهرت قدرة فائقة في التقاط روبية باكستانية. جسم الأخرى هو موضح في الشكل 3 (المجلس الملي) تسلم منطقة الطرفي ن، ولكن يظهر من قدرة فقراء في إيمونوبريسيبيتاتينج روبية باكستانية. ونتيجة لذلك، المكتبة التسلسل الفائق المعدة باستخدام جسم المجلس الملي الواردة كثيرة ما يلي تسلسل الخلفية المنتشرة في جميع أنحاء الجينوم، وبخاصة في إينترونس، دون تراكمات متميزة في مناطق محددة28 (الشكل 4). نعتقد أن التباين في المكتبتين التسلسل في الغالب بسبب الاختلافات في القدرات الأجسام المضادة في التقاط روبية باكستانية خلال الخطوة إيمونوبريسيبيتيشن. كذلك قمنا بفحص خصوصية جسم D7F7 روبية باكستانية من خلال التحليلات الغربية وصمة عار كله إيمونوبريسيبيتاتي (الشكل 5A) ومجموع هيلا ليساتيس (الشكل 5 (ب)). في كل البقع، لاحظنا فقط واحد الفرقة القوية التي تناظر روبية باكستانية. وهذا يشير إلى أن جسم D7F7 محددة للغاية وأن تعكس تسلسل البيانات التي تم الحصول عليها باستخدام الأجسام المضادة D7F7 المحتمل الحقيقي التمثيلات الحمض النووي الريبي لروبية باكستانية.
خطوة حاسمة أثناء إعداد المكتبة التسلسل الفائق هو إزالة ررناس. حيث أننا كروسلينكيد الجيش الملكي النيبالي-الممارسات التجارية التقييدية المجمعات مع فورمالدهايد، استخدمنا أولتراسونيكاتور لتحلل كامل للخلايا. أدت هذه العملية إلى تجزؤ rRNAs، مما خفض إلى حد كبير كفاءة إزالة الرنا الريباسي الرنا الريباسي استخدام مجموعة أدوات إزالة. لحل هذه المشكلة، ونحن أول من استخدم الرنا الريباسي "إزالة طقم" تليها الرنا الريباسي استنفاد كيت (انظر الجدول للمواد)، الذي تمت إزالته تماما تقريبا ررناس وأقل من 1% من مجموع التسلسل على ما يلي تم تعيينها إلى ررناس. نحن استخدام هذه مجموعتين من المجموعات تسلسلياً الرنا الريباسي "طقم استنفاد" يحتوي سعة قصوى من فقط 1 ميكروغرام في حين الرنا الريباسي "طقم إزالة" لديه قدرة قصوى من 5 ميكروغرام. لقد شهدنا باستخدام أكثر من الكمية الموصى بها من الجيش الملكي النيبالي إجمالي ينتج كمية كبيرة من ما يلي تسلسل معين إلى ررناس. يمكن تأكيد نجاح إزالة الرنا الريباسي بعد وسم الكشف مع r-ATP من خلال رد فعل بنك. بينما الرنا الريباسي أظهر الكشف المنضب عصابة متميزة حوالي 150 nt، العينة قبل إزالة الرنا الريباسي يظهر قوي إشارة في جميع أنحاء المنطقة المقابلة 50 ~ 300 nt (الشكل 6).
واحد الحد من crosslinking فورمالدهايد هو انخفاض كفاءة إيمونوبريسيبيتيشن. عادة استخدام التطبيقات الأخرى من crosslinking فورمالدهايد مثل إيمونوسيتوتشيميستري 4% بارافورمالدهيد حل للتثبيت. ومع ذلك، لا يمكن تطبيق شرط تثبيت قوي للتجربة فكليب نظراً لأنه يقلل إلى حد كبير كفاءة إيمونوبريسيبيتيشن، الذي ينتج معلومات أساسية أعلى. وعلاوة على ذلك، والفورمالديهايد التثبيت crosslinks البروتين-بروتين المجمعات بالإضافة إلى مجمعات البروتين-الجيش الملكي النيبالي. ولذلك، يحتاج المرء إلى دفع الحذر في تفسير البيانات فكليب.
وكما ذكرت سابقا، تشكل مترناس دسرناس الجزيئات التي يعترف بها روبية28. أولاً نحن التحقق من صحة البيانات المتوفرة لدينا تسلسل بدراسة التفاعلات مترنا روبية باكستانية عن طريق PCR قرت. كنا أرنب مفتش والأجسام المضادة DGCR8 كعناصر تحكم السلبية، التي لم تظهر أي إثراء مترناس (الشكل 7). من المذكرة، DGCR8 بروتين ملزمة دسرنا النووي الذي يتم فصل فعلياً من مترناس. في الوقت نفسه، أظهر الكشف إيمونوبريسيبيتاتيد co روبية باكستانية تخصيب قوية من مترناس (الشكل 7).
لمزيد تحليل التفاعلات روبية باكستانية-مترنا، أجرينا حبلا على حدة النسخ العكسي لتمييز مترناس الثقيلة-حبلا من مترناس الخفيفة-ستراند (الشكل 8). لقد قمنا بتصميم النسخ العكسي الإشعال التي لها تسلسل مروج CMV متبوعاً تسلسل الجين على حدة وثم استخدام تسلسل مروج CMV التمهيدي الأيسر والإشعال الصحيحة الخاصة بالجينات لتحليل قبكر. قد اختبرنا أيضا SP6 المروج وتسلسل التمهيدي تسلسل بجي بدلاً من تسلسل مروج CMV. ووجدنا أن بينما المروج CMV وبجي تسلسل متواليات التمهيدي أظهرت نتيجة جيدة، استخدام تسلسل المروج SP6 لم. والفرق سبب المحتوى المنخفض من GC تسلسل المروج SP6 (~ 33%) مقارنة بتلك المروج CMV (~ 67%) والتمهيدي التسلسل بجيكس (~ 65%) تسلسل. يمكن بسهولة تطبيق المخطط المقترح للنسخ العكسي حبلا محددة أخرى دسرناس الجزيئات، ولكن عند تصميم كبسولة تفجير النسخ العكسي، محتوى GC يجب أن يؤخذ في الاعتبار.
وعموما، أثبتنا إعداد عينات دورة الخلية اعتقال وإثراء التفاعل روبية باكستانية الكشف عن طريق crosslinking فورمالدهايد وإيمونوبريسيبيتيشن. استخدام جسم D7F7 عالي كفاءة، لدينا بنجاح معزولة الكشف روبية باكستانية زمنياً وحددت هذه الكشف بتوليد وتحليل مكتبة تسلسل الفائق. وعلاوة على ذلك، قدمنا لتحليل سترانديدنيس مترناس منضمة إلى روبية باكستانية، نهجاً نسخ عكسي حبلا على حدة. ونحن نتوقع أن البروتوكول المقدمة يمكن أن يكون الأمثل بسهولة لدراسة التمثيلات الحمض النووي الريبي لأخرى دسرببس وسترانديدنيس من دسرناس الجزيئات التي يتم تشكيلها عن طريق التفاعل التكميلية بين العقل والنصوص العقاقير.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل "برنامج بحوث العلوم الأساسية" عبر الوطنية بحوث مؤسسة من كوريا (جبهة الخلاص الوطني) الممولة من الحكومة الكورية وزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات (جبهة الخلاص الوطني-2016R1C1B2009886).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9260G | |
| 1 M Tris, pH 7.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9855G | |
| 1 M Tris, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9855G | |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-175-C | |
| 10% Nonidet-p40 (NP-40) | Biosolution | BN015 | |
| 10X DNA loading buffer | TaKaRa | 9157 | |
| 15 mL conical tube | SPL | 50015 | |
| 3' adaptor | 5'-rApp NN NNT GGA ATT CTC GGG TGC CAA GG/3ddC/-3' | ||
| 3 M Sodium Acetate pH 5.5 | Thermo Fisher Scientific | AM9740 | |
| 5' adaptor | 5'-GUU CAG AGU UCU ACA GUC CGA CGA UCN NNN-3' | ||
| 5 M NaCl | Thermo Fisher Scientific | AM9760G | |
| 50 mL conical tube | SPL | 50050 | |
| Acid-phenol chloroform, pH 4.5 | Thermo Fisher Scientific | AM9722 | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic beads DNA/RNA clean up |
| Antarctic alkaline phosphatase | New England Biolabs | M0289S | |
| Anti-DGCR8 | Made in house | ||
| Anti-PKR (D7F7) | Cell signaling technology | 12297S | |
| Anti-PKR (Milli) | Millipore EMD | 07-151 | |
| ATP (100 mM) | GE Healthcare | GE27-2056-01 | |
| Bromophenol blue sodium salt | Sigma-aldrich | B5525 | |
| Calf intestinal alkaline phosphatase | TaKaRa | 2250A | |
| Cell scraper 25 cm 2-position | Sarstedt | 83.183 | |
| CMV promoter sequence | 5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3' | ||
| Dulbecco's modified eagle medium | Welgene | LM001-05 | |
| dNTP mixture (2.5 mM) | TaKaRa | 4030 | |
| Ethanol, Absolute, ACS Grade | Alfa-Aesar | A9951 | |
| Fetal bovine serum | Merck | M-TMS-013-BKR | |
| Formamide | Merck | 104008 | |
| Glycine | Bio-basic | GB0235 | |
| GlycoBlue coprecipitant (15 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | AM9516 | |
| Isopropanol | Merck | 8.18766.1000 | |
| NEBNext rRNA Depletion Kit | New England Biolabs | E6318 | rRNA Depletion Kit |
| Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404 | |
| Normal rabbit IgG | Cell signaling technology | 2729S | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 6148 | |
| PCR forward primer (RP1) | 5'-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GCG ATC TAC ACG TTC AGA GTT CTA CAG TCC GA-3' | ||
| PCR index reverse primer (RPI) | 5'-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT NNN NNN GTG ACT GGA GTT CCT TGG CAC CCG AGA ATT CCA-3' | ||
| PCR tubes with flat cap, 0.2 mL | Axygen | PCR-02-C | |
| Phosphate bufered saline (PBS) Tablet | TaKaRa | T9181 | |
| Phusion high-fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530 | High-fidelity polymerase |
| PlateFuge microcentrifuge with swing-out rotor | Benchmark | c2000 | |
| Polynucleotide kinase (PNK) | TaKaRa | 2021A | |
| Proteinase K, recombinant, PCR Grade | Sigma-Aldrich | 3115879001 | |
| qPCR primer sequence: CO1 Heavy | Forward/Reverse: 5′-GCCATAACCCAATACCAAACG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO1 Light | Forward/Reverse: 5′-TTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO2 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO2 Light | Forward/Reverse: 5′-GTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO3 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO3 Light | Forward/Reverse: 5′-CTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CYTB Heavy | Forward/Reverse: 5′-CAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CYTB Light | Forward/Reverse: 5′-GGATAGTAATAGGGCAAGGACG -3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: GAPDH | Forward/Reverse: 5′-CAACGACCACTTTGTCAAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND1 Heavy | Forward/Reverse: 5′-TCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND1 Light | Forward/Reverse: 5′-GTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND4 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CTCACACTCATTCTCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND4 Light | Forward/Reverse: 5′-TGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND5 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CTAGGCCTTCTTACGAGCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND5 Light | Forward/Reverse: 5′-TAGGGAGAGCTGGGTTGTTT-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND6 Heavy | Forward/Reverse: 5′-TCATACTCTTTCACCCACAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND6 Light | Forward/Reverse: 5′-TGCTGTGGGTGAAAGAGTATG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| Random hexamer | Thermo Fisher Scientific | SO142 | |
| Recombinant Dnase I (Rnase-free) (5 U/μL) | TaKaRa | 2270A | |
| Recombinant Rnase inhibitor (40 U/μL) | TaKaRa | 2313A | |
| Ribo-Zero rRNA Removal Kit | Illumina | MRZH116 | rRNA Removal Kit |
| Rotator | FINEPCR, ROTATOR AG | D1.5-32 | |
| RT primer sequence: CO1 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′ | ||
| RT primer sequence: CO1 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGCCATAACCCAATACCAAACG-3′ | ||
| RT primer sequence: CO2 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′ | ||
| RT primer sequence: CO2 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′ | ||
| RT primer sequence: CO3 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′ | ||
| RT primer sequence: CO3 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′ | ||
| RT primer sequence: CYTB Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGATAGTAATAGGGCAAGGACG-3′ | ||
| RT primer sequence: CYTB Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′ | ||
| RT primer sequence: GAPDH | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGAGCGATGTGGCTCGGCT-3′ | ||
| RT primer sequence: ND1 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND1 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND4 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND4 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTCACACTCATTCTCAACCC-3′ | ||
| RT primer sequence: ND5 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTTGGGTTGAGGTGATGATG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND5 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCATTGTCGCATCCACCTTTA-3′ | ||
| RT primer sequence: ND6 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGTTGAGGTCTTGGTGAGTG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND6 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCCATAATCATACAAAGCCCC-3′ | ||
| Siliconized polypropylene 1.5 mL G-tube | Bio Plas | 4167SLS50 | |
| Sodium dedecyl sulfate | Biosesang | S1010 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| SUPERase In Rnase inhibitor | Thermo Fisher Scientific | AM2694 | |
| SuperScript III reverse transcriptase | Thermo Fisher Scientific | 18080093 | Reverse transcriptase for library preparation |
| SuperScript IV reverse transcriptase | Thermo Fisher Scientific | 18090010 | Reverse transcriptase for qRT-PCR |
| SYBR gold nucleic acid gl stain | Thermo Fisher Scientific | S11494 | |
| T4 polynucleotide kinase | New England Biolabs | M0201S | |
| T4 RNA ligase 1 (ssRNA Ligase) | New England Biolabs | M0204 | |
| T4 RNA ligase 2, truncated KQ | New England Biolabs | M0373 | |
| Thermomixer | Eppendorf ThermoMixer C with ThermoTop | ||
| Thymidine | Sigma-Aldrich | T9250 | |
| Tris-borate-EDTA buffer (TBE) | TaKara | T9122 | |
| Triton X-100 | Promega | H5142 | |
| Ultralink Protein A sepharose beads | Thermo Fisher Scientific | 22810 | Protein A beads |
| Ultrasonicator | Bioruptor | ||
| Urea | Bio-basic | UB0148 | |
| Vortex mixer | DAIHAN Scientific | VM-10 | |
| Xylene cyanol | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| γ-32P-ATP (10 μCi/μL, 3.3 μM) | PerkinElmer | BLU502A100UC |
References
- Meurs, E. F., et al. Constitutive expression of human double-stranded RNA-activated p68 kinase in murine cells mediates phosphorylation of eukaryotic initiation factor 2 and partial resistance to encephalomyocarditis virus growth. Journal of Virology. 66 (10), 5805-5814 (1992).
- Patel, R. C., Stanton, P., McMillan, N. M., Williams, B. R., Sen, G. C. The interferon-inducible double-stranded RNA-activated protein kinase self-associates in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (18), 8283-8287 (1995).
- Bennett, R. L., Pan, Y., Christian, J., Hui, T., May, W. S. The RAX/PACT-PKR stress response pathway promotes p53 sumoylation and activation, leading to G(1) arrest. Cell Cycle. 11 (1), 407-417 (2012).
- Yang, X., Nath, A., Opperman, M. J., Chan, C. The double-stranded RNA-dependent protein kinase differentially regulates insulin receptor substrates 1 and 2 in HepG2 cells. Molecular and Cellular Biology. 21 (19), 3449-3458 (2010).
- Zamanian-Daryoush, M., Mogensen, T. H., DiDonato, J. A., Williams, B. R. G. NF-kappa B Activation by Double-Stranded-RNA-Activated Protein Kinase (PKR) Is Mediated through NF-kappa B-Inducing Kinase and Ikappa B Kinase. Molecular and Cellular Biology. 20 (4), 1278-1290 (2000).
- Takada, Y., Ichikawa, H., Pataer, A., Swisher, S., Aggarwal, B. B. Genetic deletion of PKR abrogates TNF-induced activation of IkappaBalpha kinase. JNK, Akt and cell proliferation but potentiates p44/p42 MAPK and p38 MAPK activation. Oncogene. 26 (8), 1201-1212 (2007).
- Dabo, S., Meurs, E. F. dsRNA-dependent protein kinase PKR and its role in stress, signaling and HCV infection. Viruses. 4 (11), 2598-2635 (2012).
- Black, T. L., Safer, B., Hovanessian, A., Katze, M. G. The Cellular 68,000-Mr Protein-Kinase Is Highly Autophosphorylated and Activated yet Significantly Degraded during Poliovirus Infection - Implications for Translational Regulation. Journal of Virology. 63 (5), 2244-2251 (1989).
- Bando, Y., et al. Double-strand RNA dependent protein kinase (PKR) is involved in the extrastriatal degeneration in Parkinson's disease and Huntington's disease. Neurochemistry International. 46 (1), 11-18 (2005).
- Onuki, R., et al. An RNA-dependent protein kinase is involved in tunicamycin-induced apoptosis and Alzheimer's disease. The EMBO Journal. 23 (4), 959-968 (2004).
- Peel, A. Activation of the cell stress kinase PKR in Alzheimer's disease and human amyloid precursor protein transgenic mice. Neurobiology of Disease. 14 (1), 52-62 (2003).
- Peel, A. L. Double-stranded RNA-dependent protein kinase, PKR, binds preferentially to Huntington's disease (HD) transcripts and is activated in HD tissue. Human Molecular Genetics. 10 (15), 1531-1538 (2001).
- Suen, K. C., Yu, M. S., So, K. F., Chang, R. C., Hugon, J. Upstream signaling pathways leading to the activation of double-stranded RNA-dependent serine/threonine protein kinase in beta-amyloid peptide neurotoxicity. Journal of biological chemistry. 278 (50), 49819-49827 (2003).
- Nakamura, T., et al. A critical role for PKR complexes with TRBP in Immunometabolic regulation and eIF2alpha phosphorylation in obesity. Cell Reports. 11 (2), 295-307 (2015).
- Saito, S. Enhancement of the interferon-induced double-stranded RNA-dependent protein kinase activity by Sindbis virus infection and heat-shock stress. Microbiology and Immunology. 34 (10), 859-870 (1990).
- Youssef, O. A., et al. Potential role for snoRNAs in PKR activation during metabolic stress. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (16), 5023-5028 (2015).
- Murtha-Riel, P., Davies, M. V., Choi, S. Y., Hershey, J. W., Kaufman, R. J. Expression of a Phosphorylation-resistant Eukaryotic Initiation Factor 2 a-Subunit Mitigates Heat Shock Inhibition of Protein Synthesis. The Journal of Biological Chemistry. 268, 12946-12951 (1993).
- Benkirane, M., et al. Oncogenic potential of TAR RNA binding protein TRBP and its regulatory interaction with RNA-dependent protein kinase PKR. The EMBO Journal. 16 (3), 611-624 (1997).
- Koromilas, A., Roy, S., Barber, G., Katze, M., Sonenberg, N. Malignant transformation by a mutant of the IFN-inducible dsRNA-dependent protein kinase. Science. 257 (5077), 1685-1689 (1992).
- Kim, Y., et al. PKR is activated by cellular dsRNAs during mitosis and acts as a mitotic regulator. Genes & Development. 28 (12), 1310-1322 (2014).
- Kim, Y., et al. Deletion of human tarbp2 reveals cellular microRNA targets and cell-cycle function of TRBP. Cell Reports. 9 (3), 1061-1074 (2014).
- Zhu, P. J., et al. Suppression of PKR promotes network excitability and enhanced cognition by interferon-gamma-mediated disinhibition. Cell. 147 (6), 1384-1396 (2011).
- Dagon, Y., et al. Double-stranded RNA-dependent protein kinase, PKR, down-regulates CDC2/cyclin B1 and induces apoptosis in non-transformed but not in v-mos transformed cells. Oncogene. 20 (56), 8045-8056 (2001).
- Elbarbary, R. A., Li, W., Tian, B., Maquat, L. E. STAU1 binding 3' UTR IRAlus complements nuclear retention to protect cells from PKR-mediated translational shutdown. Genes & Development. 27 (13), 1495-1510 (2013).
- Cho, J., et al. LIN28A is a suppressor of ER-associated translation in embryonic stem cells. Cell. 151 (4), 765-777 (2012).
- Licatalosi, D. D., et al. HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing. Nature. 456 (7221), 464-469 (2008).
- Van Nostrand, E. L., et al. Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP). Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).
- Kim, Y., et al. PKR Senses Nuclear and Mitochondrial Signals by Interacting with Endogenous Double-Stranded RNAs. Molecular Cell. 71 (6), 1051-1063 (2018).
- Kim, B., Jeong, K., Kim, V. N. Genome-wide Mapping of DROSHA Cleavage Sites on Primary MicroRNAs and Noncanonical Substrates. Molecular Cell. 66 (2), 258-269 (2017).
- Ricci, E. P., et al. Staufen1 senses overall transcript secondary structure to regulate translation. Nature Structural & Molecular Biology. 21 (1), 26-35 (2014).
- Kim, B., Kim, V. N. fCLIP-seq for transcriptomic footprinting of dsRNA-binding proteins: Lessons from DROSHA. Methods. , (2018).
- Dhir, A., et al. Mitochondrial double-stranded RNA triggers antiviral signalling in humans. Nature. 560 (7717), 238-242 (2018).
