Summary
Vi presenterer eksperimentelle metoder for studere RNA-interaktører av double-strandet RNA bindende protein kinase RNA-aktivert (PKR) under pattedyr cellen syklus bruker HeLa celler. Denne metoden bruker formaldehyd krysskobling RNA-PKR komplekser og immunoprecipitation å berike PKR-bundet RNAs. Disse RNAs kan analyseres videre gjennom høy gjennomstrømming sekvensering eller qRT PCR.
Abstract
Protein kinase RNA-aktivert (PKR) er medlem av medfødte immunforsvaret proteiner og gjenkjenner double-strandet sekundære strukturen i viral RNAs. Når bundet til viral double-strandet RNAs (dsRNAs), gjennomgår PKR dimerization og senere autophosphorylation. Fosforylert PKR (pPKR) blir aktivt og induserer fosforylering av alpha delenhet i eukaryote initiering faktor 2 (eIF2α) å undertrykke global oversettelse. Økende bevis antyder at PKR kan aktiveres under fysiologiske forhold som under cellen syklus eller ulike stress forhold uten smitte. Men er vår forståelse av RNA aktivator av PKR begrenset på grunn av mangel på en standardisert eksperimentell metode for å fange og analysere PKR-samspill dsRNAs. Her presenterer vi en eksperimentell protokoll spesielt berike og analysere PKR bundet RNAs under cellen syklus bruker HeLa celler. Vi benytter effektiv crosslinking aktiviteten av formaldehyd å fikse PKR-RNA komplekser og isolere dem via immunoprecipitation. PKR co-immunoprecipitated RNAs kan deretter bearbeides videre for å generere en høy gjennomstrømming sekvensering bibliotek. En stor klasse av PKR-samspill mobilnettet dsRNAs er mitokondrie RNAs (mtRNAs), som kan forekomme som intermolekylære dsRNAs gjennom komplementære samhandling mellom den tunge-stranden og lys-strand-RNAs. For å studere strandedness av disse dupleks mtRNAs, presenterer vi også en protokoll for strand-spesifikke qRT PCR. Våre protokollen er optimalisert for analyse av PKR-bundet RNAs, men den kan enkelt endres for å studere mobilnettet dsRNAs eller RNA-interaktører andre dsRNA binding proteiner.
Introduction
Protein kinase RNA-aktivert (PKR), også kjent som eukaryote initiering faktor 2-alfa kinase 2 (EIF2AK2), er et godt karakterisert protein kinase som overfører informasjonen fra RNAs. Den tilhører den eukaryote oversettelse innvielse 2 delenhet alpha (eIF2α) kinase familie og phosphorylates eIF2α på serine 51 i respons på infeksjon å undertrykke global oversettelsesbyrå1. I denne sammenheng aktiveres PKR viral double-strandet RNAs (dsRNAs), som gir en plattform for PKR dimerization og autophosphorylation2. I tillegg til eIF2α, kan PKR også phosphorylate p53, insulin receptor substrat 1, hemmer κB og c-Jun N-terminal kinase (JNK) for å regulere aktiviteten av mange signal signaltransduksjon trasé3,4,5, 6.
PKR ble opprinnelig identifisert som en kinase som fosforylert eIF2α under poliovirus infeksjon ved å anerkjenne poliovirus' dsRNAs7,8. PKR finnes stadig for å spille mangefasettert roller utover immunrespons og dens avvikende aktivisering eller feil er underforstått i mange menneskelige sykdommer. Aktivert/Phosphorylated PKR (pPKR) er ofte observert under apoptose og er et vanlig kjennetegn på pasienter med degenerative sykdommen, særlig nevrodegenerative sykdommer som Huntingtons, Parkinsons og Alzheimers sykdom9 ,10,11,12,13. I tillegg aktiveres PKR under ulike stress forhold som metabolske stress og varme sjokk14,15,16,17. På den annen side, resulterer hemming av PKR i økt celle spredning og selv malign transformasjon18,19. PKR-funksjonen er også viktig i normal hjernefunksjon og under cellen syklus som pPKR er opphøyet i løpet av M fase20,21,22. I denne sammenheng pPKR undertrykker global oversettelsesbyrå og gir signaler til viktige mitotisk signalnettverk systemer som kreves for riktig celledeling20. Videre resulterte langvarig aktivering av PKR i G2/M fase celle syklus arrestasjon i kinesisk hamster eggstokk celler23. Følgelig er PKR fosforylering regulert av negativ feedback loop å sikre rask deaktivering i M/G1 overgang21.
Funksjonen bredt spekter av PKR er vår forståelse av PKR aktivisering begrenset på grunn av mangel på en standardisert høy gjennomstrømming eksperimentelle tilnærming til fange og identifisere dsRNAs som kan aktivere PKR. Tidligere studier har vist at PKR samvirke med dsRNAs dannet av to invertert Alu gjentar (IRAlus)20,24, men muligheten for eksistensen av flere mobilnettet dsRNAs som kan aktivere PKR under cellen syklus eller under stress forhold i menneskeceller var uutforsket. Konvensjonelle tilnærming identifisere RNA-interaktører en RNA bindende protein (RBP) bruker UV-lys til krysskobling RNA-RBP komplekser25,26,27. En fersk studie brukt denne UV crosslinking i en mus system og identifisert at små nucleolar RNAs kan regulere PKR aktivisering under metabolske stress16. Ved å benytte høy crosslinking effektiviteten av formaldehyd, presenterte vi en alternativ metode for å identifisere PKR-samspill RNAs under cellen syklus i HeLa celler28. En lignende fremgangsmåte er brukt for å studere andre dsRBPs som Staufen og Drosha29,30,31. Vi fant at PKR samvirke med ulike typer noncoding RNAs som kort avbrutt kjernefysiske element (SINE), lang ispedd kjernefysiske element (linje) og endogene retrovirus element (ERV) med alpha-satellitt RNAs. I tillegg viste vi at PKR samvirke med mitokondrie RNAs (mtRNAs), hvilke form intermolekylære dsRNAs gjennom komplementære samhandling mellom den tunge-stranden og lyset tråd RNAs28. En fersk publikasjon støttes videre våre data at noen mtRNAs finnes i en dupleks-skjemaet og kan aktivere dsRNA sensorer som melanom differensiering-assosiert protein 5 å indusere interferoner32. Enda viktigere, er uttrykk og subcellular lokalisering av mtRNAs modulert under cellen syklus og ulike stressorer, som kan være viktige i å regulere PKR aktivisering28.
I denne artikkelen presenterer vi en detaljert protokoll for en nylig utviklet formaldehyd crosslinking og immunoprecipitation (fCLIP) metode for å fange og analysere PKR-samspill RNAs under cellen syklus. Vi viser metoden for å forberede celle syklus arrestasjon prøver ved thymidine og nocodazole. Deretter presenterer vi fCLIP prosessen å isolere PKR-bundet RNAs og en metode for å forberede høy gjennomstrømming sekvensering bibliotek for å identifisere disse RNAs. Videre avgrense vi detaljerte prosedyrer for å analysere PKR-bundet RNAs bruker qRT PCR. Spesielt, presenterer vi en strand-spesifikke omvendt transkripsjon prosedyre for å analysere strandedness for mtRNAs. Beskrevet protokollen er optimalisert for HeLa celler og PKR, men viktige trinn som utarbeidelse av cellen syklus utvalg, fCLIP og strand-spesifikke qRT PCR analyse kan enkelt endres studere mobilnettet dsRNAs eller identifisere RNA interaktører av andre dsRBPs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. løsning og celle forberedelse
- Løsning forberedelse
- For den celle kultur mediet, forberede medium for HeLa cellekultur ved å legge til 50 mL av fetal bovin serum (FBS) til 500 mL av Dulbeccos endret Eagle's Medium (DMEM).
Merk: Antibiotika kan legges til celle kultur medium, men vi bruker ikke antibiotika. - For 0,1% paraformaldehyde, oppløse 4% (w/v) paraformaldehyde i 1 x Phosphate-Buffered saltvann (PBS) med varme på en kokeplate og fortynne å 30 mL 0,1% (v/v) paraformaldehyde ved å legge til 1 x PBS.
Advarsel: Alle trinnene i avtrekksvifte og være forsiktig med å koke paraformaldehyde løsningen. Beskytte 0,1% løsningen fra lys og lagre på 4 ° C. Bruk løsningen innen en måned.
Merk: pH i den endelige 0,1% (v/v) paraformaldehyde løsningen bør være rundt 7. - Forberede fCLIP lyseringsbuffer: 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 15 mM NaCl, 10 mM EDTA, 0,5% (v/v) nonidet-p40 (NP-40), 0,1% (v/v) Triton X-100, 0,1% (v/v) natrium dodecyl sulfate (SDS) og 0,1% (w/v) natrium deoxycholate. Legg triple destillert vann (TDW) til 40 mL. Butikken på 4 ° C.
- Forberede fCLIP vaskebuffer: 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 0,1% (v/v) NP-40, 0,1% (v/v) Triton X-100, 0,1% (v/v) SDS og 0,1% (w/v) natrium deoxycholate. Legge til TDW til 40 mL. Butikken på 4 ° C.
- Forberede 4 x PK buffer: 400 mM Tris-HCl (pH 7.5), 200 mM NaCl, 40 mM EDTA, og 4% (v/v) SDS. Legge til TDW til 40 mL. Lagre ved romtemperatur.
- Forberede fCLIP elueringsbufferen: 20 mL 4 x PK buffer, 21 g av urea og 8,5 mL av TDW. Forberede frisk.
- Forberede RNA elueringsbufferen: 0,3 M NaOAc og 2% (w/v) SDS. Lagre ved romtemperatur.
- Forberede 2 x RNA lasting fargestoff: 0.025% (w/v) bromophenol blå, 0.025% (w/v) xylen cyanol, 5 mM EDTA, 0,05% (w/v) SDS og 95% (v/v) formamide. Butikken på 20 ° C.
- Forberede 1 x TBE buffer: 0.089 M Tris-Borate og 0.002 M EDTA. Forberede 500 mL TBE buffer.
- For den celle kultur mediet, forberede medium for HeLa cellekultur ved å legge til 50 mL av fetal bovin serum (FBS) til 500 mL av Dulbeccos endret Eagle's Medium (DMEM).
- Utarbeidelse av S eller M fase-arrestert celler
- Frø ~ 750.000 eller ~ 1,000,000 HeLa celler for S eller M fase-arrestert prøver, henholdsvis. Vokse cellene på 37 ° C og 5% CO2 24 h.
- Behandle cellene med 2 mM thymidine og ruge 18 h på 37 ° C.
- Vask cellene to ganger med PBS. Legge til friske medier og Inkuber 9 h på 37 ° C.
- R behandle fase-arrestert celler, celler med 2 mM thymidine. For M fase-arrestert celler, behandle celler med 100 ng/mL nocodazole. Inkuber 15 h på 37 ° C og høste celler.
Merk: Homogenitet av cellen syklus prøvene kan kontrolleres ved hjelp av FACS.
2. formaldehyd cross-linking og immunoprecipitation
- Cellen harvest
- For eksempel fase en S samle celler med cellen skraper og overføring i en 15 mL konisk rør. For en M fasen utvalget, trykker du på siden av cellen kultur retten koble M fase-arrestert celler og overføre dem inn i et 15 mL konisk rør.
Merk: For å øke homogenitet av M fase-arrestert cellene, ikke bruk cellen skraper. - Sentrifuge cellene 380 x g ved romtemperatur for 3 min. Fjern nedbryting og å suspendere med 1 mL kaldt PBS og overføre til en 1,5 mL microcentrifuge tube.
- Sentrifuge cellene på 10.000 x g ved 4 ° C for 30 s. fjerne nedbryting helt.
- For eksempel fase en S samle celler med cellen skraper og overføring i en 15 mL konisk rør. For en M fasen utvalget, trykker du på siden av cellen kultur retten koble M fase-arrestert celler og overføre dem inn i et 15 mL konisk rør.
- Formaldehyd crosslinking
- Legge til 750 μL 0,1% paraformaldehyde for 10 min ved romtemperatur å fikse cellene.
- Legg til 250 μL 1 M glysin og Inkuber en ekstra 10 minutter ved romtemperatur å slukke reaksjonen. Sentrifuge cellene på 10.000 x g ved 4 ° C for 30 s. fjerne nedbryting helt.
- Nytt suspendere med 1 mL av PBS. Sentrifuge cellene på 10 000 x g ved 4 ° C for 30 s og fjern nedbryting.
- Nytt suspendere med 400 μL fCLIP lyseringsbuffer supplert med 0,2% (v/v) protease hemmer og 2% (v/v) RNase hemmer. Ruge på is 10 min og sonicate med en ultrasonicator.
- Legge til 11 μL 5 M NaCl justere NaCl konsentrasjon ~ 150 mm. Vortex kort og sentrifuge 21,130 x g på 4 ° C for 15 min. overføre nedbryting slik pre kjølt 1,5 mL microcentrifuge.
Merk: Beholde 40 μL nedbryting i et nytt sentrifuge rør som inndata prøven. Lagre inn prøven på 4 ° C.
- Immunoprecipitation
- Legge til 20 μL Protein A perler i en 1,5 mL microcentrifuge tube.
- Vask perler med 400 μL fCLIP lyseringsbuffer. Sentrifuge perler på 1000 x g på 4 ° C i 1 Fjern nedbryting og legge til 400 μL fCLIP lyseringsbuffer nøye. Forsiktig å suspendere perler ved å snu 3 ~ 4 ganger.
- Gjenta vask trinn tre ganger. Etter siste vask, fjerne nedbryting helt.
- Nytt avbryte perlene 300 μL fCLIP lyseringsbuffer. Legge til 8.3 μL 5 M NaCl justere NaCl konsentrasjon ~ 150 mm. Tilsett 10 μL PKR antistoff og Inkuber for 3t på et rotator på 4 ° C.
- Sentrifuge perler på 1000 x g på 4 ° C i 1 Fjern nedbryting og legge til 400 μL fCLIP vaskebuffer. Forsiktig å suspendere perler ved å snu 3 ~ 4 ganger.
- Gjenta vask trinn to ganger. Etter siste vask, fjerne nedbryting helt.
Merk: Ikke bruk en vortex mikser. Invertere røret forsiktig med hender. - Legger 300 μL lysate og ruge for 3t 4 ° c på et rotator.
Merk: Lengre inkubasjon tid kan resultere i økt bakgrunn bindende. - Sentrifuge perler på 1000 x g på 4 ° C i 1 Fjern nedbryting og legge til 400 μL fCLIP vaskebuffer. Forsiktig å suspendere perler ved å snu 3 ~ 4 ganger.
- Gjenta vask trinn tre ganger. Etter siste vask, fjerne nedbryting helt.
- Legge til 300 μL fCLIP elueringsbufferen. Inkuber i en thermomixer for 3t ved 25 ° C til elute PKR fra perler.
Merk: Forberede fCLIP elueringsrør buffer frisk. - Sentrifuge 1000 x g ved romtemperatur og overføre nedbryting slik rent silikoniserte.
Merk: En microcentrifuge tube er også ok, men silikoniserte tube er foretrukket å hindre fordampning under de-crosslinking trinn (trinn 2.3.12). - Legger 300 μL proteinasen K (20 mg/mL) og ruge over natten på 65 ° C.
Merk: Bruk en thermomixer med oppvarmet cover for å unngå fordampning.
- RNA utvinning
- Legg 580 μL syre-fenol kloroform og vortex for 30 s. Incubate ved 37 ° C i 1 time.
- Vortex for 30 s og sentrifuge 12.000 x g ved romtemperatur for 10 min.
- Overfør det øverste laget til en ren 1,5 mL microcentrifuge tube. Legg til 1/10 volumet av 3 M NaOAc 0,5 μL coprecipitant (f.eks Glycoblue) og en lik mengde isopropanol. Ruge over natten på 20 ° C.
- Utløse pellets av sentrifugering med maksimal hastighet ved 4 ° C i 1 time.
Merk: Hvis RNA/DNA pellets ikke ble observert, legge en ytterligere 0,5 μL coprecipitant og sentrifuge for en ekstra 1 h. Fortsett dette trinnet til RNA/DNA pellets er observert. - Fjern nedbryting og tilsett 1 mL av 75% etylalkohol. Sentrifuge 12.000 x g på 4 ° C for 5 min. Gjenta trinnet vask en gang. Fjerne nedbryting helt og tørr pellet ved romtemperatur.
- Legge til 42 μL TDW, 5 μL DNase jeg buffer, 1 μL RNase hemmer og 2 μL DNase I. ruge på 37 ° C i 1 time.
- Tilsett 150 μL av TDW og 200 μL av syre-fenol kloroform. Vortex for 30 s. sentrifuge 12.000 x g ved romtemperatur for 10 min.
- Overfør det øverste laget til en ren 1,5 mL microcentrifuge tube. Legge til 20 μL av 3 M NaOAc, 0,5 μL coprecipitant og 1 mL av 100% etylalkohol. Ruge over natten på-80 ° C.
- Utløse pellets og vask med 75% etylalkohol som beskrevet i trinnene 2.4.4 til 2.4.5.
- Nytt avbryte riktig mengde TDW.
3. sekvensering biblioteket forberedelse
- rRNA fjerning
- Nytt suspendere RNA pellets fra trinn 2.4.10 med 28 μL TDW.
Merk: Maksimale totale RNA bør være mindre enn 5 μg. - Følg veiledningen fra den rRNA fjerning kit referanseguide for å fjerne rRNA.
- Rydde opp rRNA utarmet RNAs ved å legge til 160 μL magnetiske perler.
- Blande av pipettering ~ 15 ganger og ruge ved romtemperatur i 15 min.
- Feste tuben på en magnetisk bar og fjerne nedbryting.
- Legge til 300 μL 80% etylalkohol mens perlene er fortsatt festet på magnetiske bar og Inkuber for 30 s.
- Erstatt etylalkohol med en frisk 300 μL løsning. Luften tørr perlene på magnetiske baren for 12 min ved romtemperatur.
- Nytt suspendere perlene i 12 μL TDW og blanding av pipettering 15 ganger.
- Legge perler i feltet magnetiske og flytte nedbryting til en ren PCR-rør.
- Tømme de fragmentert ribosomal RNAs (rRNAs) følge prosedyrene fra rRNA uttømming Kit.
- Rydde opp i RNAs ved å legge til 110 μL magnetiske perler og gjenta trinn 3.1.3.1 til 3.1.3.6.
- Nytt suspendere RNA pellets fra trinn 2.4.10 med 28 μL TDW.
- RNA merking og adapter hemorroider
- På rRNA-utarmet RNAs, Legg 2 μL 10 x CIAP buffer, 1 μL RNase hemmer og 2 μL Antarktis isoenzymer. Ruge på 37 ° C i 1 time og deretter på 65 ° C i 5 min å deaktivere fosfatase.
- Legg 3 μL 10 x PNK buffer, 1,5 μL RNase hemmer, 1,5 μL T4 PNK enzym, 0,8 μL r-ATP og 1,7 μL TDW. Ruge på 37 ° C i 50 minutter.
- Legg til 1,5 μL 10 mM ATP og ruge på 37 ° C i ytterligere 40 minutter.
- Stoppe reaksjonen ved å legge til 170 μL RNA elueringsrør bufferen.
- Legge til 200 μL av syre-fenol kloroform og vortex for 30 s. sentrifuge 12.000 x g ved romtemperatur for 10 min.
- Overfør det øverste laget til en ren 1,5 mL microcentrifuge tube. Legge til 20 μL av 3 M NaOAc, 0,5 μL coprecipitant og 1 mL av 100% etylalkohol. Ruge over natten på-80 ° C.
- Utløse RNA pellets og vask med 75% etylalkohol som beskrevet i trinnene 2.4.4 til 2.4.5. Nytt avbryte 4,5 μL TDW og legge til 9 μL 2 x RNA lasting fargestoff.
- Varme prøven ved 95 ° C i 5 min og belastningen på en 10% Urea-side gel.
- Kjøre gel på 370 V i 40 minutter.
Merk: Kjøre pre gel på 370 V i 90 minutter før du legger prøven. - Klipp gel ~ 100-500 nukleotid regionen og bryte gel.
- Legg til 700 μL 0,3 M NaCl og ruge over natten ved 4 ° C på et rotator.
- Overføre løsningen til en kolonne og sentrifuge med maksimal hastighet ved romtemperatur for 5 min.
- Overføre til eluate til en ren 1,5 mL microcentrifuge tube. Legg til 1/10 volumet av 3 M NaOAc 0,5 μL coprecipitant og en lik mengde isopropanol. Ruge over natten på 20 ° C.
- 3 adapter hemorroider
- Utløse RNA pellets og vask med 75% etylalkohol som beskrevet i trinnene 2.4.4 til 2.4.5.
- Nytt avbryte RNA pellets 6,5 μL TDW og tilsett 1 μL av 10 μM 3 adapter.
- Overføre løsningen til et PCR-rør og ruge på 70 ° C i 2 minutter.
- Legg 1 μL 10 x ligation buffer, 0,5 μL RNase hemmer og 1 μL T4 RNA ligase 2. Ruge på 28 ° C i 1 time, 25 ° C for 6 h og 22 ° C 6t.
- Legge til 12 μL 2 x RNA lasting fargestoff og varme ved 95 ° C i 5 minutter.
- Gel rense 3' adapter samskrevet RNAs som beskrevet i 3.2.9 til 3.2.13.
- 5' adapter hemorroider
- Utløse RNA pellets og vask med 75% etylalkohol som beskrevet i trinnene 2.4.4 til 2.4.5.
- Nytt avbryte RNA pellets 4,2 μL TDW og tilsett 1 μL av 5 μM 5' adapter.
- Overføre løsningen til et PCR-rør og ruge på 70 ° C i 2 minutter.
- Legge til 0,8 μL 10 x ligase buffer, 0.4 μL RNase inhibitor, 0,8 μL 10 mM ATP, 0,8 μL T4 RNA ligase 1. Ruge på 28 ° C i 1 time, 25 ° C for 6 h og 22 ° C 6t.
- Omvendt transkripsjon og PCR forsterkning
- På 5' adapter tilsett samskrevet RNAs, 1 μL av 4 μM omvendt transkripsjon primer. Ruge på 70 ° C i 2 minutter og umiddelbart kule til 4 ° C.
- Legge til 4 μL 5 x FS buffer, 4 μL 2,5 dNTP, 1 μL 0.1 M DTT, 1 μL RNase hemmer og 1 μL revers transkriptase. Inkuber ved 50 ° C 1t og 70 ° C i 15 min.
- Forberede PCR forsterkning
- Mix 1 μL RT produkt, 1 μL 25 μM RPI primer, 1 μL 25 μM RP1 primer, 10 μL 5 x HF buffer, 4 μL 2,5 dNTP, 32,5 μL TDW og 0,5 μL Hi-Fi-utvalg.
- Kjøre PCR program for 11 ~ 13 sykluser.
Merk: Programmet for PCR er: 98 ° C for 30 s for en varm start, 98 ° C for 10 s, 60 ° C for 30 s og 72 ° C i 45 s for forsterkning og 72 ° C i 5 minutter. Forsterkning trinn gjentas for 11-13 sykluser.
- Rydd PCR produktene bruker 40 μL av magnetiske perler og følgende 3.1.3.1 til 3.1.3.6, men bruker 10 μL TDW for å elute DNA.
- Tilsett 2 μL 10 x DNA laste fargestoff. Laste inn prøven på en 6% akrylamid gel og kjøre 200 V i 30 min.
- Flekker med Sybr gull (0,01% (v/v) i 1 x TBE buffer) i 5 minutter ved romtemperatur.
- De flekken i 1 x TBE buffer for 5 min ved romtemperatur.
- Klipp gel ~ 200-700 nukleotid regionen og bryte gel.
- Legg til 700 μL 0,3 M NaCl og ruge over natten ved romtemperatur å elute DNA.
- Laste inn alt på en kolonne og sentrifuge med maksimal hastighet ved romtemperatur for 5 min.
- Overføre til eluate til en ren 1,5 mL microcentrifuge tube. Legg til 1/10 volumet av 3 M NaOAc 0,5 μL coprecipitant og en lik mengde isopropanol. Ruge over natten på 20 ° C.
- Utløse DNA pellets og vask med 75% etylalkohol som beskrevet i trinnene 2.4.4 til 2.4.5. Nytt avbryte 20 μL TDW.
- Analysere prøven ved hjelp av en sequencer.
4. analyse av PKR-samspill RNAs bruker qRT PCR
- Metode 1: Tilfeldig praktiske omvendt transkripsjon
- Nytt suspendere RNA pellets fra trinn 2.4.10 med 8,5 μL TDW og overføre løsningen til et PCR-rør.
- Legg til 0,5 μL 100 μM tilfeldig hexamers og 4 μL 2,5 dNTP blanding.
- Varme løsningen på 65 ° C for 5 min og umiddelbart ruge på is minst 1 min.
- Gjøre reaksjonen blanding: 4 μL 5 x SSIV buffer, 1 μL 100 mM DTT, 1 μL RNase Inhibitor, og 1 μL revers transkriptase (200 U/μL). Legge til reaksjonen blanding RNA løsningen.
- Inkuber blandingen ved 23 ° C i 10 min, 50 ° C i 10 min, og 80 ° C i 10 min.
- Analysere cDNA med en real-time PCR-system.
Merk: Programmet for sanntids PCR er: 95 ° C i 3 minutter for varmt start, 95 ° C i 5 s og 60 ° C for 10 s forsterkning og 95 ° C for 30 s, 65 ° C for 30 s og 95 ° C for 30 s smelte. Forsterkning trinn gjentas for 40 sykluser.
- Metode 2: Strand-spesifikke omvendt transkripsjon
- Forberede en master blanding av omvendt primere: blanding lik mengde genet bestemt omvendt transkripsjon primere med CMV promoter sekvens etterfulgt av ~ 20 nukleotider i bestemte gensekvenser.
Merk: Kombinert konsentrasjonen av alle genet bestemt RT primere er 4 μM. - Nytt suspendere RNA pellets fra trinn 2.4.10 med 8,5 μL TDW og overføre løsningen til et PCR-rør.
- Legg til 0,5 μL 4 μM master blanding av omvendt transkripsjon primere og 4 μL 2,5 dNTP blanding.
- Varme løsningen på 65 ° C for 5 min og umiddelbart ruge på is minst 1 min.
- Forberede reaksjon-løsning ved å blande 4 μL 5 x SSIV buffer, 1 μL 100 mM DTT, 1 μL RNase Inhibitor, og 1 μL revers transkriptase (200 U/μL). Legge reaksjon løsningen til RNA-primer mix.
- Inkuber løsningen ved 50 ° C for 10 min og 80 ° C i 10 min.
- Analysere cDNA ved hjelp av sanntids PCR-systemet.
Merk: Programmet for sanntids PCR er samme som beskrevet i metode 1.
- Forberede en master blanding av omvendt primere: blanding lik mengde genet bestemt omvendt transkripsjon primere med CMV promoter sekvens etterfulgt av ~ 20 nukleotider i bestemte gensekvenser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En skjematisk for prosessen å arrestere HeLa celler på S eller M fasen av cellen syklus er vist i figur 1. For en M fase-arrestert prøve, kan vi tydelig visualisere runde formet celler under microscope (figur 2A). For å undersøke effektiviteten av celle syklus arrestasjon, kan kjernefysiske innholdet i cellen analyseres ved hjelp av FACS (figur 2B). Figur 3 viser representant data for immunoprecipitation effektivitet testen, der D7F7 antistoffer viser en overlegen evne til å immunoprecipitate PKR. Denne forskjellen i immunoprecipitation effektivitet kan ha blitt reflektert i avviket i klassen fordelingen av høy gjennomstrømming sekvensering bibliotekene tilberedt med to forskjellige PKR antistoffer (Figur 4). Spesifisitet av antistoffer D7F7 blir ytterligere bekreftet hele blot vestlige analyse av PKR immunoprecipitate (figur 5A) og total-cellen lysate (figur 5B). Figur 6 viser radioisotop signalet før og etter fjerning av rRNAs under høy gjennomstrømming sekvensering biblioteket forberedelse. Figur 7 viser anriking av mtRNAs i RNAs co-immunoprecipitated med PKR, men ikke RNAs co-immunoprecipitated med kanin IgG eller DiGeorge syndrom chromosomal regionen 8 (DGCR8). Figur 8 viser den representative stranden bestemt qRT PCR analyse av PKR-bundet mtRNAs i S eller M-fase arrestert prøver.
Figur 1: skjematisk for forberedelse celle syklus arrestasjon prøvene. (A, B) Skjematisk om utarbeidelse av S (A) eller M (B) fase-arrestert HeLa celler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: analyse av cellen syklus arrestert prøver. (A) fase kontrast bilder av S eller M fase-arrestert prøver. Stolper angir 250 μm. (B) FACS analyse viser kjernefysiske innholdet i prøvene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Immunoprecipitation effektivitet test for PKR antistoffer. For vellykket berikelse av PKR-bundet RNAs, bør et antistoff med definitive immunoprecipitation effektivitet som D7F7 antistoffer brukes. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: RNA klasse distribusjon av sekvensering biblioteker tilberedt med ulike PKR antistoffer. Bruke forskjellige PKR antistoffer for fCLIP resulterte i en annen klasse distribusjon av tilordnede rekkefølgen. Avviket er sannsynligvis på grunn av forskjeller i immunoprecipitation effektivitet. Dette tallet er endret fra Kim et al.28. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: spesifisitet av antistoffer D7F7 PKR. (A, B) Hele blot vestlige analyse av PKR immunoprecipitated (A) eller totale HeLa lysate (B) viste eneste sterke band tilsvarer størrelsen på PKR, som angir at D7F7 antistoffer er svært spesifikke erkjenner PKR. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: radioisotop signalet for PKR co-immunoprecipitated RNAs. (A) PKR co-immunoprecipitated RNAs ble oppdaget ved merking 5' endene med r-ATP. (B) nedgangen i radioistope signalet ble observert på vellykket rRNA fjerning. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: validering av PKR-mtRNA vekselsvirkningene. Logg deg2 ganger anriking av mtRNAs RNAs co-immunoprecipitated med angitte antistoffer. Kun PKR co-immunoprecipitated RNA prøven viste sterke anriking av mtRNAs. Kanin IgG og DGCR8 antistoffer ble brukt som negative kontroller. Dette tallet er endret fra Kim et al.28. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8: Strand-qRT PCR analyser av PKR-bundet mtRNAs. (A, B) Strand-spesifikke omvendt transkripsjon ble brukt til å analysere strandedness av mtRNAs som var co-immunoprecipitated med PKR for S (A) eller M (B) fase-arrestert celler. Dette tallet er endret fra Kim et al.28. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Prosessen å forberede S eller M fase-arrestert prøver er illustrert i figur 1. For å arrestere celler på S fasen, brukte vi en thymidine dobbelt blokk metode der vi behandlet celler med thymidine to ganger med en 9 h utgivelse i mellom å sikre høy arrestasjonen effektivitet (figur 1A). M fase arrestasjon, vi behandlet celler når med thymidine etterfulgt av en 9 h utgivelse og deretter brukt nocodazole blokk cellene på prometaphase (figur 1B). Ettall nøkkel steg i forberede celle syklus prøven er utgivelsen skritt etter den første thymidine-blokken. Hvis du vil fjerne thymidine, er det avgjørende å vaske cellene minst to ganger med frisk PBS. Uriktig vask og gjenværende thymidine kan resultere i økt heterogenitet og redusert celle levedyktighet. Suksessen til M fase arrestasjonen kan bekreftes visuelt basert på økningen i antall rund-formet celler (figur 2A). M fasen utvalget inneholder imidlertid fortsatt mange interphase cellene basert på deres morfologi. For å samle bare M fasen arrestert celler, brukt vi fysisk makt koble M fase celler fra overflaten. Kjernefysisk innholdet høstet cellene var videre undersøkt ved hjelp av FACS, som viste en bred topp mellom 2n og 4n S fasen og en skarp peak på 4n for M fase-arrestert prøven (figur 2B). Presentert protokollen er optimalisert for HeLa celler, som har en dobling tid på ca 24 h. Ideen om dobbelt thymidine og thymidine-nocodazole blokk kan brukes på andre linjer, men nøyaktig narkotika behandling og slipp varighetene skal optimaliseres basert på dobling tidspunktet for målcellene.
Identifisere PKR-samspill RNAs, vi krysskoblet PKR-RNA komplekser med formaldehyd og beriket dem gjennom immunoprecipitation. En viktig faktor som bestemmer nøyaktigheten av den påfølgende analysen er effektiviteten av immunoprecipitation. Vi har testet mange antistoffer som målrette ulike epitopes av PKR protein for å bestemme antistoffer for høy gjennomstrømming sekvensering biblioteket utarbeidelse. Som vist i Figur 3, fant vi at D7F7 antistoffer som gjenkjenner koblingsfunksjonalitet området mellom dsRNA binding domener og katalytisk domenet viste overlegne evne til fange PKR. Andre antistoffer vises i Figur 3 (Milli) gjenkjenner regionen N-terminal, men viser en fattig evne i immunoprecipitating PKR. Følgelig inneholdt høy gjennomstrømming sekvensering biblioteket tilberedt med Milli antistoffer mange bakgrunn sekvensering leser som er spredt i genomet, spesielt i introns, uten tydelig ansamlinger på bestemte områder28 (Figur 4). Vi tror avvik i to sekvensering bibliotekene er hovedsakelig på grunn av forskjeller i antistoffer evner fange PKR under immunoprecipitation trinnet. Vi videre undersøkt spesifisitet av antistoffer D7F7 PKR gjennom hele blot vestlige analyser av immunoprecipitate (figur 5A) og total HeLa lysates (figur 5B). I begge blots observerte vi bare en sterk band som tilsvarer PKR. Dette indikerer at D7F7 antistoffer er svært spesifikke og at sekvensering dataene innhentet med D7F7 antistoffer sannsynligvis reflektere sant RNA interaktører av PKR.
En kritisk trinn under høy gjennomstrømming sekvensering biblioteket utarbeidelsen er fjerning av rRNAs. Siden vi krysskoblet RNA-RBP komplekser med formaldehyd brukte vi en ultrasonicator for komplett lysis av celler. Denne prosessen resulterte i fragmentering av rRNAs, som betydelig redusert effektiviteten av rRNA fjerning ved hjelp av rRNA fjerning Kit. Du løser dette problemet, vi først brukte rRNA fjerning Kit etterfulgt av rRNA uttømming Kit (se Tabell for materiale), som nesten helt fjernet rRNAs og mindre enn 1% av de totale sekvensering ble tilordnet rRNAs. Vi brukt disse to pakkene sekvensielt fordi rRNA uttømming Kit har en kapasitet på bare 1 μg mens rRNA fjerning Kit har en maksimal kapasitet på 5 μg. Vi har opplevd bruker mer enn det anbefalte beløpet av den totale resulterer i betydelig mengde sekvensering leser tilordnet rRNAs. Vellykket fjerning av rRNA kan bekreftes etter merking RNAs med r-ATP gjennom PNK reaksjonen. Mens rRNA utarmet RNAs viste en distinkt band rundt 150 nt, prøven før rRNA fjerning viser sterk signalet i hele regionen tilsvarer 50 ~ 300 nt (figur 6).
En begrensning av formaldehyd crosslinking er nedgang immunoprecipitation effektivitet. Andre programmer av formaldehyd crosslinking som immunocytochemistry bruker vanligvis 4% paraformaldehyde løsning for fiksering. Men kan ikke slik sterk fiksering tilstand brukes for fCLIP eksperimentet fordi det reduserer betydelig immunoprecipitation effektivitet, som resulterer i høyere bakgrunn. Videre formaldehyd fiksering krysskoblinger protein-protein komplekser i tillegg til protein-RNA komplekser. Derfor må man betale forsiktig i tolkningen av fCLIP dataene.
Som rapportert tidligere, danner mtRNAs intermolekylære dsRNAs som gjenkjennes av PKR28. Vi først bekreftet vår sekvensering data ved å undersøke PKR-mtRNA vekselsvirkningene gjennom qRT PCR. Vi brukte kanin IgG og DGCR8 antistoffer som negative kontroller, som ikke viser noen anriking av mtRNAs (figur 7). Av notatet, ble DGCR8 brukt som et kjernefysisk dsRNA binding protein som er fysisk atskilt fra mtRNAs. Samtidig viste PKR co-immunoprecipitated RNAs sterke anriking av mtRNAs (figur 7).
For ytterligere analyse PKR-mtRNA vekselsvirkningene, utført vi strand-spesifikke omvendt transkripsjon for å skille den tunge-strand mtRNAs fra lys-strand mtRNAs (Figur 8). Vi har utformet omvendt transkripsjon primere som har en CMV promoter sekvens etterfulgt av en gen-spesifikk rekkefølge og deretter brukt en CMV promoter sekvens som venstre primer og gen-spesifikke riktig primer for qPCR analyse. Vi har også testet SP6 arrangøren og pGEX sekvensering primer sekvenser i stedet for CMV promoter sekvensen. Vi fant at mens CMV arrangøren og pGEX sekvensering primer sekvenser viste gode resultater, bruker SP6 promoter sekvensen ikke. Forskjellen skyldes lav GC innholdet i SP6 promoter sekvensen (~ 33%) sammenlignet med de av CMV arrangøren (~ 67%) og pGEX primer (~ 65%) sekvenser. Den foreslåtte ordningen for strand-spesifikke omvendt transkripsjon kan lett brukes på andre intermolekylære dsRNAs, men når du utformer omvendt transkripsjon primerne, GC innholdet må tas i betraktning.
Samlet viste vi utarbeidelsen av cellen syklus arrestert prøver og anriking av PKR-samspill RNAs gjennom formaldehyd crosslinking og immunoprecipitation. Bruker en svært effektiv D7F7 antistoff, har vi isolert PKR-bundet RNAs og identifisert disse RNAs ved å generere og analysere en høy gjennomstrømming sekvensering bibliotek. Videre for å analysere strandedness av mtRNAs bundet til PKR, presenterte vi en strand-spesifikke omvendt transkripsjon tilnærming. Vi forventer at presentert protokollen kan enkelt optimaliseres RNA interaktører av andre dsRBPs og strandedness av intermolekylære dsRNAs som dannes via komplementære samspillet mellom fornuft og antisense utskrifter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av grunnleggende Science Research Program gjennom National Research Foundation av Korea (NRF) finansiert av koreanske regjeringen departementet for vitenskap og IKT (NRF-2016R1C1B2009886).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9260G | |
| 1 M Tris, pH 7.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9855G | |
| 1 M Tris, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | AM9855G | |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-175-C | |
| 10% Nonidet-p40 (NP-40) | Biosolution | BN015 | |
| 10X DNA loading buffer | TaKaRa | 9157 | |
| 15 mL conical tube | SPL | 50015 | |
| 3' adaptor | 5'-rApp NN NNT GGA ATT CTC GGG TGC CAA GG/3ddC/-3' | ||
| 3 M Sodium Acetate pH 5.5 | Thermo Fisher Scientific | AM9740 | |
| 5' adaptor | 5'-GUU CAG AGU UCU ACA GUC CGA CGA UCN NNN-3' | ||
| 5 M NaCl | Thermo Fisher Scientific | AM9760G | |
| 50 mL conical tube | SPL | 50050 | |
| Acid-phenol chloroform, pH 4.5 | Thermo Fisher Scientific | AM9722 | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic beads DNA/RNA clean up |
| Antarctic alkaline phosphatase | New England Biolabs | M0289S | |
| Anti-DGCR8 | Made in house | ||
| Anti-PKR (D7F7) | Cell signaling technology | 12297S | |
| Anti-PKR (Milli) | Millipore EMD | 07-151 | |
| ATP (100 mM) | GE Healthcare | GE27-2056-01 | |
| Bromophenol blue sodium salt | Sigma-aldrich | B5525 | |
| Calf intestinal alkaline phosphatase | TaKaRa | 2250A | |
| Cell scraper 25 cm 2-position | Sarstedt | 83.183 | |
| CMV promoter sequence | 5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3' | ||
| Dulbecco's modified eagle medium | Welgene | LM001-05 | |
| dNTP mixture (2.5 mM) | TaKaRa | 4030 | |
| Ethanol, Absolute, ACS Grade | Alfa-Aesar | A9951 | |
| Fetal bovine serum | Merck | M-TMS-013-BKR | |
| Formamide | Merck | 104008 | |
| Glycine | Bio-basic | GB0235 | |
| GlycoBlue coprecipitant (15 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | AM9516 | |
| Isopropanol | Merck | 8.18766.1000 | |
| NEBNext rRNA Depletion Kit | New England Biolabs | E6318 | rRNA Depletion Kit |
| Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404 | |
| Normal rabbit IgG | Cell signaling technology | 2729S | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 6148 | |
| PCR forward primer (RP1) | 5'-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GCG ATC TAC ACG TTC AGA GTT CTA CAG TCC GA-3' | ||
| PCR index reverse primer (RPI) | 5'-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT NNN NNN GTG ACT GGA GTT CCT TGG CAC CCG AGA ATT CCA-3' | ||
| PCR tubes with flat cap, 0.2 mL | Axygen | PCR-02-C | |
| Phosphate bufered saline (PBS) Tablet | TaKaRa | T9181 | |
| Phusion high-fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530 | High-fidelity polymerase |
| PlateFuge microcentrifuge with swing-out rotor | Benchmark | c2000 | |
| Polynucleotide kinase (PNK) | TaKaRa | 2021A | |
| Proteinase K, recombinant, PCR Grade | Sigma-Aldrich | 3115879001 | |
| qPCR primer sequence: CO1 Heavy | Forward/Reverse: 5′-GCCATAACCCAATACCAAACG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO1 Light | Forward/Reverse: 5′-TTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO2 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO2 Light | Forward/Reverse: 5′-GTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO3 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CO3 Light | Forward/Reverse: 5′-CTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CYTB Heavy | Forward/Reverse: 5′-CAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: CYTB Light | Forward/Reverse: 5′-GGATAGTAATAGGGCAAGGACG -3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: GAPDH | Forward/Reverse: 5′-CAACGACCACTTTGTCAAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND1 Heavy | Forward/Reverse: 5′-TCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND1 Light | Forward/Reverse: 5′-GTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND4 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CTCACACTCATTCTCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND4 Light | Forward/Reverse: 5′-TGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND5 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CTAGGCCTTCTTACGAGCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND5 Light | Forward/Reverse: 5′-TAGGGAGAGCTGGGTTGTTT-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND6 Heavy | Forward/Reverse: 5′-TCATACTCTTTCACCCACAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| qPCR primer sequence: ND6 Light | Forward/Reverse: 5′-TGCTGTGGGTGAAAGAGTATG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| Random hexamer | Thermo Fisher Scientific | SO142 | |
| Recombinant Dnase I (Rnase-free) (5 U/μL) | TaKaRa | 2270A | |
| Recombinant Rnase inhibitor (40 U/μL) | TaKaRa | 2313A | |
| Ribo-Zero rRNA Removal Kit | Illumina | MRZH116 | rRNA Removal Kit |
| Rotator | FINEPCR, ROTATOR AG | D1.5-32 | |
| RT primer sequence: CO1 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′ | ||
| RT primer sequence: CO1 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGCCATAACCCAATACCAAACG-3′ | ||
| RT primer sequence: CO2 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′ | ||
| RT primer sequence: CO2 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′ | ||
| RT primer sequence: CO3 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′ | ||
| RT primer sequence: CO3 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′ | ||
| RT primer sequence: CYTB Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGATAGTAATAGGGCAAGGACG-3′ | ||
| RT primer sequence: CYTB Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′ | ||
| RT primer sequence: GAPDH | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGAGCGATGTGGCTCGGCT-3′ | ||
| RT primer sequence: ND1 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND1 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND4 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND4 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTCACACTCATTCTCAACCC-3′ | ||
| RT primer sequence: ND5 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTTGGGTTGAGGTGATGATG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND5 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCATTGTCGCATCCACCTTTA-3′ | ||
| RT primer sequence: ND6 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGTTGAGGTCTTGGTGAGTG-3′ | ||
| RT primer sequence: ND6 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCCATAATCATACAAAGCCCC-3′ | ||
| Siliconized polypropylene 1.5 mL G-tube | Bio Plas | 4167SLS50 | |
| Sodium dedecyl sulfate | Biosesang | S1010 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| SUPERase In Rnase inhibitor | Thermo Fisher Scientific | AM2694 | |
| SuperScript III reverse transcriptase | Thermo Fisher Scientific | 18080093 | Reverse transcriptase for library preparation |
| SuperScript IV reverse transcriptase | Thermo Fisher Scientific | 18090010 | Reverse transcriptase for qRT-PCR |
| SYBR gold nucleic acid gl stain | Thermo Fisher Scientific | S11494 | |
| T4 polynucleotide kinase | New England Biolabs | M0201S | |
| T4 RNA ligase 1 (ssRNA Ligase) | New England Biolabs | M0204 | |
| T4 RNA ligase 2, truncated KQ | New England Biolabs | M0373 | |
| Thermomixer | Eppendorf ThermoMixer C with ThermoTop | ||
| Thymidine | Sigma-Aldrich | T9250 | |
| Tris-borate-EDTA buffer (TBE) | TaKara | T9122 | |
| Triton X-100 | Promega | H5142 | |
| Ultralink Protein A sepharose beads | Thermo Fisher Scientific | 22810 | Protein A beads |
| Ultrasonicator | Bioruptor | ||
| Urea | Bio-basic | UB0148 | |
| Vortex mixer | DAIHAN Scientific | VM-10 | |
| Xylene cyanol | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| γ-32P-ATP (10 μCi/μL, 3.3 μM) | PerkinElmer | BLU502A100UC |
References
- Meurs, E. F., et al. Constitutive expression of human double-stranded RNA-activated p68 kinase in murine cells mediates phosphorylation of eukaryotic initiation factor 2 and partial resistance to encephalomyocarditis virus growth. Journal of Virology. 66 (10), 5805-5814 (1992).
- Patel, R. C., Stanton, P., McMillan, N. M., Williams, B. R., Sen, G. C. The interferon-inducible double-stranded RNA-activated protein kinase self-associates in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (18), 8283-8287 (1995).
- Bennett, R. L., Pan, Y., Christian, J., Hui, T., May, W. S. The RAX/PACT-PKR stress response pathway promotes p53 sumoylation and activation, leading to G(1) arrest. Cell Cycle. 11 (1), 407-417 (2012).
- Yang, X., Nath, A., Opperman, M. J., Chan, C. The double-stranded RNA-dependent protein kinase differentially regulates insulin receptor substrates 1 and 2 in HepG2 cells. Molecular and Cellular Biology. 21 (19), 3449-3458 (2010).
- Zamanian-Daryoush, M., Mogensen, T. H., DiDonato, J. A., Williams, B. R. G. NF-kappa B Activation by Double-Stranded-RNA-Activated Protein Kinase (PKR) Is Mediated through NF-kappa B-Inducing Kinase and Ikappa B Kinase. Molecular and Cellular Biology. 20 (4), 1278-1290 (2000).
- Takada, Y., Ichikawa, H., Pataer, A., Swisher, S., Aggarwal, B. B. Genetic deletion of PKR abrogates TNF-induced activation of IkappaBalpha kinase. JNK, Akt and cell proliferation but potentiates p44/p42 MAPK and p38 MAPK activation. Oncogene. 26 (8), 1201-1212 (2007).
- Dabo, S., Meurs, E. F. dsRNA-dependent protein kinase PKR and its role in stress, signaling and HCV infection. Viruses. 4 (11), 2598-2635 (2012).
- Black, T. L., Safer, B., Hovanessian, A., Katze, M. G. The Cellular 68,000-Mr Protein-Kinase Is Highly Autophosphorylated and Activated yet Significantly Degraded during Poliovirus Infection - Implications for Translational Regulation. Journal of Virology. 63 (5), 2244-2251 (1989).
- Bando, Y., et al. Double-strand RNA dependent protein kinase (PKR) is involved in the extrastriatal degeneration in Parkinson's disease and Huntington's disease. Neurochemistry International. 46 (1), 11-18 (2005).
- Onuki, R., et al. An RNA-dependent protein kinase is involved in tunicamycin-induced apoptosis and Alzheimer's disease. The EMBO Journal. 23 (4), 959-968 (2004).
- Peel, A. Activation of the cell stress kinase PKR in Alzheimer's disease and human amyloid precursor protein transgenic mice. Neurobiology of Disease. 14 (1), 52-62 (2003).
- Peel, A. L. Double-stranded RNA-dependent protein kinase, PKR, binds preferentially to Huntington's disease (HD) transcripts and is activated in HD tissue. Human Molecular Genetics. 10 (15), 1531-1538 (2001).
- Suen, K. C., Yu, M. S., So, K. F., Chang, R. C., Hugon, J. Upstream signaling pathways leading to the activation of double-stranded RNA-dependent serine/threonine protein kinase in beta-amyloid peptide neurotoxicity. Journal of biological chemistry. 278 (50), 49819-49827 (2003).
- Nakamura, T., et al. A critical role for PKR complexes with TRBP in Immunometabolic regulation and eIF2alpha phosphorylation in obesity. Cell Reports. 11 (2), 295-307 (2015).
- Saito, S. Enhancement of the interferon-induced double-stranded RNA-dependent protein kinase activity by Sindbis virus infection and heat-shock stress. Microbiology and Immunology. 34 (10), 859-870 (1990).
- Youssef, O. A., et al. Potential role for snoRNAs in PKR activation during metabolic stress. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (16), 5023-5028 (2015).
- Murtha-Riel, P., Davies, M. V., Choi, S. Y., Hershey, J. W., Kaufman, R. J. Expression of a Phosphorylation-resistant Eukaryotic Initiation Factor 2 a-Subunit Mitigates Heat Shock Inhibition of Protein Synthesis. The Journal of Biological Chemistry. 268, 12946-12951 (1993).
- Benkirane, M., et al. Oncogenic potential of TAR RNA binding protein TRBP and its regulatory interaction with RNA-dependent protein kinase PKR. The EMBO Journal. 16 (3), 611-624 (1997).
- Koromilas, A., Roy, S., Barber, G., Katze, M., Sonenberg, N. Malignant transformation by a mutant of the IFN-inducible dsRNA-dependent protein kinase. Science. 257 (5077), 1685-1689 (1992).
- Kim, Y., et al. PKR is activated by cellular dsRNAs during mitosis and acts as a mitotic regulator. Genes & Development. 28 (12), 1310-1322 (2014).
- Kim, Y., et al. Deletion of human tarbp2 reveals cellular microRNA targets and cell-cycle function of TRBP. Cell Reports. 9 (3), 1061-1074 (2014).
- Zhu, P. J., et al. Suppression of PKR promotes network excitability and enhanced cognition by interferon-gamma-mediated disinhibition. Cell. 147 (6), 1384-1396 (2011).
- Dagon, Y., et al. Double-stranded RNA-dependent protein kinase, PKR, down-regulates CDC2/cyclin B1 and induces apoptosis in non-transformed but not in v-mos transformed cells. Oncogene. 20 (56), 8045-8056 (2001).
- Elbarbary, R. A., Li, W., Tian, B., Maquat, L. E. STAU1 binding 3' UTR IRAlus complements nuclear retention to protect cells from PKR-mediated translational shutdown. Genes & Development. 27 (13), 1495-1510 (2013).
- Cho, J., et al. LIN28A is a suppressor of ER-associated translation in embryonic stem cells. Cell. 151 (4), 765-777 (2012).
- Licatalosi, D. D., et al. HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing. Nature. 456 (7221), 464-469 (2008).
- Van Nostrand, E. L., et al. Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP). Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).
- Kim, Y., et al. PKR Senses Nuclear and Mitochondrial Signals by Interacting with Endogenous Double-Stranded RNAs. Molecular Cell. 71 (6), 1051-1063 (2018).
- Kim, B., Jeong, K., Kim, V. N. Genome-wide Mapping of DROSHA Cleavage Sites on Primary MicroRNAs and Noncanonical Substrates. Molecular Cell. 66 (2), 258-269 (2017).
- Ricci, E. P., et al. Staufen1 senses overall transcript secondary structure to regulate translation. Nature Structural & Molecular Biology. 21 (1), 26-35 (2014).
- Kim, B., Kim, V. N. fCLIP-seq for transcriptomic footprinting of dsRNA-binding proteins: Lessons from DROSHA. Methods. , (2018).
- Dhir, A., et al. Mitochondrial double-stranded RNA triggers antiviral signalling in humans. Nature. 560 (7717), 238-242 (2018).
